本发明属于医学检验技术领域，具体涉及一种β2-微球蛋白的快速检测试剂盒及其应用。
背景技术：
β2-微球蛋白(β2-microglobin，β2-MG)，是人体组织相容抗原(HLA)的一个β轻链，由淋巴细胞及有核细胞合成和分泌。β2-微球蛋白的分子内含一对二硫键，不含糖，其血清蛋白电泳位于β2区域。人体内几乎所有的有核细胞均能合成β2-微球蛋白，但是主要由淋巴细胞合成。β2-微球蛋白广泛存在于人血清、脑脊液、尿液、初乳、唾液等体液中，而且含量微小。
糖尿病肾病在长期糖尿病患者中非常多见，长期发展可更严重损害肾功能，严重影响糖尿病患者的生存质量即加重这些患者的经济负担。早期诊断糖尿病肾病并对其进行干预可以提高糖尿病患者的生存质量。目前，在临床常用的肾功能检测指标为尿素和肌酐，尿素和肌酐在检测的过程中存在操作简单，价格低廉的优点而被广泛应用于肾功能的检测中。然而上述这两个检测指标容易受年龄、性别、肌肉组织含量和蛋白质摄入等因素的影响，其对肾功能的评估存在准确度低、稳定差的缺陷。
β2-微球蛋白的代谢仅依赖域肾脏，有细胞表面脱落或释放入血的β2-微球蛋白，从肾小球自由滤过，几乎所有的近端肾小管重新收并分解代谢，不再反流入血，因而在正常情况下血清β2-微球蛋白可以保持着稳定的水平。而且β2-微球蛋白分子量小，因而能够从肾小球自由地滤过，而且β2-微球蛋白除了由肾脏排泄外极少有肾外的分解代谢，因此，其在体内的产生速率恒定，不会受年龄、性别、机体肌肉组织的影响而影响其血清水平含量。在体内β2-微球蛋白生成不增加的情况下，血清β2-微球蛋白水平升高是反映肾小球滤过功能损伤极灵敏的指标。
李丽波等发表了一篇题目为“β2-微球蛋白酶联免疫分析试剂盒的研制”的论文，该论文以β2-微球蛋白抗体包被微孔板，四甲基联苯胺为底物，用辣根过氧化物酶标记β2-微球蛋白，建立了β2-微球蛋白酶联免疫分析试剂盒。该试剂盒与放射性免疫分析法的相关系数为0.9000，而且还具有操作简单、快速的优点。但是，该试剂盒检测灵敏度较低，无法满足对含量微小的β2-微球蛋白的临床检测要求，大大的影响临床肾脏疾病的诊断。
专利文献CN101813700B在2010年3月31日公开了一种纳米微球免疫比浊法检测β2-微球蛋白试剂盒，该试剂盒包括试剂R1、试剂R2以及参考校准品；所述试剂R1由三羟甲基氨基甲烷、广谱杀菌剂、乙二胺四乙酸二钠、NaCl、吐温-20、PEG-6000，纯化水组成；所述试剂R2由三羟甲基氨基甲烷、结合有抗人β2-微球蛋白抗体的纳米微球、防腐剂组成，所述纳米微球直径为50-150nm，制备得到的试剂盒无需稀释、操作简单、准确度高、重复性好，适用于各种类型的全自动生化分析仪。但是，该试剂盒灵敏度较低，影响临床肾脏疾病的诊断，大大限制了该试剂盒的应用。
因此，研究和开发出一种灵敏度高、稳定性好的β2-微球蛋白检测试剂盒仍是当前亟需解决的难题。
技术实现要素：
为了克服现有技术中β2-微球蛋白检测试剂盒存在检测灵敏度较低、稳定性差的缺陷，本发明的目的在于提供一种β2-微球蛋白的快速检测试剂盒及其应用，以解决上述问题。
本发明提供了一种β2-微球蛋白的快速检测试剂盒，所述试剂盒包括试剂R1和试剂R2，所述试剂R1由以下组分及其浓度组成：
磷酸二氢钾100-160mmol/L、十二烷基葡萄糖苷40-70mmol/L、八(乙二醇)一(十二烷基)醚50-100mmol/L、单十二烷基九乙二醇醚80-120mmol/L、氯化钙2-4mmol/L和对羟基苯甲酸酯1-5mmol/L，余量为水；
所述试剂R2由以下组分及其浓度组成：单十二烷基九乙二醇醚80-120mmol/L、十二烷基葡萄糖苷40-70mmol/L、抗人β2-微球蛋白抗体胶乳5-20g/L和对羟基苯甲酸酯1-5mmol/L，余量为水；所述抗人β2-微球蛋白抗体胶乳的直径为130-150nm。
进一步地，所述试剂盒包括试剂R1和试剂R2，所述试剂R1由以下组分及其浓度组成：
磷酸二氢钾120mmol/L、十二烷基葡萄糖苷50mmol/L、八(乙二醇)一(十二烷基)醚80mmol/L、单十二烷基九乙二醇醚100mmol/L、氯化钙3mmol/L和对羟基苯甲酸酯2mmol/L，余量为水；
所述试剂R2由以下组分及其浓度组成：单十二烷基九乙二醇醚100mmol/L、十二烷基葡萄糖苷50mmol/L、抗人β2-微球蛋白抗体胶乳12g/L和对羟基苯甲酸酯2mmol/L，余量为水；所述抗人β2-微球蛋白抗体胶乳的直径为130-150nm。
进一步地，所述试剂R1的pH值为7.5-7.8。
进一步地，所述试剂R1的pH值为7.6。
进一步地，所述试剂R1与试剂R2的体积比为4:1。
进一步地，所述抗人β2-微球蛋白抗体胶乳的直径为142nm。
进一步地，所述抗人β2-微球蛋白抗体胶乳的制备方法为：
用0.1mol/L的磷酸钾缓冲液在室温下稀释抗人β2-微球蛋白抗体多克隆抗体和胶乳的混合物，在磁力搅拌器上混匀，所述抗人β2-微球蛋白抗体多克隆抗体和胶乳的混合物中抗人β2-微球蛋白抗体多克隆抗体与胶乳的重量比为1:2-4，所述磷酸钾缓冲液的加入量为胶乳重量的1-2倍；接着放在37℃的恒温条件下搅拌，所述转速为300rpm，加入含有甘氨酸的0.1mol/L的磷酸钾缓冲液中封闭1小时，离心,去上清，再加入0.1mol/L的磷酸钾缓冲液，即得。
进一步地，所述抗人β2-微球蛋白抗体多克隆抗体和胶乳的混合物中抗人β2-微球蛋白抗体多克隆抗体与胶乳的重量比为1:3。
进一步地，所述磷酸钾缓冲液的加入量为胶乳重量的1.5倍。
本发明提供的β2-微球蛋白的快速检测试剂盒的试剂R1中的十二烷基葡萄糖苷的分子式为C18H36O6，CAS号为110615-47-9；八(乙二醇)一(十二烷基)醚的分子式为C28H58O9，CAS号为3055-98-9；单十二烷基九乙二醇醚的分子式为C30H62O10，CAS号为3055-99-0。
校准品，购置利德曼公司的多项高值免疫标准液，标准值见说明书。
质控品，购置利德曼公司的多项免疫质控血清，质控值见说明书。
进一步地，所述抗人β2-微球蛋白多克隆抗体包括羊抗抗人β2-微球蛋白抗体多克隆抗体或兔抗抗人β2-微球蛋白多克隆抗体或鼠抗抗人β2-微球蛋白抗体多克隆抗体，上述β2-微球蛋白多克隆抗体均购于北京阿匹斯生物科技有限公司，上述抗体仅与人β2-微球蛋白反应，与其它抗原无免疫交叉反应，效价能够满足本试剂要求。胶乳购于BangsLaboratories公司。
本发明提供的β2-微球蛋白的快速检测试剂盒的检测原理为：人血清中β2-微球蛋白与抗血清试剂中的β2-微球蛋白抗体形成抗原抗体复合物，使反应出现浊度，在600nm下检测吸光度的变化与校准品比较测得血清中β2-微球蛋白的浓度。具体为：先加入试剂R1(样本稀释液)，解除样本中抗原周围的电子层和水化层，使抗原位点充分暴露；然后加入试剂R2(抗人β2-微球蛋白抗体胶乳溶液)，使抗人β2-微球蛋白抗体胶乳与样本中相应的β2-微球蛋白抗原反应，形成不溶性的抗原-抗体复合物，产生一定的浊度，其浊度高低与样本中的β2-微球蛋白含量成正比；在规定波长下测定该不溶性抗原-抗体复合物的吸光度值，与已知浓度的β2-微球蛋白参考校准品进行比较，则可计算出样本中β2-微球蛋白的含量。
进一步地，经试验发现，本发明提供的β2-微球蛋白的快速检测试剂盒检测高、中、低值三个浓度β2-微球蛋白的血清样本的批内变异系数分别为2.35％、2.44％和3.38％，批间变异系数分别为3.70％，2.80％和3.07％，均低于5％，说明本发明提供的β2-微球蛋白的快速检测试剂盒具有较高的精密度。
进一步地，本发明提供的β2-微球蛋白的快速检测试剂盒的检测限为0.2mg/L，其在20℃分别放置6个月和12个月后灵敏度和线性方程的R2值基本无变化，在4℃下保存36个月后，试剂盒灵敏度及线性良好，与刚制备的试剂盒无明显差别，说明本发明提供的β2-微球蛋白的快速检测试剂盒具有较高的稳定性和较好的灵敏性。
另外，本发明还提供了所述β2-微球蛋白的快速检测试剂盒在检测β2-微球蛋白中的应用。
总之，与现有技术相比，本发明提供的β2-微球蛋白的快速检测试剂盒具有测定灵敏度高、检测结果准确度高、重复性好和稳定性高的优点，是一种较为理想的β2-微球蛋白的快速检测试剂盒，有利于该试剂盒的推广和应用。
具体实施方式
以下通过具体实施例进一步描述本发明，本发明不仅仅限于以下实施例。在本发明的范围内或者在不脱离本发明的内容、精神和范围内，对本发明进行的变更、组合或替换，对于本领域的技术人员来说是显而易见的，且包含在本发明的范围之内。
实施例1、一种β2-微球蛋白的快速检测试剂盒
所述β2-微球蛋白的快速检测试剂盒包括体积比为4:1的试剂R1和试剂R2
所述试剂R1由以下组分及其浓度组成：磷酸二氢钾100mmol/L、十二烷基葡萄糖苷40mmol/L、八(乙二醇)一(十二烷基)醚50mmol/L、单十二烷基九乙二醇醚80mmol/L、氯化钙2mmol/L和对羟基苯甲酸酯1mmol/L，余量为水；所述试剂R1的pH值为7.5。
试剂R1制备方法为：将上述磷酸二氢钾、十二烷基葡萄糖苷、八(乙二醇)一(十二烷基)醚、单十二烷基九乙二醇醚、氯化钙和对羟基苯甲酸酯加入适量的水溶解，接着加水调节pH至7.5，即得。
所述试剂R2由以下组分及其浓度组成：单十二烷基九乙二醇醚80mmol/L、十二烷基葡萄糖苷40mmol/L、抗人β2-微球蛋白抗体胶乳5g/L和对羟基苯甲酸酯1mmol/L，余量为水；所述抗人β2-微球蛋白抗体胶乳的直径为130nm；
所述抗人β2-微球蛋白抗体胶乳的制备方法为：
用0.1mol/L的磷酸钾缓冲液在室温下稀释抗人β2-微球蛋白抗体多克隆抗体和胶乳的混合物，在磁力搅拌器上混匀，所述抗人β2-微球蛋白抗体多克隆抗体和胶乳的混合物中抗人β2-微球蛋白抗体多克隆抗体与胶乳的重量比为1:2，所述磷酸钾缓冲液的加入量为胶乳重量的1倍；接着放在37℃的恒温条件下搅拌，所述转速为300rpm，加入含有甘氨酸的0.1mol/L的磷酸钾缓冲液中封闭1小时，离心,去上清，再加入0.1mol/L的磷酸钾缓冲液，即得。
试剂R2制备方法为：将上述单十二烷基九乙二醇醚、十二烷基葡萄糖苷、抗人β2-微球蛋白抗体胶乳和对羟基苯甲酸酯加入水中搅拌均匀，即得。
实施例2、一种β2-微球蛋白的快速检测试剂盒
所述β2-微球蛋白的快速检测试剂盒包括体积比为4:1的试剂R1和试剂R2，
所述试剂R1由以下组分及其浓度组成：磷酸二氢钾120mmol/L、十二烷基葡萄糖苷50mmol/L、八(乙二醇)一(十二烷基)醚80mmol/L、单十二烷基九乙二醇醚100mmol/L、氯化钙3mmol/L和对羟基苯甲酸酯2mmol/L，余量为水；所述试剂R1的pH值为7.6；所述试剂R1的制备方法如实施例1。
所述试剂R2由以下组分及其浓度组成：单十二烷基九乙二醇醚100mmol/L、十二烷基葡萄糖苷50mmol/L、抗人β2-微球蛋白抗体胶乳12g/L和对羟基苯甲酸酯2mmol/L，余量为水；所述抗人β2-微球蛋白抗体胶乳的直径为142nm；
所述抗人β2-微球蛋白抗体胶乳的制备方法为：
用0.1mol/L的磷酸钾缓冲液在室温下稀释抗人β2-微球蛋白抗体多克隆抗体和胶乳的混合物，在磁力搅拌器上混匀，所述抗人β2-微球蛋白抗体多克隆抗体和胶乳的混合物中抗人β2-微球蛋白抗体多克隆抗体与胶乳的重量比为1:3，所述磷酸钾缓冲液的加入量为胶乳重量的1倍；接着放在37℃的恒温条件下搅拌，所述转速为300rpm，加入含有甘氨酸的0.1mol/L的磷酸钾缓冲液中封闭1小时，离心,去上清，再加入0.1mol/L的磷酸钾缓冲液，即得。
所述试剂R1的制备方法如实施例1。
实施例3、一种β2-微球蛋白的快速检测试剂盒
所述β2-微球蛋白的快速检测试剂盒包括体积比为4:1的试剂R1和试剂R2
所述试剂R1由以下组分及其浓度组成：磷酸二氢钾160mmol/L、十二烷基葡萄糖苷70mmol/L、八(乙二醇)一(十二烷基)醚100mmol/L、单十二烷基九乙二醇醚120mmol/L、氯化钙4mmol/L和对羟基苯甲酸酯3mmol/L，余量为水；所述试剂R1的pH值为7.8；所述试剂R1的制备方法如实施例1。
所述试剂R2由以下组分及其浓度组成：单十二烷基九乙二醇醚120mmol/L、十二烷基葡萄糖苷70mmol/L、抗人β2-微球蛋白抗体胶乳20g/L和对羟基苯甲酸酯3mmol/L，余量为水；所述抗人β2-微球蛋白抗体胶乳的直径为150nm；
所述抗人β2-微球蛋白抗体胶乳的制备方法为：
用0.1mol/L的磷酸钾缓冲液在室温下稀释抗人β2-微球蛋白抗体多克隆抗体和胶乳的混合物，在磁力搅拌器上混匀，所述抗人β2-微球蛋白抗体多克隆抗体和胶乳的混合物中抗人β2-微球蛋白抗体多克隆抗体与胶乳的重量比为1:4，所述磷酸钾缓冲液的加入量为胶乳重量的1倍；接着放在37℃的恒温条件下搅拌，所述转速为300rpm，加入含有甘氨酸的0.1mol/L的磷酸钾缓冲液中封闭1小时，离心,去上清，再加入0.1mol/L的磷酸钾缓冲液，即得。
所述试剂R2的制备方法如实施例1。
对比例1、一种β2-微球蛋白的快速检测试剂盒
所述β2-微球蛋白的快速检测试剂盒包括体积比为4:1的试剂R1和试剂R2，
所述试剂R1由以下组分及其浓度组成：磷酸二氢钾120mmol/L、吐温-2050mmol/L、八(乙二醇)一(十二烷基)醚80mmol/L、单十二烷基九乙二醇醚100mmol/L、氯化钙3mmol/L和对羟基苯甲酸酯2mmol/L，余量为水；所述试剂R1的pH值为7.6；所述试剂R1的制备方法如实施例1。
所述试剂R2由以下组分及其浓度组成：单十二烷基九乙二醇醚100mmol/L、十二烷基葡萄糖苷50mmol/L、抗人β2-微球蛋白抗体胶乳12g/L和对羟基苯甲酸酯2mmol/L，余量为水；所述抗人β2-微球蛋白抗体胶乳的直径为142nm；
所述抗人β2-微球蛋白抗体胶乳的制备方法与实施例2类似。
所述试剂R2的制备方法如实施例1。
与实施例2的区别在于：将十二烷基葡萄糖苷替换为吐温-20。
对比例2、一种β2-微球蛋白的快速检测试剂盒
所述β2-微球蛋白的快速检测试剂盒包括体积比为4:1的试剂R1和试剂R2，
所述试剂R1由以下组分及其浓度组成：磷酸二氢钾120mmol/L、十二烷基葡萄糖苷50mmol/L、单十二烷基九乙二醇醚180mmol/L、氯化钙3mmol/L和对羟基苯甲酸酯2mmol/L，余量为水；所述试剂R1的pH值为7.6；所述试剂R1的制备方法如实施例1。
所述试剂R2由以下组分及其浓度组成：单十二烷基九乙二醇醚100mmol/L、十二烷基葡萄糖苷50mmol/L、抗人β2-微球蛋白抗体胶乳12g/L和对羟基苯甲酸酯2mmol/L，余量为水；所述抗人β2-微球蛋白抗体胶乳的直径为142nm；
所述抗人β2-微球蛋白抗体胶乳的制备方法与实施例2类似。
所述试剂R2的制备方法如实施例1。
与实施例2的区别在于：没有添加八(乙二醇)一(十二烷基)醚，增加单十二烷基九乙二醇醚的用量。
对比例3、一种β2-微球蛋白的快速检测试剂盒
所述β2-微球蛋白的快速检测试剂盒包括体积比为4:1的试剂R1和试剂R2，
所述试剂R1由以下组分及其浓度组成：磷酸二氢钾120mmol/L、十二烷基葡萄糖苷50mmol/L、八(乙二醇)一(十二烷基)醚80mmol/L、单十二烷基九乙二醇醚100mmol/L、氯化钙3mmol/L和对羟基苯甲酸酯2mmol/L，余量为水；所述试剂R1的pH值为7.6；所述试剂R1的制备方法如实施例1。
所述试剂R2由以下组分及其浓度组成：单十二烷基九乙二醇醚100mmol/L、十二烷基葡萄糖苷50mmol/L、抗人β2-微球蛋白抗体胶乳12g/L和对羟基苯甲酸酯2mmol/L，余量为水；所述抗人β2-微球蛋白抗体胶乳的直径为125nm；
所述抗人β2-微球蛋白抗体胶乳的制备方法与实施例2类似。
所述试剂R2的制备方法如实施例1。
与实施例2的区别在于：所述抗人β2-微球蛋白抗体胶乳的直径为125nm。
对比例4、一种β2-微球蛋白的快速检测试剂盒
所述β2-微球蛋白的快速检测试剂盒包括体积比为4:1的试剂R1和试剂R2，
所述试剂R1和试剂R2的组分和浓度如实施例2。
所述试剂R1和试剂R2的制备方法如实施例1。
所述抗人β2-微球蛋白抗体胶乳的制备方法为：
用0.1mol/L的磷酸钾缓冲液在室温下稀释抗人β2-微球蛋白抗体多克隆抗体和胶乳的混合物，在磁力搅拌器上混匀，所述抗人β2-微球蛋白抗体多克隆抗体和胶乳的混合物中抗人β2-微球蛋白抗体多克隆抗体与胶乳的重量比为1:1，所述磷酸钾缓冲液的加入量为胶乳重量的1倍；接着放在37℃的恒温条件下搅拌，所述转速为300rpm，加入含有甘氨酸的0.1mol/L的磷酸钾缓冲液中封闭1小时，离心,去上清，再加入0.1mol/L的磷酸钾缓冲液，即得。
与实施例2的区别在于：所述抗人β2-微球蛋白抗体多克隆抗体和胶乳的混合物中抗人β2-微球蛋白抗体多克隆抗体与胶乳的重量比为1:1。
试验例一、β2-微球蛋白的快速检测试剂盒的精密度试验
1、试验材料：实施例2制备的β2-微球蛋白的快速检测试剂盒，高、中、低三种浓度的β2-微球蛋白的血清样本。
2、试验方法：参考美国国家临床实验室标准话研究所(CLSI)EP5A2文件的方法，采用实施例2制备的β2-微球蛋白的快速检测试剂盒对高(4.65mg/L)、中(2.45mg/L)、低(0.65mg/L)值三个浓度的β2-微球蛋白的血清样本分别进行重复性测定，将高、中、低值三个浓度β2-微球蛋白的血清样本分别分装成20管，放置-20℃中保存，采用日本HITACH的7600全自动生化分析仪每天测一管，连续测定20天，计算各浓度的批内和批间变异系数(CV％)。
3、试验结果：
试验结果如表1所示。
表1血清高中低三种水平β2-微球蛋白的精密度分析
由表1可知，本发明提供的β2-微球蛋白的快速检测试剂盒检测高、中、低值三个浓度的β2-微球蛋白的血清样本的批内变异系数分别为2.35％、2.44％和3.38％，批间变异系数分别为3.70％，2.80％和3.07％，均低于5％，说明本发明提供的β2-微球蛋白的快速检测试剂盒具有较高的精密度。
试验例二、β2-微球蛋白的快速检测试剂盒的灵敏度试验
1、试验材料：实施例2制备的β2-微球蛋白的快速检测试剂盒，利德曼公司的多项高值免疫标准液。
2、试验方法：参考日本JJCLA文件规定的检测限判断标准，将β2-微球蛋白标准品准确稀释成0.1-0.5mg/L的5个低浓度样本，各测定10次，以测定结果与基质液的不重叠的最低值为检测限。
3、试验结果
试验结果如表2所示。
表2 β2-微球蛋白的快速检测试剂盒的的灵敏度试验
注：*为吸光度值×1000
由表2可知，本发明提供的β2-微球蛋白的快速检测试剂盒在0.2mg/L浓度的测定结果与基质液的不重叠，因此，说明本发明提供的β2-微球蛋白的快速检测试剂盒的检测限为0.2mg/L，具有检测限度低、灵敏度高的优点。
试验例三、β2-微球蛋白的快速检测试剂盒的稳定性试验
1、试验材料：实施例1、实施例2、实施例3、对比例1、对比例2、对比例3和对比例4制备的β2-微球蛋白的快速检测试剂盒。
2、试验方法：
将实施例1、实施例2、实施例3、对比例1、对比例2、对比例3和对比例4制备的β2-微球蛋白的快速检测试剂盒在20℃分别放置6个月和12个月后，按照试验例二的方法测定试剂盒的灵敏度，并将实施例1、实施例2、实施例3、对比例1、对比例2、对比例3和对比例4制备的β2-微球蛋白的快速检测试剂盒与利德曼试剂分别检测血清β2-微球蛋白，然后将上述结果进行回归分析，计算R2值。
3、试验结果：
试验结果如表3所示。
表3 β2-微球蛋白的快速检测试剂盒的稳定性试验
由表3可知，本发明提供的β2-微球蛋白的快速检测试剂盒在20℃分别放置6个月和12个月后灵敏度和线性方程的R2值基本无变化，说明本发明提供的β2-微球蛋白的快速检测试剂盒具有较高的稳定性和较好的灵敏度。
另外，本发明提供的β2-微球蛋白的快速检测试剂盒在4℃下保存36个月后，试剂盒灵敏度及线性良好，与刚制备的试剂盒无明显差别。