一种猪瘟病毒快速检测试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种猪瘟病毒快速检测试剂盒,属于病毒检测领域。本发明通过设计的可检测猪瘟病毒的通用引物，并将PT-PCR技术与核酸胶体金免疫层析技术相结合，建立的适用于猪瘟病毒的快速检测试剂盒。本发明设计和优化了一种检测猪瘟病毒的通用引物，并与核酸胶体金层析试纸条技术联用在短时间内即可完成不同种锦紫苏类病毒的PCR产物的检测，不需要电泳和溴化乙锭的染色，更为快速实用，简单，灵敏，且安全无污染。
【专利说明】一种猪瘟病毒快速检测试剂盒
【技术领域】
[0001]本发明属于病毒检测领域，具体涉及一种猪瘟病毒快速检测试剂盒。
【背景技术】
[0002]猪痕病毒是ssRNA病毒,黄病毒科痕病毒属，其RNA为单股正链。病毒粒子呈圆形，大小为38~44nm,核衣壳是立体对称二十面体,氯化铯中浮密度1.15~1.17g/ml,有包膜。猪瘟病毒在细胞质内复制，不能凝集红血球，与牛腹泻病毒有相关抗原。该病毒对乙醚敏感，对温度、紫外线、化学消毒剂等抵抗力较强。
[0003]利用RT-PCR检测类病毒是一种非常灵敏的方法。通常RT-PCR灵敏度比cRNA探针的斑点杂交灵敏度高10-100倍(Nakahara et al, 1999)。RT-PCR对模板的纯度要求高，如果检测样品中存在扩增抑制物的话，将很难扩增出目的条带，尤其是果树类的材料，含有大量的多酚类和糖类等。糖类一般可以用乙二醇单甲醚来去除。PVP能有效束缚酚类化合物，在PCR混合物中加入PVP能有效地除去从组织中制备的RNA中的阻遏物(Koonjul etal, 1999)。但是PCR产物的检测常规方法是采用琼脂糖凝胶电泳进行，电泳后需要进行溴化乙锭染色后在紫外光下观察，溴化乙锭对人具有中等毒性和致癌性，易造成环境污染，这也严重限制了此方法的推广。
【发明内容】
[0004]本发明的目的正是针对上述现有技术所存在的问题而专门研制的一种猪瘟病毒的快速检测试剂盒，快速，灵敏，准确检测出带有锦紫苏类病毒的植株。
[0005]本发明的试剂盒主要由以下几种试剂和层析试纸条组成:
试剂A:病毒RNA提取液，由常规现有技术的RNA提取液构成；
试剂 B:包括 10XOne step RNA PCR buffer, MgCl2, DNTP Mixture, RNase Inhibitor,AMV-Optimized Taq, AMV RTase,正向引物,反向引物，所述正向引物,反向引物分别标记了地高辛、荧光素，所述正向引物(F-primer)序列为5’ -ACGGAGGGACTAGCCGTAGTG-3’，
反向引物(R-primer)序列为 5’ -CTGTTAGTGGGCCTCTGCAGC-3’ ；
试纸条:由玻璃纤维膜、NC膜、吸水纸和双面胶塑料板组成，硝酸纤维素膜(NC膜)粘贴在双面胶塑料板上，玻璃纤维膜和吸水纸分别粘贴在NC膜的两侧并且与NC膜有部分重叠；NC膜上有T点(检测点)和C点(质控点)，T点位于靠近玻璃纤维膜的一侧，玻璃纤维膜上固定有胶体金标记的兔抗地高辛抗体，T点固定的是鼠抗荧光素抗体，C点固定的是羊抗兔多克隆抗体。
[0006]本剂盒中试纸条中所述的胶体金标记的兔抗地高辛抗体的溶液配制方法为:
(1)取纯化好的兔抗地高辛多克隆抗体300μ g，在磁力搅拌下缓慢加入胶体金溶液18mL,室温搅拌30 min ；
(2)加入10%牛血清白蛋白ImL，室温搅拌5 min ；
(3)加入10%聚乙二醇0.4 mL,室温搅拌5 min ；(4)12,000 r/min,离心30 min,去上清,加入2 mL保存液(取四硼酸钠0.1 g, BSA 0.25g，溶于250 mL蒸懼水)悬浮沉淀；
(5)加入8 mL 稀释液(取 Na2HP04 ?12Η20 6.1 g，NaCl 8.5 g，PVP40 5 g，硼酸 2.1 g，PEGI g, 10% BSA 50 mL，溶于1000 mL蒸馏水)，取小量进行检定，其余置4°C保存。
[0007]上述步骤(1)中的胶体金溶液的制备法如下:
a.取1%氯金酸0.6 mL,加30 mL超纯水加热煮沸；
b.加37°C预热的1%柠檬酸钠溶液0.9 mL，快速一次加入，溶液由蓝逐渐变为紫红色，煮沸3-5 min,补水至总体积31.5 mL ；
c.冷却后，用0.2mol/LK2C03调pH至8.0-9.0，用0.45 μ m滤膜过滤，4°C保存。
[0008]本试剂盒中试纸条玻璃纤维素膜上固定有胶体金标记的兔抗地高辛多克隆抗体，T点上喷有鼠抗荧光素单克隆抗体；c点上喷有羊抗兔多克隆抗体。
[0009]本发明的优点是:设计和优化了一种检测猪瘟病毒的通用引物，并与核酸胶体金层析试纸条技术联用，设计成试剂盒，在短时间内即可完成不同种锦紫苏类病毒的PCR产物的检测，不需要电泳和溴化乙锭的染色，更为快速实用，简单，灵敏，且安全无污染。 [0010]
【具体实施方式】
[0011]1.样品RNA的提取:
将患病仔猪组织病料充分研磨制成悬浮溶液，反复冻溶3次，离心取上清，加入试剂A，抽提RNA作为模板进行RT-PCR扩增待检测液。
[0012]2.RT-PCR:
取一定量待检测液，加入试剂B，反应条件为50°C 15 min ；94°C 2 min使RTase失活；94°C预变性 2min ;然后以 94°C 30s,56°C 30 s、72°C I min 进行 35 个循环；72°C延伸 lOmin。反应结束，取5微升PCR产物待用。正向引物，反向引物分别标记了地高辛、荧光素。
[0013]3.PCR产物的胶体金核酸免疫层析检测:
在试纸条抗体固相硝酸纤维素层析膜(NC膜)上靠近玻璃纤维素膜的一端点上I μ L的小鼠抗荧光素单克隆抗体作为检测点(Τ点)，并固定。在NC膜上靠近吸水纸一端点上Iμ L羊抗兔多克隆抗体作为质控点(C点)，并固定。
[0014]在离心管中加入200 μ L PBS缓冲液，然后加入5 μ L的标记地高辛和荧光素引物的PCR产物。插入试纸条,15 min内观察显色结果。
[0015]T点显色:检测时，将PCR产物链上标记的地高辛能够和兔抗地高辛多克隆抗体结合，形成胶体金-兔抗地高辛抗体-PCR产物复合物；而PCR产物链上标记荧光素可以和T点上小鼠抗荧光素单克隆抗体结合，则层析时该复合物可以被T点所捕获，形成胶体金-兔抗地高辛抗体-PCR产物-小鼠抗荧光素单克隆抗体的结构而使T点显色。
[0016]C点显色:试纸条的C点上喷上羊抗兔多克隆抗体，则能形成胶体金-兔抗地高辛抗体-羊抗兔多克隆抗体或胶体金-兔抗地高辛多克隆抗体-(PCR产物)-羊抗兔多克隆抗体的复合物。检测带毒材料时，形成的胶体金-兔抗地高辛多克隆抗体-PCR产物先被T点上荧光素抗体所捕获，多余的复合物或没有完全被T点捕获的，则被随后的C点所捕获形成胶体金-兔抗地高辛多克隆抗体-(PCR产物)-羊抗兔多克隆抗体的复合物使C点显色。而检测健康的材料或缓冲液时，C点所捕获的只是胶体金-兔抗地高辛多克隆抗体，形成胶体金-兔抗地高辛多克隆抗体-羊抗兔多克隆抗体而显色。
[0017]因此，如果C、T点都显色，结果为阳性；阴性和空白对照应仅C点显色，T点不显色，结果为阴性和空白对照。C，T点都不显色，则试剂条失效，结果不能判定。
【权利要求】
1.一种猪瘟病毒的快速检测试剂盒，其特征在于，主要由以下几种试剂和层析试纸条组成: 试剂A:病毒RNA提取液，由常规现有技术的RNA提取液构成；
试剂 B:包括 10XOne step RNA PCR buffer, MgCl2, DNTP Mixture, RNase Inhibitor,AMV-Optimized Taq, AMV RTase,正向引物,反向引物，所述正向引物,反向引物分别标记了地高辛、荧光素，所述正向引物(F-primer )序列为5 ’ -ACGGAGGGACTAGCCGTAGTG-3 ’， 反向引物(R-primer)序列为 5’ -CTGTTAGTGGGCCTCTGCAGC-3’ ； 试纸条:由玻璃纤维膜、NC膜、吸水纸和双面胶塑料板组成，硝酸纤维素膜(NC膜)粘贴在双面胶塑料板上，玻璃纤维膜和吸水纸分别粘贴在NC膜的两侧并且与NC膜有部分重叠；NC膜上有T点(检测点)和C点(质控点)，T点位于靠近玻璃纤维膜的一侧，玻璃纤维膜上固定有胶体金标记的兔抗地高辛抗体，T点固定的是鼠抗荧光素抗体，C点固定的是羊抗兔多克隆抗体。
2.如权利要求1所述的猪瘟病毒的快速检测试剂盒，其特征在于:所述的胶体金标记的兔抗地高辛抗体的溶液配制方法为: (1)取纯化好的兔抗地高辛多克隆抗体300μ g，在磁力搅拌下缓慢加入胶体金溶液18mL,室温搅拌30 min ； (2)加入10%牛血清白蛋白ImL，室温搅拌5 min ； (3)加入10%聚乙二 醇0.4 mL，室温搅拌5 min ； (4)12,000 r/min,离心30 min,去上清,加入2 mL保存液(取四硼酸钠0.1 g, BSA 0.25g，溶于250 mL蒸懼水)悬浮沉淀；
(5)加入8 mL 稀释液(取 Na2HP04 ?12Η20 6.1 g，NaCl 8.5 g，PVP40 5 g，硼酸 2.1 g，PEGI g, 10% BSA 50 mL，溶于1000 mL蒸馏水)，取小量进行检定，其余置4°C保存。
3.如权利要求2所述的猪瘟病毒的快速检测试剂盒，其特征在于，所述胶体金溶液的制备法如下: a.取1%氯金酸0.6 mL,加30 mL超纯水加热煮沸； b.加37°C预热的1%柠檬酸钠溶液0.9 mL，快速一次加入，溶液由蓝逐渐变为紫红色，煮沸3-5 min,补水至总体积31.5 mL ； c.冷却后，用0.2mol/LK2C03调pH至8.0-9.0，用0.45 μ m滤膜过滤，4°C保存。
【文档编号】G01N33/577GK104034897SQ201410274790
【公开日】2014年9月10日 申请日期:2014年6月19日 优先权日:2014年6月19日
【发明者】李永锋, 陈国勇, 傅汝毅, 陶玲云, 蓝文苑 申请人:广西博士海意信息科技有限公司