专利名称：用于快速检测金黄色葡萄球菌的试剂及其方法
技术领域：
本发明涉及食品微生物安全监测领域，具体地说，涉及用于快速检测金黄色葡萄球菌的 试剂及其检测方法。
背景技术：
食品是人类赖以生存的物质基础，食品安全是关系人类健康和社会发展的重大问题。近 年来，国内外食品安全的恶性事件不断发生，其中食源性致病菌是食品安全事故的重要原因。 食源性致病菌是指以食物为载体，导致人类发生疾病的一大类细菌。全世界每年约有220万 人因食源性致病菌而丧生，而且食源性疾病常常是发展中国家导致人非正常死亡的主要原因。 因此，食源性致病菌的控制已成为国内外普遍关心的问题。
金黄色葡萄球菌(及印&/0""附m/re朋，以下简称"金葡菌")为常见的革兰氏阳性球菌， 分布极为广泛，可以附着于尘埃、物体表面、皮肤、粘膜等等，容易通过空气和接触传播， 并且有较强的抗逆性。金葡菌致病力强，由它产生的耐热肠毒素引起的食物中毒时有发生， 其危害仅次于沙门氏菌和副溶血弧菌。同时金葡菌也是引起人类感染最常见的病原菌之一， 而且近年临床分离的金葡菌几乎都为难以抑制的耐药株，因此金葡菌感染已与肝炎、爱滋病 一起并称为世界上三大难治传染性顽症。所以对食品、药品和卫生用品中金葡菌的检验以及 临床金葡菌的准确诊断是保证人类健康的必要手段；大部分国家对食品、医疗用品等的金葡 菌指标都有严格规定。
有效控制金葡菌需要准确及时的检测手段。目前国标法检测金葡菌需要接种Baird — Parker平板，培养后挑取可疑菌落接种血平板，对溶血的菌落再进行包括革兰氏染色、镜检 以及凝固酶试验等的确认试验。此方法检验总时间大约需要52h或以上，而且确认试验通常 需要大量的时间、精力和费用，特别是检测大通量和杂菌污染较为严重的样品时，此缺点更 为突出。
显色培养基是对传统检测手段的一个突破，它利用显色底物检测目标微生物的特征性 酶，使目标微生物菌落显出特定的颜色，而干扰菌被抑制，或不产生特征性酶而不显色，因 而能被区别。当显色培养基上生长菌落之后只要通过简单的菌落颜色形态观察或简单试验就 可以进行鉴别。
显色培养基与传统培养基相比有巨大的优势。首先它具有较高的灵敏度，在培养之前不需要增菌；而且由于其特异性较高，假阳性机率比传统的培养基低，因而能大大减少确认试 验的量，节省大量人力、财力和时间；而且检测者不需要太多的专业知识，只要有基本的微 生物操作技术和辨色能力就可进行检测。第二，在挑取传统培养基上的疑似菌落进行确认试 验过程中，可能受到杂菌菌落的形态和数量、检测者经验和因费用不足确认试验数量被限制， 疑似菌落不能被全检等等不稳定因素的影响，使检测结果存在假阴性的风险。显色培养基对 生长的菌落都已完成特征性酶的测试，能大大减少以上因素造成误差的机会，提高检测的准 确率。第三，传统培养基一般采用选择性培养后再进行平板检测，只能进行定性的检测。而 使用显色培养基能够直接通过计数平板上阳性菌落而对样品中金葡菌的数量进行定量检测。 金葡菌的定量检测对食品在生产、保存和运输过程的安全性评估和其含有金葡菌耐热肠毒素 的风险评估都有重要意义。
目前法国CHROMager公司、BioMerieux公司、美国3M公司已开发出金葡菌显色培养 基，但这些进口显色培养基价格昂贵，购买不便，导致检测成本高，国内一般基层单位和企 业很少采用。
发明内容
本发明的目的在于针对传统方法的不足，提供一种特异性高、检测周期短、检测成本低、 可操作性强，适用于检测大通量样品的金黄色葡萄球菌的试剂及其检测方法。 为实现上述目的，本发明采用了以下技术方案 用于快速检测金黄色葡萄球菌的试剂，所述试剂包括
1) PEN培养基
所述PEN培养基由PEN基础培养基和PEN增补剂组成；
所述PEN基础培养基由以下组分组成牛肉浸粉l 5g/L、胰蛋白胨5 10g/L、大豆 蛋白胨5 10g/L、丙酮酸钠3 7g/L、氯化钠3 10g/L、琼脂15g/L;
所述PEN增补剂由以下组分组成多黏菌素B 15 30mg、奈啶酮酸5 15mg、 50wt% 卵黄-生理盐水溶液10 20mL，冻干血浆25 40g，无菌去离子水25 40mL;
2) TCF显色片
所述TCF显色片是将直径略小于培养皿的无菌滤纸片置于煮沸稍冷却后的TCF显色 液中，均匀染色后在无菌条件下晾干而得；所述TCF显色液由以下组分组成0.115%氯 化钙溶液0.115%氯化钙溶液15 30mL、TrisBase2 8g、NaC10.5 15g、甲苯氨蓝0.5 5g、 DNAl 6g、 95%乙醇200 400mL、去离子水400 600mL。本发明快速检测金黄色葡萄球菌的方法，检测步骤如下-
A. 制备PEN培养基平板
每lOOOmL去离子水中加入PEN基础培养基，混匀灭菌后冷却至45 50°C时，加入 PEN增补剂混匀，倒平板，备用；
B. 准备检样液
取待检样品和无菌生理盐水摇匀，制备到含待检样品体积百分比8 — 12%的检样液， 或制备到含待检样品质量百分比8_12%的检样液；
C. 接种培养
将0.05 0.2mL检样液涂布到歩骤A所述的培养基平板上，35±2°。培养18 22h;
D. 热处理
将步骤C培养后培养基上出现菌落的平板置于62土2。C培养箱l 1.5h;
E. TCF显色片显色
打开培养基平板盖子，把TCF显色片贴于培养基表面，避免气泡产生，盖上盖子， 35土2。C培养10 15min后揭下TCF显色片置于另一洁净的培养基平板内，35土2。C再培 养30 60min后观察显色片的颜色变化。
优选地，所述步骤C接种培养前包括增菌歩骤将5ml检样液接种于50ml含 7.5wt%NaCl的肉汤中，35士2'C培养6 24h后得到增菌液；将0.05mL增菌液涂布到歩骤 A所述的培养基平板上，35士2。C培养18 22h。
本发明针对现有技术中的不足，从生物化学的角度出发，利用细菌特异性酶对其进行 快速检测，在金黄色葡萄球菌特异性生化反应的基础上，筛选出其特异性酶——热稳定 DNA酶，然后通过金黄色葡萄球菌选择培养基培养金黄色葡萄球菌，并增强其热稳定DNA 酶的产生；用TCF显色片，对热稳定DNA酶进行检测，通过TCF的显色对菌落进行鉴 定，建立特异性显色生化检测方法。
本发明用于大通量样品的金黄色葡萄球菌的准确快速诊断和监控，特异性高、检测周 期短、检测成本低、可操作性强，可大大节省检测成本和时间，可以广泛推广应用到食品 卫生、环境监测等领域，具有广泛的使用前景。
具体实施例方式
以下通过具体实施例来说明本发明。 实施例1:本发明快速检测金黄色葡萄球菌试剂特异性的验证包括以下步骤
A. 制备PEN培养基平板 每1000mL去离子水中加入PEN基础培养基(牛肉浸粉lg、胰蛋白胨7.5g、大豆蛋白
胨7.5g、丙酮酸钠3g、氯化钠3g和琼脂15g)，搅拌均匀后12rC灭菌15min备用。
制备平板前加热溶解，待冷却至45 5(TC时，加入PEN增补剂(多黏菌素B15mg、 奈啶酮酸10mg、 50wt。/。鸡蛋的蛋黄-生理盐水溶液10mL，冻干血浆25g，无菌去离子水 25mL)混匀，倒平板，备用。
B. 制备TCF显色片
配制TCF显色液0.115%氯化钙溶液15mL、 TrisBase 2g、 NaCl 15g、甲苯氨蓝0.5g、 DNA1.5g、 95%乙醇200mL和去离子水600mL，混匀煮沸，稍冷却后将直径稍小于培养 皿的无菌滤纸片置于煮沸后的TCF显色液中，均匀染色后在无菌条件下晾干，备用；
C. 接种培养
把金黄色葡萄球菌(ATCC6538)、普通变形杆菌(CMCC49027)、蜡样芽孢杆菌 (CMCC63303)、绿脓杆菌(ATCC卯27)、粪链球菌(ATCC29212)、地衣芽孢杆菌 (ATCC14580)、大肠杆菌(ATCC25922)、白色葡萄球菌(8032)、粘质沙雷氏菌(ATCC
14041)和巨大芽孢杆菌(ATCC14581)接种到NA(营养琼脂培养基)上，37。C活化培养
24h，再将以上菌种分别划线接种于PEN上，37。C培养22h。
D. 热处理，显色
将步骤C培养后培养基上出现菌落的平板置于62'C培养箱lh;打开培养基平板盖子， 把TCF显色片贴于培养基表面，避免气泡产生，盖上盖子，37。C培养15min后揭下TCF 显色片置于另一洁净的培养基平板内，37'C再培养30min。
E. 结果与分析
TCF显色片中出现粉红色的晕圈即表明样品中存在金黄色葡萄球菌。 从表l可以看出，金黄色葡萄球菌在PEN上生长良好，并在TCF显色片上明显显色； 绿脓杆菌、粪链球菌、大肠杆菌、白色葡萄球菌、粘质沙雷氏菌和巨大芽孢杆菌能在PEN 上生长，但不扩散生长，不能在TCF显色片上显色，而普通变形杆菌、蜡样芽孢杆菌和 地衣芽孢杆菌既不能在PEN上不生长，也不在TCF显色片上显色，因此只有金黄色葡萄 球菌在TCF显色片上显色。表明本发明快速检测金黄色葡萄球菌试剂具有较高的特异性。
表l测试菌在PEN上生长和TCF上的显色情况
7测试菌PEN上生长TCF上显色测试菌PEN上生长 TCF上显色
金黄色葡萄球菌+ +地衣芽孢杆菌- -
普通变形杆菌- -大肠杆菌+ -
蜡样芽孢杆菌- -白色葡萄球菌+ 隱
绿脓杆菌+ -粘质沙雷氏菌+ 國
粪链球菌巨大芽孢杆菌+ -
注+:阳性；-:阴性。
实施例2:本发明快速检测金黄色葡萄球菌试剂最低检出限验证
包括以下步骤
A. 制备PEN培养基平板
每lOOOmL去离子水中加入PEN基础培养基(牛肉浸粉5g、胰蛋白胨6g、大豆蛋白 胨9g、丙酮酸钠7g、氯化钠10g和琼脂15g),搅拌均匀后12rC灭菌15min备用。
制备平板前加热溶解，待冷却至45 50'C时，加入PEN增补剂(多黏菌素B30mg、 奈啶酮酸15mg、 50wt。/。鸡蛋的蛋黄-生理盐水溶液20mL，冻干血浆40g，无菌去离子水 40mL)混匀，倒平板，备用。
B. 制备TCF显色片
配制TCF显色液0.115%氯化钙溶液20mL、 TrisBase 8g、 NaCl lg、甲苯氨蓝5g、 DNA6g、 95%乙醇300mL和去离子水500mL，混匀煮沸，稍冷却后将直径稍小于培养皿 的无菌滤纸片置于煮沸后的TCF显色液中，均匀染色后在无菌条件下晾干，备用；
C. 准备检样液，接种培养
用生理盐水稀释金黄色葡萄球菌ATCC 6538菌液到不同浓度，将0.2mL稀释菌液涂 布到PEN平板上；37。C培养20h。
D. 热处理，显色，方法同实施例1步骤D。
E. 结果与分析
TCF显色片中出现粉红色的晕圈即表明样品中存在金黄色葡萄球菌。 表2结果表明PEN-TCF的最低检出限均为8.3 CFU/mL(检测0.2 mL菌液)。
表2PEN-TCF最低检出限
金葡菌菌液浓度 8.3xl03 8.3x102 8.3xl01 8.3 8.3xl(T1 8Jxl(T2
8(CFU/mL)
PEN-TCF + + + + _ -
注.-表中"+"表示检出金黄色葡萄球菌，"-"表示未检出。
实施例3:本发明快速检测金黄色葡萄球菌试剂与国外同类产品显色培养基A和B对人工污 染食品的检测效果比较 包括以下步骤
A. 制备PEN培养基平板 每1000mL去离子水中加入PEN基础培养基(牛肉浸粉2.5g、胰蛋白胨7g、大豆蛋白
胨5g、丙酮酸钠5g、氯化钠7g和琼脂15g)，搅拌均匀后2rC灭菌15min备用。
制备平板前加热溶解，待冷却至45 50"C时，加入PEN增补剂(多黏菌素B20mg、 奈啶酮酸5mg、 50wt。/。鸡蛋的蛋黄-生理盐水溶液15mL，冻干血浆30g，无菌去离子水 30mL)混匀，倒平板，备用
B. 制备TCF显色片
配制TCF显色液0.115%氯化钙溶液30mL、 TrisBase 5g、 NaCl 8g、甲苯氨蓝2.5g、 DNA 3g、 95%乙醇400mL和去离子水400mL，混匀煮沸，稍冷却后将直径稍小于培养 皿的无菌滤纸片置于煮沸后的TCF显色液中，均匀染色后在无菌条件下晾干，备用；
C. 制备菌液
分别挑取金黄色葡萄球菌菌株ATCC6538和CMCC26003的新鲜菌苔制成菌悬液，以 生理盐水稀释至7.5xl04CFU/mL，等体积混合后作为污染菌液。
D. 样品处理
用巧克力蛋糕、冷冻饺子、凉拌菜、豆腐和油豆腐作为检测样品，购回后马上无菌 条件下切碎成约0.2cm3的碎片。以2mL步骤C菌液污染25g样品并搅拌混匀，室温(约 18'C)放置10分钟，备用。
E. 准备检样液
取步骤D中25g样品与225ml无菌生理盐水，摇匀成检样液。
F. 接种培养
取0.2mL检样液涂布到PEN和显色培养基A和B平板上(A购自科玛嘉公司，B购自 3M公司)，37'C培养24h;每种样品每种培养基均做2个重复。取2 mL步骤C菌液加入
9248 mL生理盐水中混匀，吸取0.2mL涂布NA， 37'C培养24h,作为阳性对照，设置 两个重复。
G. 热处理，显色，方法同实施例1步骤D。
H. 计数
TCF显色片中出现粉红色的晕圈即表明样品中存在金黄色葡萄球菌。参照显色培养 基A和B的说明书计数。
I. 确认试验
随机挑取每个显色培养基上的20个阳性菌落进行革兰氏染色和镜检，若不是G+球菌 则判断为假阳性；若是，则转接肉汤培养后进行血浆凝固酶试验，若为阴性，则判断为假 阳性；若为阳性，则判断为金黄色葡萄球菌。 J.结果与分析
在检测人工污染食品的比对中，显色培养基A对金黄色葡萄球菌的回收率最好，PEN 次之，显色培养基B较差，见表3。显色培养基B和PEN特异性较好，而显色培养基A 显色底物所针对的酶特异性稍低，见表4。
表3不同培养基检测人工污染食品的回收率
培养基 巧克力蛋糕饺子凉拌菜豆腐油豆腐平均回收率(％)
PEN 13095901029673.4
显色培养基A 12813214010710287.7
显色培养基B 847380807656.5
注表中为3种培养基检出的阳性菌落数平均值(CFU/皿)，阳性对照=139CFU/皿
表4不同培养基检测人工污染食品的特异性比较
培养基巧克力蛋糕饺子凉拌菜豆腐油豆腐
PEN00000
显色培养基A0020
显色培养基B00000
注表中列出的是确认试验中分离到的假阳性菌落数。
权利要求
1. 用于快速检测金黄色葡萄球菌的试剂，其特征在于所述试剂包括1)PEN培养基所述PEN培养基由PEN基础培养基和PEN增补剂组成；所述PEN基础培养基由以下组分组成牛肉浸粉1～5g/L、胰蛋白胨5～10g/L、大豆蛋白胨5～10g/L、丙酮酸钠3～7g/L、氯化钠3～10g/L、琼脂15g/L；所述PEN增补剂由以下组分组成多黏菌素B15～30mg、奈啶酮酸5～15mg、50wt％卵黄-生理盐水溶液10～20mL，冻干血浆25～40g，无菌去离子水25～40mL；2)TCF显色片所述TCF显色片是将直径略小于培养皿的无菌滤纸片置于煮沸稍冷却后的TCF显色液中，均匀染色后在无菌条件下晾干而得；所述TCF显色液由以下组分组成0.115％氯化钙溶液15～30mL、TrisBase 2～8g、NaCl 0.5～15g、甲苯氨蓝0.5～5g、DNA 1～6g、95％乙醇200～400mL、去离子水400～600mL。
2. —种用于快速检测金黄色葡萄球菌的方法，其特征在于使用权利要求1所述的试剂，包 括以下步骤A. 制备PEN培养基平板每lOOOmL去离子水中加入PEN基础培养基，混匀灭菌后冷却至45 50°C时，加入 PEN增补剂混匀，倒平板，备用；B. 准备检样液取待检样品和无菌生理盐水摇匀，制备到含待检样品体积百分比8 — 12%的检样液， 或制备到含待检样品质量百分比8_12%的检样液；C. 接种培养将0.05~0.2mL检样液涂布到步骤A所述的培养基平板上，35土2'C培养18 22h;D. 热处理将步骤C培养后培养基上出现菌落的平板置于62士2'C培养箱l~1.5h;E. TCF显色片显色打开培养基平板盖子，把TCF显色片贴于培养基表面，避免气泡产生，盖上盖子，35 土2。C培养10~15min后揭下TCF显色片置于另一洁净的培养基平板内，35土2'C再培养 30 60min后观察显色片的颜色变化，若出现粉红色的暈圈即表明待检样品中存在金黄色 葡萄球菌。
3. 根据权利要求2所述的快速检测金黄色葡萄球菌的方法，其特征在于所述步骤C接种培养前包括增菌步骤将检样液接种于含7.5wt%NaCl的肉汤中，37'C培养6 24h后得 到增菌液。
4.根据权利要求3所述的快速检测金黄色葡萄球菌的方法，其特征在于所述步骤C为将 Q.05mL增菌液涂布到步骤A所述的培养基平板上，35士2'C培养18 22h。
全文摘要
本发明公开了一种快速检测金黄色葡萄球菌的试剂及其方法，属于食品微生物安全监测领域。该发明试剂包括PEN选择性培养基和检测金黄色葡萄球菌DNA酶的TCF显色片。检测时，用生理盐水制备检样液，并将0.05～0.2mL检样液均匀涂布于PEN培养基中培养，出现菌落后经过热处理和TCF显色片显色，根据TCF显色片上的颜色变化来判断样品中是否存在金黄色葡萄球菌。该发明检测方法成本低廉，操作简便，灵敏度高，准确率高，周期短，可操作性强，可以广泛推广应用到食品卫生、环境监测等领域。
文档编号G01N21/78GK101497915SQ20091000791
公开日2009年8月5日 申请日期2009年2月26日 优先权日2008年12月30日
发明者吴清平, 吴许文, 张菊梅, 郭伟鹏, 黄汝添 申请人:广东省微生物研究所