一种结核分枝杆菌快速检测试剂盒及其使用方法
【技术领域】
[0001] 本
【发明内容】
为结核分枝杆菌快速检测试剂盒及其使用方法，属于生物体外诊断试 剂领域。
【背景技术】
[0002] 据世界卫生组织统计：全球1/3人口（约20亿）已感染了结核菌，全球现有结核病 人2000万，每年新发现病例约800-1000万。其中95%在发展中国家，15-50岁的青壮年病 人占发病数的75%。如不立即采取措施，预计今后10年内将有3亿人感染结核杆菌，目前结 核病死亡达历史最高水平，全球每天有8000人死于结核病；每年有300万人死于结核病，其 中98%的结核病死亡发生在发展中国家，因此结核病已成为严重危害人类健康的传染病之 〇
[0003] 结核分枝杆菌感染所致的结核病是当今世界上最普遍的人类传染病之一，其发病 率、病死率在全球范围内呈上升趋势，是严重危害人类健康的公共卫生问题.近年来，我国 结核病的流行十分严重，疫情下降缓慢，有些地区有回升的趋势，送些情况已引起我国学 者的高度重视。因此，我国已将结核病作为重点防治的传染病之一。然而，结核病的早期发 现主要依赖于实验室诊断技术。随着分子生物学技术的发展，结核病分子流行病学研究、耐 药性研究的新技术也逐步建立起来。分子生物学技术在结核病研究领域里的应用，使人们 能够对结核分枝杆菌进行更敏感、特异、快速、准确的检测和鉴定。
[0004] 20世纪90年代，Kary Millis发明了 PCR技术(聚合酶链反应)。作为分子生物 学领域的一项革命性突破，在过去的一个世纪里，W聚合酶链反应（PCR)为代表的基于核酸 的检测技术发展迅速，为其他病原体的精确检测诊断提供了可能，同时，PCR技术也在医学、 法学等领域发挥了重要的作用。经过几十年的改进，PCR方法已从定性发展为定量，能够在 几个小时内，从几个拷贝或单个细胞开始扩增到数十亿特异性的核酸片段，而且特异性也 有了极大的提高。然而，从PCR技术的诞生之日起，它始终无法摆脱依赖精良仪器设备的局 限，使得W PCR为基础的核酸扩增检测技术无法更广泛地推广和应用。
[0005] 90年代未核酸等温扩增技术不断涌现发展，包括核酸序列的扩增技术（NASBA)、 自动维持序列扩增（3SR)、链置换扩增技术（SDA)W及环介导等温扩增技术等。其中环介导 等温扩增技术因其具有灵敏度、特异性较高、反应时间短等优点，得到了越来越广泛的认同 和应用。
[0006] 基于送种强烈的需求，W核酸等温扩增技术（LAMP)为基础的检测技术近年来得到 了迅猛的发展。多种机制的等温技术不仅诞生，而且有些技术已经相当成熟，完成了从实验 室到实际应用的过渡，正逐步在分子生物学、医学、法学等领域得到广泛运用。特别是在临 床和现场（point-of-care)快速诊断技术方面，核酸等温扩增技术显示了其突出的优越性。 更为重要的是，核酸等温扩增技术由于不需要温度变化的时间过程且摆脱了对精良仪器设 备的依赖，可W使最先进的诊断技术在更为广泛基层地区得已实现，使得我们对病原体的 检测诊断得W快速并高通量的实现。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的是为临床检测肺结核提供一种检测灵敏度高、特异性强、检测时间 短、成本低的试剂盒产品。
[0008] 本发明的目的可W通过W下技术措施实现：一种结核分枝杆菌快速检测试剂盒， 其特征在于，所述的结核分枝杆菌检测试剂盒包括W结核分枝杆菌的重复序列为祀基因、 基于环介导等温扩增技术设计的两对引物：内引物FIP/BIP和外引物F3/B3 W及环引物 FLP/BLP，所述的两对引物为： F3(SEQIDN01) ：TCGGACCACCAGCACC B3 (SEQIDN02) ：GCGGGTCCAGATGGCTTG FIP(SEQIDN03) ： CACGTAGGCGAACCCTGCCCTTTTTAACCGGCTGTGGG TAGC BIP(SEQIDN04) ：CTTTGTCACCGACGCCTACGTCTTTTTCGCGTCGAGGACCATG 在具体实施过程中内引物中间4个链接T碱基可W去掉，变成如下四个引物： F3(SEQIDN01) ：TCGGACCACCAGCACC B3 (SEQIDN02) ：GCGGGTCCAGATGGCTTG FIP(SEQIDN05) ：CACGTAGGCGAACCCTGCCCTAACCGGCTGTGGGTAGC BIP(SEQIDN06) ：CTTTGTCACCGACGCCTACGTCTCGCGTCGAGGACCATG 所述的BstDNA聚合酶浓度为5-15U/ML，所述的反应液含；0. 1~2mmol/L dNTP、15~ 30mmol/L Tris-肥L、10 ~15mmol/L Κ化、8mmol/L (NH*)2S〇4、4 ~lOmmol/L Μ拆(?、0 ~ 0. 5体积％ TritonX-100、0. 8~1. 5mol/L甜菜碱，所述的样品预处理液含；10~25 mmol/ L P册.0 Tris-肥L、1~3mmol/L邸ΤΑ和1~1. 5体积％ TritonX-100,所述的显色液为 SYBRGreenI或可视化指示剂1- (1-居基-2-蔡偶氮）-6-硝基-2-蔡酪-4-礙酸钢或其衍 生物或4-(2-化巧偶氮）间苯二酪钢盐或其衍生物，所述内引物FIP/BIP浓度分别为0. 2~ 2帕〇1/1，外引物F3/B3浓度分别为0. 1~1帕ol/L。
[0009] 该方法包括如下步骤： (1) 将待测样品用氨氧化钢溶液液化，然后离必去上清，得到沉淀； (2) 将步骤（1)的沉淀加入50~100化样品预处理液，混合均匀，沸水浴中处理10分 钟左右，冰上冷却后高速离必，吸取上清即为待检测DNA样品； (3) 按照检测试剂盒配方将各反应组分依次加入反应孔，然后加入阴阳性质控品及待 巧Ij DNA样品，60~65°C恒温反应，反应时间为20-40min，所使用恒温检测设备既可W是恒 温英光定量PCR仪(与SYBRGreenI指示剂配套使用），也可W是恒温水浴(与可视化指示剂 1- (1-居基-2-蔡偶氮）-6-硝基-2-蔡酪-4-礙酸钢或其衍生物或4- (2-化巧偶氮）间苯 二酪钢盐或其衍生物配套使用）。
[0010] 与现有技术相比，本发明有W下有益效果： 1. 本发明涉及的结核支杆菌快速检测试剂盒特异性强，其有Η对引物，针对特异性革己 标的八个片段进行扩增，而结核分枝杆菌核酸扩增（PCR)英光检测试剂盒只有一对引物； 2. 本发明涉及的结核支杆菌快速检测试剂盒灵敏度高，可W检测到1-10个菌/1^，与 姨培养及临床资料结果一致，不存着假阳性问题； 3. 本发明涉及的结核支杆菌快速检测试剂盒的检测速度快，基因提取后扩增检测时 间不到1小时。成本低，也可W通过颜色变化判断扩增结果，不需要借助昂贵的Real-time PCR 仪。
[0011] 总之，结核分枝杆菌快速检测试剂盒特异性强、灵敏度高、检测速度快、成本低，可 W极大的缩小城乡检测水平的差距，极具推广前景。
[0012]
【具体实施方式】 为使本发明更容易理解，下面将进一步阐述本发明的具体实施方案： 引物由Invitrogen公司或者生工生物公司合成；Bst DNA Polymerase (large 化agment)购自肥B公司或Μ化AB公司；dNTP购自Invitrogen公司或者生物生物公司；SYBR Green I为英光定量PCR用；Μ拆〇4等化学试剂均为分析纯；1-(1-居基-2-蔡偶氮）-6-硝 基-2-蔡酪-4-礙酸钢或其衍生物或4- (2-化巧偶氮）间苯二酪钢盐或其衍生物均为分析 纯；结核分枝杆菌PCR检测试剂盒用国家参考品册准文号；（2010)国生参字0042号）购 自中国食品药品检定研究院。
[0013] 环介导引物为： F3(SEQIDN01) ：TCGGACCACCAGCACC B3 (SEQIDN02) ：GCGGGTCCAGATGGCTTG FIP (SEQIDN03) ：CACGTAGGCGAACCCTGCCCTTTTTAACCGGCTGTGGGTAGC BIP(SEQIDN04) ：CTTTGTCACCGACGCCTACGTCTTTTTCGCGTCGAGGACCATG BstDNA聚合酶浓度为8U/ML; 所述的反应液含；〇. 16mmol/L dNTP、20mmol/L Tris-肥L、10mmol/L K化、lOmmol/L (NH4)2S〇4、6mmol/L M拆〇4、0. 1 体积 ％ TritonX-100、lmol/L 甜菜碱； 所