一种快速检测食品中志贺氏菌的试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种检测食品中志贺氏菌的有扩增内标的PCR试剂盒，涉及生物技术领域，本方法使用方便、可靠性好、检测周期短、灵敏度高、特异性强、成本低廉、操作步骤简单，适用于高通量操作、标准化操作，且能避免因为样品存在DNA聚合酶的抑制因子而得到假阴性结果导致的误判，可用于多种食品中志贺氏菌的检测等。所述方法包括：（1）利用primer premier 6.0软件设计的针对志贺氏菌的一对特异性引物ipaHF/ipaHR，再增加扩增原核生物16S rDNA保守序列的27F/1492R引物作为扩增内标，2对引物共同进行扩增；（2）取待检测样品增菌培养6?8小时，培养后的增菌液采用煮沸冻融法提取基因组DNA作为模板进行扩增；（3）取试剂盒的PCR反应预混液配置25μl反应体系进行扩增，琼脂糖凝胶电泳后紫外灯下观察检测结果。
【专利说明】
一种快速检测食品中志贺氏菌的试剂盒
技术领域
[0001]本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种检测食品中志贺氏菌的有扩增内标的PCR试剂盒。
【背景技术】
[0002]志贺氏菌属是一类革兰氏阴性杆菌，是人类细菌性痢疾最为常见的病原菌，通称痢疾杆菌。志贺氏菌导致的细菌性痢疾是最常见的肠道传染病，夏秋两季患者最多。志贺氏菌也是一种最常见的食源性致病菌。传染源主要为病人和带菌者，通过污染了痢疾杆菌的食物、饮水等经口感染。人主要通过食用被志贺氏菌污染的食品而感染发病，以全身中毒症状、溃疡和大肠化脓性炎症为主要临床特征，食用被志贺氏菌污染的食物，一般情况将在6至24小时内出现如下症状:恶寒、发热、呕吐、腹痛、频繁的腹泻，水样便，混有血液和黏液；严重者出现(儿童多见)惊厥、昏迷，或手脚发冷、发绀、脉搏细而弱，血压低等表现。。据统计，全球每年的人类痢疾病例有1.647亿，其中的1.632亿病例发生在发展中国家，并导致110万人死亡，志贺氏菌病的危害远大于现有的想象。食品中的志贺氏菌与食品安全以及人类的生命健康有着很大的关系，因此，对志贺氏菌的检测研究非常重要。
[0003]目前常用的检测方法主要包括快速生化检测仪器法、毒素检测法、免疫法(Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA)、聚合酶链式反应技术、环介导恒温扩增技术(Loop-mediated isothermal amp Iifi cat 1n，LAMP)和基因芯片技术等。目前，对志贺氏菌的检测方法参考的国标(GB 4789.5一2012)是一种实验室检验方法，米集样品后，用增菌液先进行增菌培养16 h-20 h，再用增菌液分别划线接种于XLD琼脂平板和MAC琼脂平板或志贺氏菌显色培养基平板上，于36°C土TC培养20 h?24 h，观察各个平板上生长的菌落形态，再挑取可疑菌落进行生化鉴定或者运用生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统进行鉴定。这种实验室规方法的缺点是检验步骤繁琐、耗时长、准确率低，且一次检测完成样品项数较少，不能应对市场需求的快速准确检验方法的要求。全自动微生物生化鉴定系统所用试剂和仪器都比较昂贵，而且对操作人员的要求较高，尤其对于大批量样品的检测成本非常高，不适合一般实验室。LAMP方法对可能因为样品存在对酶活性具有抑制作用的物质而导致的结果呈现假阴性不能进行鉴别;LAMP方法敏感性非常高，且容易形成气溶胶污染，产生假阳性，造成检测结果错误;ELISA免疫学方法操作复杂，费时费力且不便于标准化及高通量操作。
【发明内容】
[0004]鉴于上述各种方法的不足，本发明旨在克服现有技术的不足，提供一种检测周期短、敏感性高、特异性强、操作简单、成本低廉、可准确地检测食品中志贺氏菌的试剂盒及方法，可在I d之内得到结果，同时无需昂贵的仪器和复杂的试剂，避免因为样品存在DNA聚合酶的抑制因子而得到假阴性结果导致的误判，可用于多种食品中志贺氏菌的检测等。
[0005]本发明的技术解决方案是:一种快速检测食品中志贺氏菌的扩增内标PCR试剂盒，其特征在于使用依次按照如下步骤进行:
(1)样品的米集:无菌米集可疑食品；
(2)增菌培养:将采集的可疑食品混合均匀后无菌取样，液体食品直接量取，固体食品放入无菌研钵、组织研磨器或均质袋内均质2?5 min，加入无菌营养肉汤培养基，37± 1°C振荡培养6?8 h，得到增菌液；
(3)DNA提取:取培养后的增菌液，振荡混匀，取Iml于离心管中1000?1500 r/mim离心I?2 min，除去较大块的碎片，取上清8000?12000 r/mim离心I?2 min，倾去上清液，倒置于吸水纸上不同的位置，吸干残留液体，再用无菌去离子水重悬、洗涤沉淀，8000?12000r/mim离心I?2 min，弃上清，用少量无菌去离子水重悬沉淀，沸水浴5?10 min，冰浴5?10min，1000?5000 r/mim离心5?10 min，上清液即为样品模板DNA，调整浓度至约为10?30ng/μ I备用，或-20 °C保存；
(4)PCR反应管制备:PCR反应管的制备及PCR反应预混液的融化均置于冰上进行;依次取PCR反应预混液24 μ?，样品模板DNA I μ?，加入至无菌PCR反应管中混合均匀，制得样品模板DNA的PCR反应管;然后制备阴性对照品和阳性对照品的PCR反应管，直接取相应管中预混液25μ1即可;每扩增一次，阴性对照和阳性对照都至少各有I管；
(5)扩增检测:将制备的样品模板DNA、阴性对照品、阳性对照品的PCR反应管置于PCR仪上进行PCR扩增，得PCR扩增产物；
(6)检测结果判定:取Ig琼脂糖溶于100 ml电泳缓冲液中，混合均匀后煮沸，冷却，加入DNA染料，倾倒凝胶板;凝胶冷却凝固后，将PCR扩增产物5 yl加入凝胶孔中进行电泳；电泳结束后，将凝胶放置于紫外灯下观察，判定结果；(a)阳性对照的凝胶孔有约1500 bp和约250 bp两条电泳条带而阴性对照的凝胶孔无任何条带，则PCR反应检测成功；(b)若阴性对照有2条带，说明PCR反应管制备过程中有交叉污染，结果不可靠，建议重新进行PCR检测；(c)阳性对照有2条带，阴性对照没有条带，被检样品的凝胶孔只出现I条约1500bp的电泳条带，与阳性对照的凝胶孔相应条带大小一致，则结果判断为阴性；(d)被检样品的凝胶孔出现的2条电泳条带与阳性对照的凝胶孔中相应条带大小一致，阴性对照无条带，则判定为被检样品阳性；(e)阳性对照的凝胶孔有两条电泳条带，阴性对照的凝胶孔无任何条带，而被检样品的凝胶孔在约1500 bp的位置没有条带则说明样品处理过程中存在酶抑制剂或操作失误，建议换其他方法进行样品处理再重新进行检测；(f)阳性对照和阴性对照孔都没有条带，说明试剂盒失效，本次检测结果无效。
[0006]本发明的有益效果:与现有的检测方法相比，本发明能够根据ipaHF、ipaHR引物的扩增结果实现对志贺氏菌的特异性检测；同时，可以根据27F、1492R引物的扩增结果鉴别因试剂或反应体系中存在PCR反应抑制成分而导致的假阴性结果，能够提示部分假阴性结果可能引起的误判，对提尚食品安全检测水平具有一定意义。
【附图说明】
[0007]图1到图4中，M:250bp DNA分子量标准；阴:阴性对照；阳:阳性对照。
[0008]图1:阴性对照无条带，而阳性对照在约1500bp和250bp处分别有2条电泳条带，说明检测成功。第I泳道有2条带与阳性对照位置一致，说明检样I呈阳性，而检样2只在约1500bp处有I条扩增内标条带，在约250bp处无条带，说明检样2为阴性。
[0009]图2:阴性对照和阳性对照在约1500bp和250bp处均有2条电泳条带，说明样品处理过程中被交叉污染，检测结果不可信，需要重新进行检测。
[0010]图3:阴对照无条带，阳性对照有2条电泳条带，而检样I在约1500bp处无扩增内标条带，说明样品处理过程中存在抑制DNA聚合酶活性的物质或操作失误，检测结果不可信，需要重新进行处理后检测。
[0011]图4:实际样品检测结果。
[0012]以上所述，仅为本发明的【具体实施方式】，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应所述以权利要求的保护范围为准。
[0013]
[0014]
[0015]
[0016]
[0017]
【具体实施方式】
实施例
[0018]以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
[0019]1.无菌采集可疑食品后取25 g，用无菌研钵或研磨器研磨碎，或者用无菌均质袋均质2 min，与225 ml营养肉汤增菌液混合，置于37±TC增菌培养6_8 h，得到增菌液；
2.增菌液振荡混匀后取1.5ml增菌液至离心管中，1000r/min离心I min去除食品碎片，取上清10000 r/min离心2 min，弃上清，用无菌去离子水重悬沉淀，10000 r/min离心2min，弃上清，用少量无菌去离子水重悬沉淀，沸水浴5 min，冰浴5 min, 1000 r/min离心5min，取上清液，得样品模板DNA;
3.将试剂盒中的PCR反应预混液等置于冰上融化后，取PCR反应预混液24μ?置于PCR反应管中，再加入模板DNA I μ?，用移液器吹打混合均匀；按照样品DNA的PCR反应管制备方法依次制备阴性对照品和阳性对照品的PCR反应管;然后制备阴性对照品和阳性对照品的PCR反应管，直接取相应管中预混液25μ1即可;每扩增一次称都至少有一管阴性对照和一管阳性对照；
4.PCR反应管制备好之后置于PCR仪上进行扩增，具体反应程序为:94°C预变性4 min；94 °C 变性 30 s、59.1°C 退火 30 s、72°C 延伸 90 s，30 个循环;72 °C 延伸 1 min；
5.PCR反应结束后，取5 μ? PCR产物进行电泳，紫外灯下观察检测结果。
【主权项】
1.一种快速检测食品中志贺氏菌的试剂盒，其特征是: 该试剂盒包含:无菌去离子水、PCR反应预混液、对照品和DNA染料； 所述PCR反应预混液含有PCR反应缓冲液、脱氧核糖核苷三磷酸、Taq DNA聚合酶，检测用引物； 所述检测用引物为志贺氏菌的特征性引物ipaHF、ipaHR和扩增内标引物27F、1492R，其序列分别为: ipaHF:GAATTTACGGACTGGTTCTCCCTCTGG； ipaHR:GTGATTATGAATGGTGCAGTCGTGAGC； 27F:AGAGTTTGATCCTGGCTCAG； 1492R:TACGGYTACCTTTGTTACGACTT； 所述对照品分为阴性对照品和阳性对照品，阴性对照品模板为无菌去离子水，阳性对照品模板为ipaHF / ipaHR的扩增产物连接至T载体后获得的质粒基因组。2.根据权利要求1所述的一种快速检测食品中大肠杆菌0157:H7的试剂盒，其特征是:扩增内标引物27?和1492郎勺终浓度均为0.4 mM。3.根据权利要求1所述的一种快速检测食品中志贺氏菌的试剂盒，其特征是:所述志贺氏菌的特异性引物序列为 ipaHF: GAATTTACGGACTGGTTCTCCCTCTGG和 ipaHR:GTGATTATGAATGGTGCAGTCGTGAGC。4.根据权利要求3所述的一种快速检测食品中大肠杆菌0157:H7的试剂盒，其特征是:所述志贺氏菌的特异性引物ipaHF和ipaHR的终浓度均为0.4 mM。5.根据权利要求1所述的一种快速检测食品中志贺氏菌的试剂盒，其特征是: 使用本试剂盒快速检测食品中志贺氏菌的方法是: (1)样品的米集:无菌米集可疑食品； (2)增菌培养:将采集的可疑食品混合均匀后无菌取样，液体食品直接量取，固体食品放入无菌研钵、组织研磨器或均质袋内均质2?5 min，加入无菌营养肉汤培养基，37± 1°C振荡培养6?8 h，得到增菌液； (3)DNA提取:取培养后的增菌液，振荡混匀，取Iml于离心管中1000?1500 r/mim离心1?2 min，除去较大块的碎片，取上清8000?12000 r/mim离心I?2 min，倾去上清液，倒置于吸水纸上不同的位置，吸干残留液体，再用无菌去离子水重悬、洗涤沉淀，8000?12000r/mim离心I?2 min，弃上清，用少量无菌去离子水重悬沉淀，沸水浴5?10 min，冰浴5?10min，1000?5000 r/mim离心5?10 min，上清液即为样品模板DNA，调整浓度至约为10?30ng/μ I备用，或-20 °C保存； (4)PCR反应管制备:PCR反应管的制备及PCR反应预混液的融化均置于冰上进行；依次取PCR反应预混液24 μ?，样品模板DNA I μ?，加入至无菌PCR反应管中混合均匀，制得样品模板DNA的PCR反应管;然后制备阴性对照品和阳性对照品的PCR反应管，直接取相应管中预混液25μ1即可;每扩增一次，阴性对照和阳性对照都至少各有I管； (5)扩增检测:将制备的样品模板DNA、阴性对照品、阳性对照品的PCR反应管置于PCR仪上进行PCR扩增，得PCR扩增产物； (6)检测结果判定:取Ig琼脂糖溶于100 ml电泳缓冲液中，混合均匀后煮沸，冷却，加入DNA染料，倾倒凝胶板;凝胶冷却凝固后，将PCR扩增产物5 yl加入凝胶孔中进行电泳；电泳结束后，将凝胶放置于紫外灯下观察，判定结果；(a)阳性对照的凝胶孔有约1500 bp和约250 bp两条电泳条带而阴性对照的凝胶孔无任何条带，则PCR反应检测成功；(b)若阴性对照有2条带，说明PCR反应管制备过程中有交叉污染，结果不可靠，建议重新进行PCR检测；(c)阳性对照有2条带，阴性对照没有条带，被检样品的凝胶孔只出现I条约1500 bp的电泳条带，与阳性对照的凝胶孔相应条带大小一致，则结果判断为阴性；(d)被检样品的凝胶孔出现的2条电泳条带与阳性对照的凝胶孔中相应条带大小一致，阴性对照无条带，则判定为被检样品阳性；(e)阳性对照的凝胶孔有两条电泳条带，阴性对照的凝胶孔无任何条带，而被检样品的凝胶孔在约1500 bp的位置没有条带则说明样品处理过程中存在酶抑制剂或操作失误，建议换其他方法进行样品处理再重新进行检测；(f)阳性对照和阴性对照孔都没有条带，说明试剂盒失效，本次检测结果无效。6.根据权利要求5所述的一种快速检测食品中志贺氏菌的试剂盒，其特征是:PCR反应体系为PCR反应预混液24 μ?、样品模板DNA I μ?，而3管对照品直接吸取相应管中预混液25μ?即可。7.根据权利要求5所述的一种快速检测食品中志贺氏菌的试剂盒及方法，其特征是:进行PCR扩增时，具体反应程序为:94 °C预变性4 min，然后30个循环，每个循环94 °C变性30 s、.59.1°C退火30 s、72°C延伸90 S，最后72°C延伸 10 min。
【文档编号】C12Q1/68GK105821130SQ201610272893
【公开日】2016年8月3日
【申请日】2016年4月28日
【发明人】励建荣, 张德福, 刘雪飞, 张明, 方亚琴, 徐永霞, 李婷婷, 李春, 汤轶伟, 高雪, 白凤翎
【申请人】渤海大学