专利名称：猪链球菌快速检测试剂盒的制备和使用方法
技术领域：
本发明属于分子生物学技术领域中的检测方法，具術步及一种猪链球菌快速检测试 齐U盒的制备和4顿方法。
技术背景猪链球菌(streptococcus suis)是一种广泛分布于哺乳动物和人体内的溶血性链 球菌。卵圆形，大小为O. 7—1. 4微米，往往成两个以上的菌体相连接成链状。革兰氏 染色阳生。该菌抵抗力不强，对TH、湿热均较敏感，常用消毒药可将其杀死。在动物 机f射氏抗力降低和外部环境变化诱导下，该菌会引发猪链球菌病，属国家规定的二类动 物疫病，是一种人畜共患传染病。表现为急性出血'卿夂血症、心内膜炎、脑膜炎、关节 炎、哺乳仔猪下痢和孕猪流产等。^^连球菌感染不仅可致猪败血症肺炎、脑膜炎、关节 炎及心内膜炎，而且可感^f寺定人群发病，并可致死亡，危害严重。本病一年四季均可 发生，以冬春季多发，不同年龄均可发病，病猪和病愈带菌猪是本病的主^(专染源，病 原存在于各脏器、血液、肌肉、关节和排泄物中，主要经消化道禾噸伤的皮肤感染，根 据感染发病的种类不同，发病率及死亡率均有不同。同时病源性猪链球菌也可以感m 类，引发鱼类疾病。病鱼眼球明显突出，其周围充血，鳃盖内侦l琉血发红鄉lj烈出血， 在夏季高水温时这，状发展ffijl。以往检测猪链球菌的主要方法有三种1.生理生化鉴定技术，该法费时，操作繁琐，不能满足病害防治的需要；2.酶联免疫吸附it验，3.聚合酉敏连式反应法(PCR法)， 该方法较前两种方法决速、灵敏，但需要昂贵的PCR仪。目前尚未见用环介导等显扩增 方法检测辯连球菌的试剂叙方法。 发明内容本发明的目的是掛共一种快速、特异性强、灵敏度高而且成本低的、用环介导等温 扩增(Loop-mediated isothermal amplification, LAMP)反应的方法检测猪链球菌的试剂盒-一擗连球菌快速检测试剂盒的制备和4顿方法，从而为食品安全掛共科学的依据 和指导作用。本发明的主要原理为(1)特殊设计一组可以识别靶DNA六个不同序列的两个内引 物(上游内引物和下游内弓嫩)和两个外引物(上游外引物和下游夕卜弓嫩)，内引物包含 耙DNA的正义链和反义链；(2)其中一个内弓胸首先禾瞎巴DNA杂交，随后的,體换DNA 合成在具有高度链置换活性的DNA聚合酶的参与下由一个外弓l物启动，释放出单链DNA，并作为由杂交到耙的另一端的一个内弓胸和一个外弓l物启动的DNA合淑莫板，产生一个 原始的茎环DNA; (3)内弓嫩以原始茎环DNA做丰對反，启动f體换DNA的合成，产生一 个原始的茎环DNA和一个新的由两倍茎长度的茎环DNA; (4)在^^^f牛下，内引物以 茎环DNA为申對反，Sii链置换形成多M有耙DNA反复重餅列的茎环DNA，在一小时 内该循环反应可使耙DNA累积到IO 9拷贝，可通过荧光染料5^见察扩增结果。本发明涉及的一种l^连球菌决速检测试剂盒其中的试齐抱括以下(1) - (4): (1)环介导等温扩增(LAMP)反应液A 、 (2) UNG酶、(3) Bst DNA聚合酶B和 (4)显色剂C 。其中，(1)环介导等温扩增(LAMP)反应液A :包括lOXThermopol反应缓冲液、300—500 umol /L dNTP、 2—4mmol/L硫酸镁 (MgS04)、 0.8—1.2"mol/L上游引内物(FIP)、 0. 8—1. 2 y mol/L下有内引物(BIP)、 0. 2—0. 3 u mol/L上游外弓|物(F3)、 0. 2—0. 3 umol/L下游内引物(B3)和l一l. 5mol /L 甜熟咸；其中戶斤述的上游内引物5_ TGATCTTTCTTGTCACCTGTTCCATCTGTCCGTATGGATGTTC -3、 下游内弓l物5-ACGTTGGTMGGMACCMGGATGATTTCAACMCAGCTTCT -3、 上游外引物5- CGTGCGCTTMATTCTATGC-3、 下游外弓l物5- GAGMATTCCTTCACCGTAC---3其中dNTP内的四种脱氧核糖核酸的质量比为dl)TP: dATP: dGTP: dCTP=2:1:1:1。 其中所述的lOXThermopol反应缓冲液中含有200mmol/L pH8. 8的三羟基甲基氨基 甲烷一盐酸(Tris—HCl)、 100咖ol/L氯化钾(KC1)、 100咖ol/L硫f敛安((NH4) 2S04)、 20mmol/L硫酉数美(MgSCO禾口1X曲拉通X—100 (Triton X—100);(2) UNG酶llJ/yL;(3) Bst DNA聚合酶B: 8U/mL;(4) 显色剂C:为10X的荧光染料SYBR GREEN I或者DNAGreen。 上面戶脱环介导等温扩增(LAMP)反应液A每管23uL的最佳组成为2.5uL 10XThermopol反应缓冲液、1. 0 y L 10mraol/L dNTP、 1. 0 u L 20 u mol/L上游内引物(FIP)、 1.0tiL20umol/L下访,内弓14勿(BIP)、 0. 25 u L 20 u mol/L —t访字夕卜弓l华勿(F3)、 0. 25yL20 n mol/L下游外弓|物(B3)、 0. 5 " L 100咖ol/LMgS04、 12. 5 u L 2mol/L甜^5顱n 4y L ddHzO (灭菌双蒸水)。使用上述试剂^测猪链球菌的检测方法，依次包括下列步骤(1)样品(待检样品或者培养菌液)DNA的提取步骤A.取200 mg待检样品或者1.0—1.5mL过夜培养的菌液，置于1.5mL离心管中，用台式离心机10000-12000转/分离心5—10min，弃上清液；B. 加入1. O—l. 5mL灭菌双蒸水，混匀，用台式离心机10000-12000转/分离心5 —編n，弃上清液；C. 加入100—150PL灭菌双蒸水，混匀，10(TC沸7jC浴中加热10—15min;D. 用台式离心机10000-12000转/分离心5—10min,取上清至另外一个1. 5mL离 心管中，即为待检模板DNA;(2)进行猪链球菌的环介导等温扩增反应步骤A. 在装有23 y L LAMP反应液A的反应管中加入1 ti L待检丰對反DNA，禾口 0. 5 y L的 UNG酶，再于叵匿属浴上95。C放置3—5min，立即置于冰上l一3min;B. 在上述的反应管中加入luL Bst DNA聚合酶B;C. 于恒^^属浴上60—65。C放置45—90min;D. 将金属浴调到80—95。C中止反应，3—5min后取出待检待检； (3)显色检测在待检的齡反应管中加入1 " L显色剂C，直接用肉鹏见察颜色变化，如果颜色 为黄色，说明待检细菌不是辯连球菌，如果颜色变为绿色，贝顿明样品为辦连球菌。本发明泉立了^f连球菌快速检观赋剂盒的制备和^顿方法，本试剂盒根据^l连球菌 的glnA基因的基本保守区的六个序歹股计了两啊寺异性内引物和两1^寺异性外弓嫩， 该保守基因序列为辯连球菌各不同血清型和菌株型所共有，以保证从种的水平上检测不 同来源的雜连球菌株的可靠性。本发明采用环介导等尉广增(LAMP)技术，该技术特异 性强，与PCR检测方法有相同的高灵每娘，但不需要昂贵的PCR仪，只需普通的金属浴 或7X浴锅即可，且结果不必用凝胶电泳方纟珠观察，4顿荧光染料来观察即可，简单而 快速。可用于辯连球菌的检测，特别适用于基层医疗机构以及#51场现场应用。下列实例进一步说明本发明，但不应当作对本发明的限制。 实施例1按下列配方制作猪链球菌决速检测试剂盒包括如下(1) - (4):(1) LAMP反应液A:包括2. 5 ti L 10 X Thermopol反应缓冲液、1. 0 u L 10鹏1/L dNTP、 1. 0 u L 20 " mol/L 上游内引物(F工P)、 l.OuL 20pmol/L下游内引物(BIP)、 0.25uL 20umol/L上游外 弓l物(F3)、0. 25 " 20 ix mol/L下游夕卜弓1物(B3)、0. 5 y L 100翻1/L MgSO.,、 12. 5 u L 2mol/L 甜熟鹏4"L dd恥(灭菌双蒸水)。其中所述的上游内引物5_ TGATCTTTCTTGTCACCTGTTCCATCTGTCCGTATGGATGTTC -3;下游内引物5-ACGTTGGTMGGAAACCMGGATGATTTCMCMCAGCTTCT -3; 上游外引物5- CGTGCGCTTAAATTCTATGC -3; 下游外引物5- GAGAMTTCCTTCACCGTAC -3。其中dNTP内的四种脱氧核糖核酸的质量比为dUTP:dATP:dGTP:dCTP二2:l:l:l。 其中所述的lOXThermopol反应缓冲液中含有200咖ol/L pH8. 8的三羟基甲基氨基 甲垸一盐酸(Tris—HC1)、 100咖ol/L氯化钾(KC1)、 100咖ol/L硫酸4安((肌)2S04)、 20mmol/L硫酉数美(MgS0J禾口1X曲拉通X—100 (Triton X—100);(2) UNG酶1U/卩L;(3) Bst DNA聚合酶B:請iaL;(4) 显色剂C:为10 %的荧光染料SYBR GREEN工。按照以下辦进行检测(1) 样品或者细菌DNA的提取A. 取200 mg待检样品或者1.5mL过夜培养的菌液，置于1.5mL离心管中，用台式 离心机10000转/分离心10min，弃上清液；B. 加入1.0—1.5mL灭菌双蒸水，混匀，用台式离心机10000转/分离心10min， 弃上清液；C. 加入150uL灭菌双蒸水，混匀，100。C沸水浴中加热一15min;D. 用台式离心机10000转/分离心5min，取上清液至另一个1. 5mL离心管中，即 为待检模板DNA;(2) 进行猪链球菌的环介导等温扩增反应A. 在装有23 ii L LAMP反应液A的反应管中加入1 u L待检模板DNA，和0. 5 tx L的 UNG酶，再亍瞎jg^属浴上95。C放置5min，立即置于冰上lmin;B. 在上述反应管中加入luL Bst DNA聚合酶B;C. 于恒^l^属浴上65。C放置1小时；D. 将金属浴调到80。C中止反应，3min后取出待检；(3) 显色检测在上述反应管中加入luL显色剂C，直接用肉船见察颜色变化，如果颜色为黄色， 说明待检样品不含或者不是織连球菌，如果颜色变为绿色，贝l脱明样品含有或者是猪链 球菌。实施例2按下列配方制作^tf连球菌快速检测试剂盒，包括如下(1) _ (4):(1) LAMP反应液A:包括2. 5 u L 10 XThermopol反应缓冲液、1. 0 " L 10mmol/L dNTP、 1. 0L 20 u mol/L 上游内引物(FIP)、 L0"L 20timol/L下游内引物(BIP)、 0.25uL 20umol/L上游外 弓l物(F3)、0. 25 u L 20 ti mol/L下游外弓l物(B3)、0. 5 u L 100mmol/L MgS04、 12. 5 u L 2mol/L 甜熟卿"L ddH/)(灭菌双蒸水)。其中戶腿的上游内弓嫩、下游内引物、上游夕卜弓嫩、下游外引物同上。 其中dNTP内的四种脱氧核糖核酸的质量比为dUTP:dATP:dGTP:dCTP=2:l:l:l。 其中所述的10XThermopol反应缓冲液中含有200ramol/L pH8. 8的三羟基甲基氨基 甲烷一盐酸(Tris—HCl)、 100腿ol/L氯化钾(KC1)、 100咖ol/L硫酸铵((肌)2S04)、 20mmol/L硫酸1美(MgS0J和l^曲拉通X—l00 (Triton X—100);(2) 跳酶1U組；(3) Bst DNA聚合酶B: 8 U/mL;(4) 显色剂C:为10X的荧光染料DNAGreen。按照以下禾，进行检测(1) 样品或者细菌DNA的提取A. 取200 mg待检样品或者1.5mL过夜培养的菌液，置于1.5mL离心管中，用台式 离心机10000-12000转/分离心5—10min，弃上清液；B. 加入1.5mL灭菌双蒸水，混匀，用台式离心机12000转/分离心50min，弃上清液；C. 加入150uL灭菌双蒸水，混匀，100。C沸水浴中加热15min;D. 用台式离心机12000转/分离心5min，取上清液至另一个1. 5mL离心管中，即 为待检模板DNA;(2) 进行猪链球菌的环介导，扩增反应A. 在装有23 u L LAMP反应液A的反应管中加入1 y L待检模板DNA，禾卩0. 5 u L的 UNG酶，再于恒^^属浴上95。C放置5min，立即置于冰上lmin;B. 在，反应管中加入:UL Bst DNA聚合酶B;C. 于恒^^属浴上6(TC方爐1小时；D. 将金属浴调到9(TC中止反应，3min后取出待禾金；(3) 显色检测在上述反应管中加入1 y L显色剂C，直接用剛歡见察颜色变化，如果颜色为黄色， 说明待检样品不含或者不是辯连球菌，如果颜色变为绿色，贝IJ说明样品含有或者是辯连 球菌。
权利要求
1.一种猪链球菌快速检测试剂盒，其特征是其中的试剂包括(1)环介导等温扩增反应液A包括10×Thermopol反应缓冲液、300-500μmol/L dNTP、2-4mmol/L硫酸镁、0.8-1.2μmol/L上游内引物、0.8-1.2μmol/L下游内引物、0.2-0.3μmol/L上游外引物、0.2-0.3μmol/L下游外引物和1-1.5mol/L甜菜碱；其中10×Thermopol反应缓冲液含有200mmol/L pH8.8的三羟基甲基氨基甲烷-盐酸、100mmol/L氯化钾、100mmol/L硫酸铵、20mmol/L硫酸镁和1％曲拉通X-100；其中所述的上游内引物5-TGATCTTTCTTGTCACCTGTTCCATCTGTCCGTATGGATGTTC-3、下游内引物5-ACGTTGGTAAGGAAACCAAGGATGATTTCAACAACAGCTTCT-3、上游外引物5-CGTGCGCTTAAATTCTATGC-3、下游外引物5-GAGAAATTCCTTCACCGTAC-3(2)UNG酶1U/μL；(3)Bst DNA聚合酶B8U/μL；(4)显色剂C为10％的荧光染料SYBR GREEN I或者DNAGreen。
2. 根据权利要求1中所述的猪链球菌快速检测试剂盒，其特征是上述的 混合物dNTP内的四种脱氧核糖核酸的质量比为dUTP:dATP:dGTP:dCTP =2:1:1:1。
3. 根据权利要求1中所述的猪链球菌快速检测试剂盒，其特征是上述的 环介导等温扩增反应液A每管23 u L的组成为2. 5 ti L lOXThermopol反 应缓冲液、1.0uL 10mmol/L dNTP、 1.0" L 20ymol/L上游内引物、1.0 uL 20umol/L下游内引物、0. 25 u L 20 " mol/L上游外引物、0.25ixL20 umol/L下游外引物、0. 5"L lOOmmol /L MgS04、 12. 5 " L 2mol/L甜菜碱 禾口 4ti L ddH20。4. 一种猪链球菌快速检测试剂盒的检测方法，其特征是依次包括下列步 骤(1) 待检样品DNA的提取A. 取200 mg待检样品或者1.0—1.5mL过夜培养的菌液，置于1. 5mL 离心管中，用台式离心机10000-12000转/分离心5 — 10min，弃上清液；B. 加入1.0—1.5mL灭菌双蒸水，混匀，用台式离心机10000-12000 转/分离心5 — 10min，弃上清液；C. 加入100—150 iiL灭菌双蒸水，混匀，100。C沸水浴中加热IO — 15min;D. 然后用台式离心机10000-12000转/分离心5—10min，取其上清 液至另外 一 个1. 5mL离心管中，即为待检样品的模板DNA;(2) 进行猪链球菌的环介导等温扩增反应A. 在装有23 ii L LAMP反应液A的反应管中加入1 u L待检样品模板DNA， 和O. 5uL的UNG酶，于恒温金属浴上5(TC放置3min，然后在95。C放置3 一5min，立即置于冰上1 一3min;B. 在上述反应管中加入1 u L Bst DNA聚合酶B;C. 于恒温金属浴上60 — 65。C放置45 — 90min;D. 将金属浴调到80 — 95。C中止反应，3 — 5min后取出待检；(3) 显色检测在待检反应管中加入1"L显色剂C，直接用肉眼观察颜色变化，如果 颜色为黄色，说明待检样品或者细菌不含或者不是猪链球菌，如果颜色变 为绿色，则说明检测出待检样品中含有或者为猪链球菌。
全文摘要
本发明涉及一种猪链球菌快速检测试剂盒的制备和使用方法。其中试剂盒内包括环介导等温扩增反应液A、Bst DNA聚合酶B、显色剂C；反应液A含有反应缓冲液、dNTP、硫酸镁、上游内引物5-TGATCTTTCTTGTCACCTGTTCC-ATCTGTCCGTATGGATGTTC-3、下游内引物5-ACGTTGGTAAGGAAACCAAGG-ATGATTTCAACAACAGCTTCT-3、上游外引物5-CGTGCGCTTAAATTCTATGC-3、下游外引物5-GAGAAATTCCTTCACCGTAC-3和甜菜碱；检测猪链球菌的方法包括待测样品或者细菌DNA的提取、猪链球菌的环介导等温扩增反应和显色检测。本发明优点是快速、特异性强、灵敏度高，而且成本低。
文档编号C12Q1/68GK101260426SQ200710115178
公开日2008年9月10日 申请日期2007年12月13日 优先权日2007年12月13日
发明者彪 徐, 朱来华, 梁成珠, 雷质文, 高宏伟 申请人:山东出入境检验检疫局检验检疫技术中心