一种异常黏液质型阳痿病证哺乳动物血清和阴茎平滑肌组织差异蛋白体系及筛选方法与应用与流程

本发明属于生物
技术领域：
，具体涉及一种维医异常黏液质型阳痿病证的哺乳动物血清和阴茎平滑肌组织差异蛋白及其筛选方法与应用。
背景技术：
：维吾尔医(维医)学是祖国传统医学中重要组成部分，维医学体液论认为，人体由胆液质、血液质、黏液质和黑胆质4种体液质组成，上述4种体液质的动态平衡是机体健康的生理基础，而某一种体液质的量或/和质的变化，引起体液质平衡失调，产生一种异常体液质证(证候)，与多种疾病的发生存在因果关系。体液病理学(体液论)是维医理论根基，其认为4种体液中，黏液质体液属性湿寒，常易因生活、饮食与环境因素、工作压力、缺乏运动等原因导致体内体液平衡遭到破坏，黏液质体液发生改变，产生异常黏液质，致代谢水平降低，产物蓄积体内，进而导致病理性改变，引发相关疾病。临床研究证实，异常黏液质证(AbnormalPhlegm)在阳痿(阴茎勃起功能障碍)、早泄、少弱精症、卵巢早衰、不孕不育等生殖疾病、肥胖症、高脂血症等代谢性疾病和心血管疾病发生过程中，处于主导地位，可能也是肿瘤、糖尿病、高血压等复杂性疾病发生早期的主要证型。勃起功能障碍(ErectileDysfunction，ED)，又称阳痿，是指男子阴茎不能勃起及不能维持勃起而完成满意的性生活，属维医优势病种。阴茎勃起是由多种生物活性因子(包括神经递质，激素，酶，离子通道等)综合调节的神经-血管性生物活动。在维医药临床与基础研究方向，因实验动物学起步较晚，无相关病证结合动物模型，导致异常黏液质型阳痿病证及其对证方药作用机理研究一直滞后，并严重制约了维医男科在此领域的研究与发展，更无关于异常黏液质型阳痿病证的相关标志蛋白及其蛋白标志物体系的研究报道。为了从现代生殖生物学角度进一步认识维医异常黏液质型阳痿，我们基于维医体液论和造模理念，成功建立了异常黏液质证候动物模型，并采用APO阴茎勃起实验与交配实验结合的方法，从中筛选出ED模型，对其生物学表征、性功能与交配行为、性腺轴与NO-CGMP信号转导通路等生殖生物学方面的改变进行了研究，但异常黏液质型阳痿病证并非是单一生殖器官即阴茎平滑肌组织的的疾病，而是全身性疾病，因此需要我们用整体观念，从全身的视野，来分析、研究和探索该病证的发生发展规律与可能的治疗方法。维医辨证分型的起点和核心是维医“体液论”，其出发点是人体内在体液动态变化的外在表现，而维医药学所推崇的辨证施治也是依据个体的整体水平上发生的体液表型差异，这与系统生物学整体研究思路不谋而合。血清融入了机体多器官、组织和细胞的蛋白质动态信息，也是与阴茎勃起功能密切相关的分泌蛋白必经之路，可以反映机体的病理生理改变相关的总体调控网络的时空性，而药物对任何靶器官、组织或细胞的作用最终也反映在血清蛋白质组变化之中。阴茎是阴茎勃起的效应器官，海绵体平滑肌则为效应组织，其任何一种病理胜利改变也与该组织蛋白质水平动态变化密不可分，其中蕴藏着阳痿发生相关的潜在蛋白标记，也是该疾病药物治疗的重要靶点之一。故，本研究基于异常黏液质证候与病证结合动物模型基础上，开展了血清和阴茎平滑肌组织的蛋白质组学研究，建立了异常黏液质型阳痿病证相关血清和阴茎平滑肌组织蛋白体系，为进一步开展异常黏液质型阳痿病证的机制研究、药物筛选、转化与防治研究奠定了基础。技术实现要素：有鉴于此，本发明的第一目的在于提供维医异常黏液质型阳痿病证的哺乳动物血清差异蛋白体系，包括以下蛋白：优选地，本发明的所述维医异常黏液质型阳痿病证的哺乳动物血清差异蛋白体系来自模式动物；所述模式动物为大鼠。本发明的第二目的在于提供维医异常黏液质型阳痿病证的哺乳动物阴茎平滑肌组织差异蛋白体系，包括以下蛋白：优选地，本发明所述维医异常黏液质型阳痿病证的哺乳动物阴茎平滑肌组织差异蛋白体系来自模式动物；所述模式动物为大鼠。本发明再一目的在于提供了上述维医异常黏液质型阳痿病证的哺乳动物血清差异蛋白体系和阴茎平滑肌组织差异蛋白体系的筛选方法，包括以下步骤：1)建立正常对照组(N组)、异常黏液质证候组(ZM组)、异常黏液质型病证组(BM组)；2)采集所述步骤1)得到的哺乳动物全血，分离后得到哺乳动物的血清，取所述步骤1)得到哺乳动物的阴茎平滑肌组织；3)从所述步骤2)得到的所述血清和所述阴茎平滑肌组织中提取蛋白质；4)将所述步骤3)中得到的所述蛋白质标记后纯化，得到纯化后肽段；5)将所述步骤4)得到的所述纯化后的肽段经质谱检测后得到指纹图谱，筛选后所述指纹图谱使用蛋白质组学分析软件进行检索，根据得到的搜索结果和筛选后的谱图进行定量分析，将得到的分析数据在所述哺乳动物蛋白质数据库中使用蛋白质质谱检索软件检索，获得所述N组、ZM组和BM组哺乳动物血清和阴茎平滑肌组织差异蛋白质；6)将所述步骤5)中所述BM组与ZM组的血清蛋白质相比较，得到BM/ZM的血清差异蛋白质；将BM组与N组的血清蛋白质相比较，得到BM/N的血清差异蛋白质；统计所述BM/ZM和BM/N的差异蛋白的共同蛋白的种类和数量，得到异常黏液质型阳痿病证组的血清差异蛋白质；所述BM组和与ZM组的阴茎平滑肌蛋白质相比较，得到BM/ZM的阴茎平滑肌组织差异蛋白质；将BM组与N组的阴茎平滑肌组织蛋白质相比较，得到BM/N组阴茎平滑肌组织差异蛋白质；统计所述BM/ZM和BM/N的差异蛋白的共同蛋白的种类和数量，得到异常黏液质型阳痿病证组的阴茎平滑肌组织差异蛋白质；优选地，本发明的筛选方法中，所述哺乳动物为大鼠。优选地，本发明的筛选方法中，所述步骤1)中正常对照组大鼠在常规环境中饲养，喂食的环境温度为18～22℃，所述喂食环境的相对湿度为40～60％，造模组的喂食的环境温度为8～12℃，所述喂食环境的相对湿度70～80％％；所述步骤1)中正常对照组为普通饲料，造模组喂食饲料为湿寒性饲料。优选地，本发明的筛选方法中，所述步骤3)中所述标记方法为iTRAQ标记试剂盒标记。优选地，本发明的筛选方法中，所述步骤4)中蛋白质组学分析软件为ProteomeDiscoverer；所述蛋白质质谱检索软件为mascot软件。本发明还提供了上述维医异常黏液质型阳痿病证的哺乳动物血清差异蛋白体系和阴茎平滑肌组织差异蛋白体系在制备预防或治疗哺乳动物异常黏液质型阳痿药物中的应用。由上可知，本发明的优点在于：1、现代医学中没有证候的概念，常用疾病与正常对照组之间寻找差异蛋白，而在维医临床诊治中，则需辨证论治，并对不同证型的阳痿患者使用不同的方药进行治疗，即病证与方药对应。本专利发明人，基于对证候和病证的认识与丰富的维吾尔医学知识，运用辩证与辨病相结合的方式，通过类比方法，在BM与ZM组的差异蛋白与BM与N组的差异蛋白之间寻找共同蛋白，筛查出了异常黏液质型阳痿病证的血清和阴茎平滑肌组织候选蛋白标志物，并通过验证，建立了异常黏液质型阳痿病证的哺乳动物血清和阴茎平滑肌组织蛋白标志物体系，而该体系则更准确的反映了维医对病证的诠释，体现了证候的本质。并建立宏观与微观认识配合、分析与综合研究统一的指标体系，提升阳痿的辨证论治水平与药物研发水平具有重要意义2、本发明提供了35种维医异常黏液质型阳痿病证的哺乳动物血清差异蛋白和48种阴茎平滑肌组织差异蛋白；通过实施例表明其在模式动物如大鼠中血清和阴茎平滑肌组织中差异蛋白的上调或者下调表达，表明这些差异蛋白对大鼠的阴茎勃起功能产生了一定的影响，最终确定为异常黏液质型阳痿病证的生物标记物，可以针对上述生物标记物进行药物基础研究，为进一步开展异常黏液质型阳痿(勃起功能障碍)病证机制研究、药物筛选、转化与防治研究奠定了基础，提供了依据。附图说明图1为正常对照组、异常黏液质证侯组和病证组大鼠模型的造模流程图；图2为维医异常黏液质型阳痿病证的哺乳动物血清和阴茎平滑肌组织蛋白质组学及其差异蛋白体系的筛选流程图；图3为大鼠血清差异蛋白质和大鼠阴茎平滑肌组织差异蛋白质的完整性检测的SDS-PAGE电泳图谱。图4为35种候选差异蛋白中任意选取7种蛋白的ELISA检测。具体实施方式在本发明实施例中，试验动物为：具有正常性能力的性成熟期SD雄性大鼠30只(体重200g左右)，雌性大鼠15只(体重180g左右)，由新疆医科大学实验动物中心提供；在本发明实施例中，药品与试剂：湿寒性饲料由新疆医科大学实验动物中心按前期研究中使用的要求配制；菠菜实与芫荽实等药材购自于新疆维吾尔自治区维吾尔医医院草药房；戊巴比妥钠；生理盐水；阿扑吗啡(90μg/kg)；雌二醇；黄体酮；主要检测试剂：ELISA试剂盒、BCA蛋白定量试剂盒等。在本发明实施例中，术语为以下含义：术语APO:阿扑吗啡(Apomorphine)；术语iTRAQ：同位素标记相对和绝对定量(isobarictagsforrelativeandabsolutequantitation)术语HPLC:：高效液相色谱法(HighPerformanceLiquidChromatography)术语SDS：十二烷基硫酸钠(sodiumdodecylsulfate,sodiumsalt)生物学表征观测：定性指标观测：所述定性指标观测为皮肤毛发在日光下观察，情绪反应以一笼内各大鼠相互反应为主观察30分钟，行为状态以此期间内的活动为主、安静环境下观察30分钟，兴奋程度以夹尾实验时的反应为主，舌象舌苔在日光下观察、记录并拍照，饮食水状态以各组同一时间喂饲观察饮食水状态，小便以各组大鼠当日正排尿时颜色为主，大便状态以当日正排大便时大便形态为主；定量指标为避免生理节奏的影响，每天固定于20:00-22:00收集各项资料，其中体重：每天按规定时间称重并记录，以每笼总体重除以该笼大鼠只数，得出平均体重，并按下述公式得出模型组各笼体重比值并记录，体重比值＝模型组平均体重-模型组初始体重/正常组平均体重-正常组初始体重；饮食量：每天20:00添加饲料300g，次日20:00称食物余量，根据下述公式得出100g体重相对应的饮食量并记录；饮水量：每天20:00给水500ml，次日20:00量剩余水量，计算得出100g体重相对应的饮水量并记录；尿量：造模第一天记录好给的干垫料重量，第二天按规定时间称含有尿液及大便的湿垫料的重量并记录，然后在恒温鼓风干燥箱100℃下2小时烘干后再次称重，计算各组尿量；大便量：计算100g体重相对应的大便量并记录。APO勃起试验或APO实验方法为参考Heaton等的方法，将试验大鼠置于观察箱中10～15min适应环境，保持安静，调暗灯光，在大鼠颈项皮肤注射阿扑吗啡(APO)90μg/kg(0.5mg/kg维生素C于中溶解阿朴吗啡后，与5mL/kg生理盐水混匀)，注射后立刻观察，计时器计时，观测并记录1800s(0.5h)内大鼠的勃起潜伏期和勃起次数。阴茎勃起的标准：勃起时大鼠呈蹲踞位，阴茎体末端伸出，低头舔舐阴茎头。勃起潜伏期为注射后至第一次勃起的时间。勃起次数为注射后1800s内大鼠出现阴茎勃起的次数。若1800s内未见勃起，则该大鼠勃起次数记为0,勃起潜伏期记为1800s。交配实验方法：将雄鼠和雌鼠(已进行发情期制备)分别置于不同的观察箱中适应环境，10～15分钟后按雌雄比例1:2放入同一个观察箱中，观测1800s内雄性大鼠的爬背、插入和射精潜伏期以及爬背、插入和次数。若1800s内雄性大鼠未进行爬背，则该大鼠爬背潜伏期记为1800s，爬背次数记为0。插入与射精行为同理。在本发明实施例中，首先建造正常对照组(N)、异常黏液质证候组(ZM)和异常黏液质型病证组(BM)大鼠。在本发明实施例中，对所述N组、ZM组和BM组大鼠的获取方法没有特殊的限制，采用本领域技术人员熟知的建立异常黏液质证候动物模型的技术方案即可；在本发明实施例中，优选具体包括以下步骤：选择性成熟期雌鼠，去势手术后常规条件下饲养，将所述雌鼠在发情期与雄鼠进行交配实验和APO实验测试，得到有正常性功能的雄鼠。本发明对所述交配实验和APO实验的时间顺序没有特殊限制。所述交配实验和APO实验的对象为所述正常对照组和造模组大鼠。在本发明实施例中，所述交配的具体步骤优选为将已进行发情期的雄鼠和雌鼠分别置于不同的观察箱中适应环境，10～15min后按雌雄比例1:2放入同一个观察箱中，观测1800s内雄性大鼠的爬背、插入和射精潜伏期以及爬背、插入和次数，若1800s内雄性大鼠未进行爬背，则该大鼠爬背潜伏期记为1800s，爬背次数记为0；插入与射精行为同理。本发明根据所述交配的结果将具有正常交配能力的雄鼠纳入正常对照组和造模组，对无正常交配能力雄鼠进行淘汰。在本发明实施例中，所述APO实验具体步骤优选为将实验大鼠置于观察箱中10～15min适应环境，保持安静，调暗灯光，在大鼠颈项皮肤注射90μg/kg阿扑吗啡APO，注射后立刻观察，计时器计时，观测并记录1800s内大鼠的勃起潜伏期和勃起次数；所述勃起的标准为勃起时大鼠呈蹲踞位，阴茎体末端伸出，低头舔舐阴茎头；所述勃起潜伏期为注射后至第一次勃起的时间；所述勃起次数为注射后1800s内大鼠出现阴茎勃起的次数；若1800s内未见勃起，则该大鼠勃起次数记为0，勃起潜伏期记为1800s。本发明实施例中根据所述APO测试的结果将具有正常阴茎勃起功能的雄鼠纳入正常对照组和造模组，对无正常阴茎勃起功能雄鼠进行淘汰。在本发明实施例中，所述90μg/kg阿扑吗啡溶液优选包括90μg阿朴吗啡溶解于0.5mg/kg维生素C和生理盐水中，调整体积为5ml/kg。在本发明实施例中，所述正常对照组在常规环境中饲养，喂食的环境温度为18～22℃，所述喂食环境的相对湿度为40～60％；造模组的喂食的环境温度为8～12℃，所述喂食环境的相对湿度70～80％；正常对照组为普通饲料，造模组喂食饲料为湿寒性饲料。在本发明实施例中，所述生物学表征观测是指定性和定量观测和记录。定性指标观测：所述定性指标观测为皮肤毛发在日光下观察，情绪反应以一笼内各大鼠相互反应为主观察30分钟，行为状态以此期间内的活动为主、安静环境下观察30分钟，兴奋程度以夹尾实验时的反应为主，舌象舌苔在日光下观察、记录并拍照，饮食水状态以各组同一时间喂饲观察饮食水状态，小便以各组大鼠当日正排尿时颜色为主，大便状态以当日正排大便时大便形态为主；定量指标为避免生理节奏的影响，每天固定于20:00-22:00收集各项资料，其中体重：每天按规定时间称重并记录，以每笼总体重除以该笼大鼠只数，得出平均体重，并按下述公式得出模型组各笼体重比值并记录，体重比值＝模型组平均体重-模型组初始体重/正常组平均体重-正常组初始体重；饮食量：每天20:00添加饲料300g，次日20:00称食物余量，根据下述公式得出100g体重相对应的饮食量并记录；饮水量：每天20:00给水500ml，次日20:00量剩余水量，计算得出100g体重相对应的饮水量并记录；尿量：造模第一天记录好给的干垫料重量，第二天按规定时间称含有尿液及大便的湿垫料的重量并记录，然后在恒温鼓风干燥箱100℃下2小时烘干后再次称重，计算各组尿量；大便量：计算100g体重相对应的大便量并记录。得到有正常性功能(正常交配能力和阴茎勃起功能)的雄鼠后，本发明将得到的有正常性能的雄鼠分为正常对照组和造模组，所述正常对照组在常规环境下饲养，所述造模组以湿寒性饲料喂养，在湿寒环境中饲养，观察并记录正常组和造模组的生物学表征观。包括定性指标和定量指标。定性指标观测所有组大鼠的皮肤毛发、情绪反应、兴奋程度、睡眠状态、饮水状态、尿量性质、大便状态和舌象舌苔。定量指标为记录所有组大鼠的体重、饮食量、饮水量、尿量和大便量。在造模过程中发现大鼠皮肤毛发稍暗淡，无光泽；倦怠，蜷卧少动；对刺激敏感，喜扎堆，倦怠嗜睡；无争水现象；尿量清，色淡，量多；大便时软时溏；舌苔暗，舌苔白腻。且随着造模时间的延长，造模组体重增长缓慢，饮食量增加，饮水量减少，大小便量显著增多，上述生物学表征符合维医临床证侯特点，从而获得了异常黏液质证侯大鼠模型，且该模型具有良好的科学性、可靠性和稳定性。通过APO和交配实验从证候模型组中筛选出异常黏液质型阳痿病证结合模型(阴茎勃起功能障碍和无交配能力)，从而获得异常黏液质型阳痿病证动物模型。本发明对所述证候成模率达100％，病证模型成模率达到50％以上，病证模型的周期优选为22～25周。在本发明实施例中，所述N组的大鼠数量优选为10只。在本发明实施例中，所述常规环境下饲养的方法同上步骤中的常规环境饲养方法。本发明中，所述N组的喂养量优选为每日300g的普通饲料。所述普通饲料为包括500ml水和80g垫料。本发明对所述垫料没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的垫料即可。本发明中，所述的实验组的大鼠的数量优选为20只。本发明中，所述的湿寒性饲料为菠菜实和芫荽实与常规饲料的混合物。在本发明实施例中，所述湿寒性饲料优选为：每1kg常规饲料中包括100～200g芫荽实和100～200g菠菜实，更优选每1kg常规饲料中包括150g芫荽实和150g菠菜实。本发明对常规饲料没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的用于饲养大鼠的饲料均可。本发明对所述菜实与芫荽实的来源也没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的菜实与芫荽实即可。在本发明实施例中，所述菜实与芫荽实的来源购自于新疆维吾尔自治区维吾尔医院草药房。本发明中，所述的湿寒性饲料的喂养量优选为每日300g。本发明中，所述湿寒环境的温度优选为8～12℃，所述湿寒环境的湿度优选为70～80％。本发明对提供所述湿寒环境的设施没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的提供湿寒环境的设施即可。本发明中实例中，提供湿寒环境的设施为人工气候箱。本发明中，所述湿寒性饲料喂养的时间优选为于北京时间09:00至21:00放入，其它时间放置于对照大鼠相同的饲养环境中饲养。本发明中，所述APO实验和交配实验的方法和验证结果同上述APO实验和交配实验的方法和验证结果。本发明对所述采血前优选对大鼠进行麻醉。本发明对所述麻醉的方法没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的麻醉方法即可。本发明实施例中，所述的麻醉方法为腹腔注射。本发明对所述麻醉过程中使用的麻醉剂优选为戊巴比妥钠。所述的戊巴比妥钠的来源购自和田维吾尔药业有限责任公司。在本发明实施例中，所述采集外周血的具体方法优选为将麻醉后的大鼠快速从腹主动脉取血。在本发明实施例中，所述分离血清的方法优选为将新鲜大鼠全血立即置4℃环境，30～40min后以3000～3500rpm的速度离心5～10min，将得到的上清液在4℃条件下，以3000～3500rpm的速度再次离心，得到血清，将最终离心得到的血清放置于-80℃超低温冰箱备用。所述的4℃环境优选为4℃冰箱。得到阴茎平滑肌组织的方法具体是：从根部取阴茎平滑肌组织，洗去血渍，并除去残余皮肤、筋膜，取上段阴茎平滑肌组织，放置于冻存管中放置于-80℃超低温冰箱备用。得到血清和阴茎平滑肌组织后，本发明实施例对血清和组织中提取蛋白质，检测，得到已知浓度血清和阴茎平滑肌组织蛋白质。本发明实施例中，在提取蛋白前优选按照组别分别进行混样，得到三组血清样品和三组阴茎平滑肌组织样品。本发明实施例对所述提取蛋白质的方法没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的提取蛋白质的方法即可。本发明实施例中，所述提取蛋白质的方法为TCA-丙酮沉淀法。本发明实施例中，所述检测优选包括对蛋白质含量的检测和对蛋白质完整性的检测。本发明实施例中，所述对蛋白质含量的检测方法优选为Bradford法，所述对蛋白质完整性的检测方法优选为SDS-PAGE法。得到已知浓度的蛋白质后，本发明实施例对所述蛋白质用iTRAQ标记试剂盒标记，得到标记的蛋白质，经纯化，得到纯化后肽段。在本发明实施例中，在所述标记前优选将得到的已知浓度的蛋白质进行消化。本发明实施例对所述消化的方法没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的蛋白质消化方法即可。在本发明实施例所述消化采用胰蛋白酶消化法。本发明实施例对所述iTRAQ标记试剂盒的来源没有特殊的限制，采用本领域技术人员熟知的iTRAQ标记试剂盒的市售商品即可。本发明实施例使用的试剂盒为Reagent-8PlexMultiplexKit(AppliedBiosystem)8标iTRAQ试剂，其中包括8种等量的同位素试剂(报告基团质量113-121，不包括120)，能对蛋白质酶解后肽段进行标记，从而结合串联质谱等方法，可以对肽段进行精确鉴定和定量。在本发明实施例中，所述纯化优选采用HPLC进行肽段的纯化。所述进行纯化的仪器采用型号为(发明人提供)安捷伦常规液相。本发明实施例中使用SCX强阳离子交换柱分离，在pH＝3磷酸缓冲液中，使用20％-30％的梯度洗脱液(10mMKH2PO4,2MKCl,25％ACN，pH＝3)，洗脱条件和梯度参考仪器和耗材具体操作说明即可，洗脱消化后的肽段。洗脱后的跳段使用C18反相色谱脱盐处理。得到纯化肽段后，本发明实施例对所述纯化的肽段经质谱检测后得到质谱总图，将所述指纹图谱在PD软件中筛选，在本发明实施例中，所述质谱检测的仪器采用型号为ThermofisherQ-Exactive的质谱仪。在本发明实施例中，所述PD软件的版本为ProteomeDiscoverer1.3，购自美国thermo公司。本发明实施例中，质谱筛选的参数如下：母离子质量范围350Da-6000Da二级质谱图中最小峰数10信噪比S/N域值1.5PD提取后的谱图，用mascot搜索，得到搜索结果，使用PD软件根据mascot搜索结果和第一步筛选后的谱图进行定量分析。定性检索参数如下：注：Fixedmodification是固定修饰；Carbamidomethyl(C)是还原烷基化处理后，半胱氨酸产生的脲甲基化。Variablemodification是可变修饰；Oxidation(M)是蛋氨酸的氧化；Gln→Pyro-Glu(N-termQ)是指肽段N端存在谷氨酰胺时，可能会产生自身环化，变成谷氨酸；iTRAQ8plex(K)，iTRAQ8plex(Y)，iTRAQ8plex(N-term)是iTRAQ试剂在不同位置的结合。peptidetol是一级质谱的精度。MS/MStol是二级质谱的精度。Maxmissedcleavages是酶解时最大允许漏切的数目。Enzyme是实验所使用的酶种类。Database是检索使用的数据库。Timefilescompressed为数据库建立时间。Numberofsequences为数据库中序列数。定量检索参数如下：注:ProteinratioType：用来定量的肽段取值方法，median指的是取中位置的方法。Minimumpeptides：用来定量的最少的uniquepeptide数Normalisationmethod：矫正方法，median指的是选取一组样品中全部可定量蛋白的中位值来做矫正。P-value蛋白可信度评估，小于0.05代表蛋白可信度大于95％。根据所述搜索结果和筛选后的谱图定量分析，得到的分析数据在大鼠数据库Uniprot-2014-rat(血清)和Uniprot-2015-rat(组织)中检索，血清总蛋白为318种，组织总蛋白为844种，FDR<1％，具体见下表。注：Allspectra为全部的谱图数；Matchedspectra为匹配上的谱图数；Peptide为肽段种类数；ProteinGroup为匹配上的蛋白总数；FDR为假阳性率，本实施例使用的是假阳性率小于1％来过滤结果。按照软件操作规程，使用相同参数及方法，鉴定筛选获得大鼠血清蛋白质318种和阴茎平滑肌组织蛋白844种。得到的三组(N、ZM和BM)血清和组织蛋白质后，本发明实施例对所述三组蛋白质进行维医异常黏液质型阳痿病证的哺乳动物血清差异蛋白和阴茎平滑肌组织差异蛋白的筛选。本发明实施例对所述异常黏液质型病证组血清和阴茎平滑肌组织差异蛋白蛋白的差异蛋白的筛选方法具体是：所述BM组与ZM组的血清蛋白质相比较，得到BM/ZM的血清差异蛋白质；将BM组的与N组的血清蛋白质相比较，得到BM/N的血清差异蛋白质；统计所述BM/ZM和BM/N的差异蛋白的共同蛋白的种类和数量，得到异常黏液质型阳痿病证组的血清差异蛋白质；所述BM组和与ZM组的阴茎平滑肌蛋白质相比较，得到BM/ZM组阴茎平滑肌差异蛋白质；将BM组的蛋白质与N组的阴茎平滑肌蛋白质相比较，得到BM/N的阴茎平滑肌组织差异蛋白质；统计所述BM/ZM组和BM/N组的差异蛋白的共同蛋白的种类和数量，得到异常黏液质型阳痿病证组的阴茎平滑肌组织差异蛋白质；以下通过具体实施例进一步说明本发明的技术方案。实施例11、造模与分组选用性成熟期雌鼠15只，去势手术后正常条件下饲养，交配实验备用。将雄性大鼠经与发情期雌鼠进行交配试验并结合APO勃起实验证实其具有正常性功能(无正常性功能者淘汰)，取30只进入实验，从中再随机抽取10只大鼠设为正常对照组，饲养于常规环境下，温度18～22℃，温度喂养，环境相对湿度40～60％，余20只为造模组，以湿寒性饲料喂养，按维吾尔医学对环境的看法采用人工气候箱进行造模，设置温度：8～12℃，湿度为70～80％，12/12小时昼夜交替饲养，其它时间放置于正常组大鼠相同的饲养环境中饲养。当造模组鼠出现皮肤毛发稍暗淡，无光泽；倦怠，蜷卧少动；对刺激敏感，喜扎堆，倦怠嗜睡；无争水现象；尿量清，色淡，量多；大便时软时溏；舌苔暗，舌苔白腻。且随着造模时间的延长，与对照组相比，造模组体重增长缓慢，饮食量增加，饮水量减少，大小便量显著增多，上述生物学表征符合维医临床证侯特点，从而获得了异常黏液质证侯大鼠模型，且该模型具有良好的科学性、可靠性和稳定性。通过APO和交配实验从证候模型组中筛选出无阴茎勃起功能和交配能力雄性大鼠，获得异常黏液质型阳痿病证动物模型。本发明对所述模率达到50％,以上病证模型的周期优选为22～25周。从造模第一周开始每周记录大鼠的生物学表征，根据生物学表征确定异常黏液质证候模型成模情况，本发明对所述证候模率达到100％的周期优选为8-10周。并在此基础上，每月进行一次APO实验及交配实验，APO实验通过统计勃起的次数和勃起潜伏期，判断阴茎勃起功能，交配实验通过统计爬被潜伏期/次数、插入潜伏期/次数和射精潜伏期/次数这几项指标判断大鼠的交配能力，当出现阴茎勃起功能障碍和交配能力障碍，即阳痿病证成模率达到50％以后，从异常黏液质证候模型组中通过APO实验及交配实验筛选阳痿病证大鼠，并纳入BM组，余为ZM组。2、外周血采集、组织样品取材与保存：戊巴比妥钠腹腔麻醉后，快速从腹主动脉取血，将新鲜大鼠全血立即置4℃冰箱，30分钟后以3000rpm的速度离心5min，吸取上清液，再置高速低温离心机，在4℃条件下，以3000rpm的速度离心再吸取上清液后，分装置-80℃低温冰箱保存备用。从根部取阴茎平滑肌组织，洗去血渍，并除去残余皮肤、筋膜，取上段阴茎平滑肌组织，放置于冻存管中放置于-80℃超低温冰箱备用。3、蛋白质组样品的制备蛋白质提取方法采用TCA-冰丙酮提取。4、iTRAQ标记及HPLC(1)iTRAQ标记：取各组大鼠血清和阴茎平滑肌组织，按组别混样后，提取各组蛋白质，通过SDS检测蛋白的完整性及使用Bradford法对蛋白进行定量。蛋白质经Trypsin消化后用ITRAQ标记试剂盒(Reagent-8PlexMultiplexKit(AppliedBiosystem))进行标记，后经HPLC(安捷伦常规液相)进行肽段的纯化；三组大鼠的血清蛋白质的浓度如表1所示，组织蛋白质的浓度如表2所示。从附图3中SDS-PAGE凝胶电泳图片来看，提取的三组蛋白质完整性较好，可以用于下游实验。表1Bradford法对大鼠血清蛋白进行定量结果样品名称NBMZM浓度(μg/μL)0.260.390.42表2Bradford法对大鼠阴茎平滑肌组织蛋白进行定量结果样品名称NBMZM浓度(μg/μL)1.751.291.46定量后，将各组蛋白质消化后，用ITRAQ标记试剂盒。液相纯化后的肽段经质谱(ThermofisherQ-Exactive质谱仪)检测后获得指纹图谱，将质谱图输入到PD(ProteomeDiscoverer1.3，thermo)软件后，软件先对质谱谱图进行筛选鉴定，种类，名称，PD提取后的谱图用mascot进行搜索，搜索结束后，PD软件根据mascot搜索结果和第一步筛选后的谱图进行定量分析，最后检索大鼠数据库，获得最终鉴定到大鼠血清和阴茎平滑肌组织蛋白质分别为318种和844种，具体参数如下。本发明实施例中，质谱筛选的参数如下：母离子质量范围350Da-6000Da二级质谱图中最小峰数10信噪比S/N域值1.5PD提取后的谱图，用mascot搜索，得到搜索结果，使用PD软件根据mascot搜索结果和第一步筛选后的谱图进行定量分析。定性检索参数如下：注：Fixedmodification是固定修饰；Carbamidomethyl(C)是还原烷基化处理后，半胱氨酸产生的脲甲基化。Variablemodification是可变修饰；Oxidation(M)是蛋氨酸的氧化；Gln→Pyro-Glu(N-termQ)是指肽段N端存在谷氨酰胺时，可能会产生自身环化，变成谷氨酸；iTRAQ8plex(K)，iTRAQ8plex(Y)，iTRAQ8plex(N-term)是iTRAQ试剂在不同位置的结合。peptidetol是一级质谱的精度。MS/MStol是二级质谱的精度。Maxmissedcleavages是酶解时最大允许漏切的数目。Enzyme是实验所使用的酶种类。Database是检索使用的数据库。Timefilescompressed为数据库建立时间。Numberofsequences为数据库中序列数。定量检索参数如下：参数名称实验选项ProteinratioTypemedianMinimumpeptides1NormalisationmethodmedianP-value<0.05注:ProteinratioType：用来定量的肽段取值方法，median指的是取中位置的方法。Minimumpeptides：用来定量的最少的uniquepeptide数Normalisationmethod：矫正方法，median指的是选取一组样品中全部可定量蛋白的中位值来做矫正。P-value蛋白可信度评估，小于0.05代表蛋白可信度大于95％。根据所述搜索结果和筛选后的谱图定量分析，得到的分析数据在大鼠数据库(Uniprot-2014-rat(血清)和Uniprot-2015-rat(组织))中检索，获得血清总蛋白为318种，组织总蛋白844种，FDR<1％，具体见下表。注：Allspectra为全部的谱图数；Matchedspectra为匹配上的谱图数；Peptide为肽段种类数；ProteinGroup为匹配上的蛋白总数；FDR为假阳性率，本实施例使用的是假阳性率小于1％来过滤结果。按照软件操作规程，使用相同参数及方法，鉴定筛选获得大鼠血清蛋白质318种，组织蛋白844种。5、维医异常黏液质型阳痿病证大鼠模型血清及组织候选差异蛋白的筛选方法(1)维医异常黏液质型阳痿病证大鼠模型血清差异蛋白的筛选方法将BM组与ZM组的血清蛋白质相比较，使用上述软件(取差异大于等于1.2倍，p值小于等于0.05)，比较得到BM/ZM的血清差异蛋白质；将BM组与N组的血清蛋白质相比较，，使用上述软件(取差异大于等于1.2倍，p值小于等于0.05)，得到BM/N的血清差异蛋白质；统计所述BM/ZM和BM/N的差异蛋白的共同蛋白的种类和数量，得到异常黏液质型病证组的血清差异蛋白质共计35种，如下表3，其中上调表达蛋白31种，下调表达蛋白4种：表3异常粘液质型阳痿病证大鼠模病证组血清差异蛋白(2)维医异常黏液质型阳痿病证大鼠模型阴茎平滑肌组织差异蛋白的筛选方法使用上述软件(取差异大于等于1.2倍，p值小于等于0.05)，将BM组与ZM组的阴茎平滑肌组织蛋白质相比较，得到BM/ZM的阴茎平滑肌组织差异蛋白质；将BM组与N组的阴茎平滑肌组织差异蛋白质相比较，得到BM/N的阴茎平滑肌组织差异蛋白质；统计所述BM/ZM和BM/N的差异蛋白的共同蛋白的种类和数量，得到异常黏液质型病证组的阴茎平滑肌组织差异蛋白质共计48种，其中上调表达蛋白35种，下调表达蛋白13种。如表4所示：表4异常粘液质型阳痿病证大鼠模型组织病证组候选差异蛋白6、异常粘液质型阳痿病证大鼠模型血清候选差异蛋白的ELISA检测随机选择7种血清候选差异蛋白，对异常黏液质型阳痿病证大鼠模型与对照组进行ELISA检测，以验证本发明血清候选差异蛋白是否可以作为异常黏液质型阳痿病证的标志物：即随机选择检测第11号蛋白P48199(c反应蛋白)；第13号蛋白P26644(β-2-糖蛋白1)；第15号蛋白P20059(血红素结合蛋白)；第24号蛋白P04916(视黄醇结合蛋白4)；第26号蛋白P02767(甲状腺素运载蛋白)；第27号蛋白P02764(α-1-酸性糖蛋白)和第33号蛋白O35460(血管生成素-1)分别使用双抗夹心试剂盒(大鼠C反应蛋白(CRP)双抗夹心试剂盒：伊莱瑞特生物科技有限公司；大鼠β2糖蛋白1(APOH)双抗夹心试剂盒：武汉优尔生商贸有限公司；大鼠血红素结合蛋白(HPx)双抗夹心试剂盒：Abcam艾博抗(上海)贸易有限公司；大鼠视黄醇结合蛋白4(RBP4)双抗夹心试剂盒：伊莱瑞特生物科技有限公司；大鼠甲状腺素运载蛋白(TTR)双抗夹心试剂盒：Abnova亚诺法生技股份有限公司；大鼠α1酸性糖蛋白(α1AG)双抗夹心试剂盒：Abcam艾博抗(上海)贸易有限公司；大鼠血管生成素1(Ang-1)双抗夹心试剂盒：Raybiotech瑞博奥(广州)生物科技有限公司；按照试剂盒说明书对正常对照组和病证组大鼠血清进行ELSA检测。测定结果如图4A-G所示，由图4可知，各个异常黏液质型阳痿病证大鼠模型血清候选蛋白中除血管生成素-1的含量显著低于对照组外，其它蛋白质含量均显著高于对照组，这与iTRAQ结果相符，说明本发明方法获得蛋白标志物可以作为异常黏液质型阳痿病证的血清的生物标志物。与iTRAQ结果相符，说明可以作为异常黏液质型阳痿病证血清的生物标志物，具体结果见下表：各组大鼠血清中蛋白含量与N组相比*P<0.057.异常粘液质型阳痿病证大鼠模型阴茎平滑肌免疫组织化学检测随机选择4种阴茎平滑肌组织候选差异蛋白，对异常黏液质型阳痿病证大鼠与对照组大鼠阴茎平滑肌组织进行免疫组织化学检测，以验证本发明组织中的候选差异蛋白是否可以作为异常黏液质阳痿病证的标志物：即随机选择检测第12号蛋白Q9Z2L0(电压依赖性阴离子选择性通道蛋白1)；第30号蛋白P02625(小清蛋白α)；第36号蛋白P04904(谷胱甘肽S-转移酶α-3)和第44号蛋白P47853(双链蛋白聚糖)分别使用上述蛋白的抗体(所有抗体均购置于Abcam(上海)贸易有限公司)，按照抗体说明书对正常对照组和病证组大鼠阴茎平滑肌组织进行检测。运用光学显微镜观察并统计结果。照片放大倍数为物镜倍数×目镜倍数。染色结果计数方法如下：在放大倍数为400的情况下，每个样本随机选择6-10个视野，各视野之间完全不重叠，计数阳性细胞，每组一般为10个不同样本，随后进行组间的比较。评分方法分为两个方面，即阳性范围和着色强度。其中阳性细胞所占视野中的百分比为阳性范围5％-100％；阳性细胞染色的深浅为着色强度，分为4个等级，即0(几乎不着色或者稍微有一点着色)、1(有着色，但比较浅)、2(有着色，比较深)、3(有着色，非常深)；最终结果为(阳性范围×着色强度)/视野个数。测定结果如表5所示，由表5可知，各个异常黏液质型阳痿病证大鼠模型的阴茎平滑肌组织候选蛋白中电压依赖性阴离子选择性通道蛋白1和小清蛋白α的含量显著高于正常对照组，谷胱甘肽S-转移酶α-3和双链蛋白聚糖的含量显著低于正常对照组，这与iTRAQ结果相符，说明本发明方法获得蛋白标志物可以作为异常黏液质型阳痿病证的阴茎平滑肌组织的生物标志物。表5各组大鼠阴茎组织中蛋白表达结果*与N比较<0.05以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。当前第1页1 2 3