专利名称：金黄色葡萄糖球菌快速检测试剂盒的制备和使用方法
技术领域：
本发明涉及一种利用环介导^^扩增(LAMP)技术进行菌样的快速检测的力法，具 体是一种金黄色葡萄辭求菌决速检测试剂盒的制备和使用方法。
背景技术：
金黄色葡萄f辭求菌(S-taphylococcusaureus)在自然界中无处不在，空气、水、灰 尘及人和动物的排泄物中都可找到。因而，食品受其污染的机会很多。近年来，美国疾 病控制中心报告，由金黄色葡萄球菌引起的感染占第二位，仅次于大肠杆菌。金黄色葡 萄球菌肠毒素是个世界性卫生问题，在美国由金黄色葡萄球菌肠毒素弓l起的食物中毒占 整个细菌性食物中毒的33%，加拿大则更多，占45%，我国每年发生的此类中毒事件也非 常多。典型的金黄色葡萄球菌为球型，直径0.8詣ol左右，显微镜下排列成葡萄串状。 金黄色葡萄球菌无芽胞、鞭毛，大多数无荚膜，革兰氏染色阳性。金黄色葡萄球菌营养 要求不高，在普通培养基上生长良好，需氧或兼性厌氧，；t^生长温度37° C，最适生 长pH 7.4。金黄色葡萄球菌有高度的耐—盐性，可在10-15°/。NaCl肉汤中生长。可分解葡 萄糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖，产酸不产气。甲基红反应阳性，VP反应弱阳性。许多菌株 可分解精氨酸，水解尿素，还原硝歡趟，液化明胶。金黄色葡萄球菌具有较强的，鹏力， 对磺胺类药物敏感性低，^X寸青霉素、红霉素等高度敏感。
金黄色葡萄球菌是人类化脓感染中最常见的病原菌，可引起局部化脓感染，也可引 趟市炎、伪膜性肠炎、心包炎等，甚至败血症、脓毒症等全身感染。金黄色葡萄球菌的致病力强弱主要取决于其产生的毒素和侵袭性酶a.溶血毒素夕卜毒素，分a、 P、 Y、 S四种，能损伤血小板，破坏溶酶体，引^m体局部缺血和坏死；b.杀白细胞素可破 坏人的白细胞和巨噬细胞；c.血浆凝固酶当金黄色葡萄球菌侵入人体时，该,吏血液 或血浆中的纤维蛋白沉积于菌体表面或凝固，阻碍吞噬细胞的吞噬作用。葡萄球菌形成 的感染易局部化与此酶有关；cl.脱氧核糖核酸酶金黄色葡萄球菌产生的脱氧核糖核酸 酶能耐受高温，可用来作为依据鉴定金黄色葡萄球菌；e.肠毒素金黄色葡萄球菌能产 生数种弓跑急性胃肠炎的蛋白质啦3毒氣分为A、 B、 C、 D、 E及F五种血清型。肠毒 素可耐受IOO。 C煮沸30min而不被破坏。它弓跑的食物中毒症状是呕吐和腹污。此外， 金黄色葡萄球菌还产生溶表皮素、明胶酶、蛋白酶、月旨肪酶、肽酶等。
以往检测金黄色葡萄球菌的主要方法有三沐1.生理生化鉴定技术，该法费时，操 作繁琐，不離薛足病害防治的需要2.酶联免疫吸附试验，3.聚合西敏连式反应法(PCR 法)，该方法较前顿中方法快速、灵敏，但需要昂贵的PCR仪。目前尚未见用环介导等显 扩增方法检测金黄色葡萄糖球劇勺试剂盒及方法。
发明内容
本发明的冃的是樹共一种快速、特异性强、灵每娘高而且) 低的用环介导等显扩 增(Loop-mediated isothermal amplification, LAMP)方法检测金黄色葡萄IW菌的试剂盒，并掛共一种金黄色葡萄糖球菌快速检测试剂盒的诺恪和使用方法，从而为水产养殖和食品安全提供科学的依据和指导作用。
本发明的主要原理为(1)特殊设计一组可以识另脾巴DNA六个不同序歹啲两个内引 物(上游内引物和下游内引物)和两个外引物(上游外引物和下游外弓嫩)，内引物包含靶DNA的正义链和反义链；(2)其中一个内引物首先和革EDNA杂交，随后的链置换DNA 合成在具有高度链置换活性的DNA聚合酶的参与下由一个外弓l物启动，释放出单链DNA， 并作为由杂交至鹏的另一端的一个内引物和一个外弓卿启动的DNA合成模板，产生一个 原始的茎环DNA; (3)内弓嫩以原始莲环DNA做模板，启动链置换DNA的合成，产生一 个原始的茎环DNA和一个新的由两倍茎长度的茎环DNA; (4)在等温条件下，内引物以 茎环DNA为t對及，舰链置换形成多"1^t有耙DNA反复重ST竽歹啲茎环DNA，在一小时 内该循环反应可使革巴DNA累积到109拷贝，可通过荧光染料彩见察扩增结果。
本发明涉及的金黄色葡萄辭求菌快速检测试剂盒，其中的试剂包括(1) - (4):
(1)环介导等温扩增(LAMP)反应液A :
其中含有lOXThermopol反应缓冲液、300 — 500 U mol/L dNTP (即dUTP， dATP， dGTP， dCTP四种脱氧核糖核酸的混合物)、2—4ramol/L硫酸售(MgS04)、 0.8—1.2 nmol/L上游引内物(FIP)、 0.8—1.2umol/L下有内引物(BIP)、 0.2—0.3,1/L上 游外引物(F3)、 0.2—0.3umol/L下游内引物(B3)和 l一l. 5mol/L甜菜碱;
其中所述上游内引物5- TGCATTCCTGGMTMTGACGOGTTAMGMGATGGTATGTGGMG -3;
下游内引物5- CAGMCGTGGTAMATTTTAGACCGATCTCATATGCTGTTCCTGTA- 3;
上游外弓嫩5-CATTGATCGCMCGTTCM -3;
下游外引物5-TTCTTTGGMCGATGCCT -3 。
其中dNTP内的四种脱氧核糖核酸的质量比为dUTP:dATP:dGTP:dCTP=2:l:l:l。
其屮所述的lOXThermopol反应缓冲液中含有200mmol/L pH8. 8的三羟基甲基氨基 甲烷-盐酸(Tris—HCl)、 100咖ol/L氯化钾(KC1)、丄00mmol/L硫^l安((NHJ 2S04)、 20咖ol/L硫酸售(MgSa,)和1%曲拉通X—100 (Triton X—100);
(2) UNG酶1U/tiL;
(3) Bst謹聚合酶B: 8 U/|aL;
(4) 显色剂C:为10X的荧光染料SYBR GREEN I或者DNA Green。
上面所述的环介导等温扩增(LAMP)反应液A每管23nL的最佳组成为2.5uL的lOXThermopol反应缓冲液、l.OuL 10咖ol/L dNTP、 l.OuL 20umol/L上游内引 物(FIP)、 1. 0uL 20umol/L下游内弓胸(BTP)、0. 25uL 20umol/L上游外引物(F3)、 0. 25 u L 20 ti mol/L下游外弓|物(B3 )、 0. 5 u L lOOmmol /L MgS04、 12. 5 u L 2mol/L 甜菜術卩4nL dcftO (灭菌双蒸水)。
使用上述试剂盒检测金黄色葡萄辭求菌的方法，依次包括下列步骤
(1)样品(待检样品或者培养菌液)DNA的提取
A.取200mg待检样品或者1.0—1.5raL过夜培养的菌液，置于1.5mL离心管中，用 台式离心机10000-12000转/分离心5—10min，弃上清液；
B. 加入1. O—l. 5mL灭菌双蒸水，混匀，用台式离心机10000-12000转/分离心5 一10min，弃上清液；
C. 加入100—150 iiL灭菌双蒸水，混匀，100。C沸水浴中加热10—15min;
D. 然后用台式离心机10000-12000转/分离心5—10min，取上清至另外一个1. 5mL 离心管中，即为待t金模板DNA。
(2) 进行金黄色葡萄lfi求菌的环介导等温扩增反应
A. 在装有23uL LAMP反应液A的反应管中加入luL待检样品模板DNA，和0. 5 tiL白勺ung酶，于恒s^属浴上95。C方爐3—5min，立即置于冰上1—3min;
B. 在上述反应管中加入1 y L Bst DNA聚合酶B;
C. 于恒温金属浴上60—65。C放置45—90m1n;
D. 将金属浴调到80—95。C中止反应，3 —5mn后取出待检；
(3) 显色检测
在待检的每个反应管中加入1"显色剂c，直接用肉,见察颜色变化，如果颜色为 黄色，说明待检样品或者细菌不含有^是金黄色葡萄f彪求菌，如果颜色变为绿色，则 说明待检样品或细菌为金黄色葡萄辭求菌。
本发明的优点在于粒了金黄色葡萄膨求菌的环介导等显扩增检测试剂M检测方 法，本试剂盒根据金黄色葡萄糖球菌的mecA基因的基本保守区的六个序列设计了两个特异性内引物和两个特异性外引物，该保守基因序列为金黄色葡萄辭求菌各不同血清型和菌株所共有，以保证从种的水平上检测不同来源的金黄色葡萄丰藤求菌株的可靠性。 本发明采用环介导，扩增(LAMP)技术，该技术牛寺异性强，与PCR检测方法有相同的 高灵每娘，但不需要昂贵的PCR仪，只需普通的金属浴或水浴锅即可，且结果不必用凝 胶电泳方法^E察，{顿荧光染料*11察即可，简单而快速。可用于金黄色葡萄IU求菌 的检测，特别适用于基层医疗机构以及銜直场现场c
按下列配方审,的金黄色葡萄糖球菌的检测试剂盒包含有以下(1) -一 (4):
实施利1
按下列配方制作创伤弧菌快速检测试剂盒包括如下(1) - (4):
其中所所述上游内引物5- tgcattcctggmtaatgacgcgttmagmgatggtatgtggmg -3;
下游内引物5- cagmcgtggtamattttagaccgatctcatatgctgttcctgta- 3;
上游夕卜弓I物5h:attgatcgcmcgttcaa -3;
下游外引物5- ttctttggmcgatgcct -3 。
(1) LAMP反应液A:
含有2.5uL的lOXThermopol反应缓冲液、l.OyL 1Ommol/L dNTP、 l.OwL 20 iimol/L上游内引物(BTP)、1.0uL 20,1/L F游内引物(BIP)、 0. 25y L 20umol/L 上游外弓l物(F3) 、 0. 25 u L 20 " mo 1 /L上游外引物(B3)、 0. 5 y L 100咖ol/L MgS04、 12. 5 ti L 2mo1甜熟卿4 u L ddH2O(灭菌双蒸水)。
(2) 跳酶1U/uL;
(3) Bst腿聚合酶B: 8 U / uL;
(4) 显色剂C:为10 X的荧光染料SYBR GREEN I。
并且按照以下不辨进行检测
(1) 样品(待检样品或對咅养菌液)DNA的提取
A. 取200 mg待检样品或者1.0过夜培养的瞎液，置于1.5mL离心管中，用台式离 心机10000转/分离心5 — 10n]in，弃上清液；
B. 加入1. 5mL灭菌双蒸水，混匀，用台式离心机12000转/分离心5min，弃上清液；
C.加入100 u L灭菌双蒸水，混匀，IO(TC沸水浴中加热l(Mn; D.然后，用台式离心机12000转/分离心5min，取上清^娃另一个1. 5mL离心管 中，即为待检模板DNA。
(2) 进行金黄色葡萄糖球菌的环介导等温扩增反应
A. 在装有23 ii L LAMP反应液A的反应管中加入1 y L待检模板D風，和0. 5 u L的 UNG酶，于恒^^属浴上50。C放置3min，然后再在95。C放置5min，立即置于冰上lmin;
B. 在，反应管中加入lyL Bst DNA聚合酶B;
C. 于恒温金属浴上65。C放置1小时；
D. 将金属浴调到8(TC中止反应，3min后取出待测；
(3) 显色检测
在待检的*反应管中加入1 w L显色剂C，直接用肉目歐见察颜色变化，如果颜色为 黄色，说明待检样品或者细菌不含有或者是金黄色葡萄辭求菌，如果颜色变为绿色，则 说明待检样品或细菌为金黄色葡萄辭求菌。
实施例2
按下列配方制作创伤弧菌快速检测试剂盒包括如下(1) - (4):
(1) LAMP反应液A:
含有2. 5 ;i L 10 X Therm。po1反应缓冲液、1. 0 y L 10腦1/L譜、1. 0 y L20 y mol/L 上游内引物(FIP)、 1.0iiL20"mol/L下游内弓l物(BIP)、 0. 25 p L20 y mol/L上游外弓| 物(F3)、 0. 25 ii L20 Mmol/L下游外弓i物(B3)、 0, 5 u /L 100ramol/LMgS04、 12. 5 u L 2mol/L 甜菊卿4uLd翻(灭菌双蒸水)。
其中戶腿的上游内引物、下游内引物、上游外引物、下游外引物同上。 其中) M的lOXThermopol反应缓冲液中含有200咖o1 pH8. 8的三羟基甲基tt甲 垸—盐酸(Tris—HC1)、 100nmol/L氯化钾(KC1)、 lOO咖olZL硫^l安((NH4) 2S04)、 20皿ol/L硫^l美(MgS04)和lW曲feMX—100 (Triton X—100);
(2) UNG酶lU/ixL
(3) Bst DNA聚合酶B:每微升含8个活性单位(8U/pL);
(4) 显色剂C:为10X的荧光染料DNAGreen。 按照以下禾旨进行检测
(1) 细菌DNA的提取
A. 取200 mg待检样品或者1.5mL过夜培养的齒液，置于1. 5mL离心管中，用台式 离心机12000转/分离心50min，弃上清液；
B. 加入1. 0 raL灭菌双蒸水，混匀，用台式离心机10000转/分离心10 min，弃上 清液；
C. 加入150uL灭菌双蒸水，混匀，IO0℃水浴中加热10 min;
D. 用台式离心机10000转/分离心10 min，取上清液至另一个1. 5mL离心管中， 即为待检模板DNA;
(2) 进行创伤弧菌的环介导等温扩增反应
A. 在装有23 n LLAMP反应液A的反应管中加入1 li L待检模板DNA禾n . 5 w L的UNG 酶，于恒温浴上5(TC放置3min，然后再在95。C的条件下放置5min，立即置于冰上 lmin;
B. 在反应管中加入luLBst DNA聚合酶B;
C. 于恒温浴上60℃放置l小时；
D. 将金属浴调到90℃止反应，3mm后取出待检；
(3) 显色检测
在待检的每个反应管中加入1 " L显色剂C，直接用肉眼观察颜色变化，如果颜色为 黄色，说明待检样品或者细菌不含有或者是金黄色葡萄fU求菌，如果颜色变为绿色，则 说明待检样品或细菌为金黄色葡萄H球菌。
权利要求
1.一种金黄色葡萄糖球菌快速检测试剂盒，其特征在于其中的试剂包括如下(1)-(4)(1)环介导等温扩增反应液A含有10×Thermopol反应缓冲液、300-500μmol/L dNTP、2-4mmol/L硫酸镁、0.8-1.2μmol/L上游内引物、0.8-1.2μmol/L下游内引物、0.2-0.3μmol/L上游外引物、0.2-0.3μmol/L下游外引物和1-1.5mol/L甜菜碱；其中10×Thermopol反应缓冲液含有200mmol/L pH8.8的三羟基甲基氨基甲烷-盐酸、100mmol/L氯化钾、100mmol/L硫酸铵、20mmol/L硫酸镁和1％曲拉通X-100；其中上游内引物5-TGCATTCCTGGAATAATGACGCGTTAAAGAAGATGGTATGTGGAAG-3、下游内引物5-CAGAACGTGGTAAAATTTTAGACCGATCTCATATGCTGTTCCTGTA-3、上游外引物5-CATTGATCGCAACGTTCAA-3、下游外引物5-TTCTTTGGAACGATGCCT-3；(2)UNG酶1U/μL；(3)Bst DNA聚合酶B8U/μL；(4)显色剂C为10％的荧光染料SYBR GREEN I或者DNAGreen。
2. 根据权利要求1中所述的金黄色葡萄糖球菌快速检测试剂盒，其特征是 上述的 dNTP 内的四种脱氧核糖核酸的质量比为 dUTP:dATP:dGTP:dCTP二2:1:1:1。
3. 根据权利要求1中所述的金黄色葡萄糖球菌快速检测试剂盒，其特征是 上述的环介导等温扩增反应液A每管23uL的组成为2.5uL 10 X Thermopol反应缓冲液、1.0uL 10mmol/L dNTP、 1.0yL 20umol/L上游 内引物、1.0uL20umol/L下游内引物、0. 25 u L 20 u mol/L上游外引物、 0. 25u L 20u mol/L下游外引物、0. 5 u L 100mmol/L MgS(X,、 12. 5u L 2mol/L甜菜碱和L ddH20。
4. 一种金黄色葡萄糖球菌快速检测试剂盒的使用方法，其特征是依次包括下列歩骤(1) 待检样品或细菌DNA的提取A. 取200 mg待检样品或者1.0—1.5mL过夜培养的菌液，置于1. 5mL离心管中，用台式离心机10000-12000转,/分离心5—10min，弃上清液；B. 加入1. O — l. 5mL灭菌双蒸水，混匀，用台式离心机10000-12000 转/分离心5—10min，弃上清液；C. 加入100 — 150 uL灭菌双蒸水，混匀，IO(TC沸水浴中加热IO — 15min;D. 然后用台式离心机10000-12000转/分离心5—10min，取上清至 一个新的1.5mL离心管中，即为待检样品模板DNA。(2) 进行金黄色葡萄糖球菌的环介导等温扩增反应A. 在装有23uL LAMP反应液A的反应管中加入1"L待检样品模板DNA， 和O. 5uL的UNG酶，于恒温金属浴上95。C放置3 — 5min，立即置于冰上1 一 3mirhB. 在上述反应管中加入1"L Bst DNA聚合酶B;C. 再于恒温金属浴上60 — 65。C放置45 — 90min;D. 将金属浴调到80 — 95。C中止反应，3 — 5rain后取出待检；(3) 显色检测在待检的每个反应管中加入l" L显色剂C，直接用肉眼观察颜色变化，如果颜色为黄色，说明待检样品或者细菌不含有或者是金黄色葡萄糖球菌， 如果颜色变为绿色，则说明待检样品或细菌为金黄色葡萄糖球菌。
全文摘要
本发明涉及一种金黄色葡萄糖球菌快速检测试剂盒的制备和使用方法。其中试剂盒内包括环介导等温扩增反应液A、BstDNA聚合酶B、显色剂C；反应液A含有反应缓冲液、dNTP、硫酸镁以及上游内引物5-TGCATTCCTGGAATAATGACGC-GTTAAAGAAGATGGTATGTGGAAG-3、下游内引物5-CAGAACGTGGTAAAATTTTAGACCG-ATCTCATATGCTGTTCCTGTA-3、上游外引物5-CATTGATCGCAACGTTCAA3、下游外引物5-TTCTTTGGAACGATGCCT-3和甜菜碱；检测金黄色葡萄糖球菌的方法包括待测样品或者细菌DNA的提取、金黄色葡萄糖球菌的环介导等温扩增反应和显色检测。本发明优点是快速、特异性强、灵敏度高而且成本低。
文档编号C12Q1/68GK101200762SQ20071011517
公开日2008年6月18日 申请日期2007年12月13日 优先权日2007年12月13日
发明者刘心同, 梁成珠, 肖西志, 高宏伟 申请人:山东出入境检验检疫局检验检疫技术中心