一种手足口病病毒快速检测试剂盒及其应用
【技术领域】
[0001 ]本发明属于微生物检测技术领域，具体涉及一种专用于检测手足口病主要病原体 柯萨奇病毒A16型(COXA16)和肠道病毒71型(EV71)的核酸序列的检测试剂盒。
【背景技术】
[0002] 手足口病(Hand-foot-mouth disease,HFMD)是由多种肠道病毒引起的常见出疹 发热性急性传染病，以婴幼儿发病为主。引起手足口病的病毒主要由小RNA病毒科、肠道病 毒属的柯萨奇病毒(Coxasckie virus)A组的4、5、7、9、10、16型以及13组的2、5、13型、埃可病 毒(ECHO virus)和肠道病毒71型(EV71)引起，其中以EV71及CoxA16型最为常见，常相伴造 成手足口病的暴发或流行，EV71感染引起重症病例的比例较大。自20世纪60年代逐渐明确 其病原体以来，手足口病已在全世界范围内引起多次暴发或流行，累及地域广泛、人口众 多。大多数患者症状轻微，以发热和手、足、口腔等部位的皮疹或疱疹为主要特征。少数患儿 可出现中枢神经、呼吸系统损害，引发脑炎、急性弛缓性麻痹、脑水肿和心肌炎等，个别重症 患儿病情进展快，易发生死亡。少年儿童和成人感染后多不发病，但能够传播病毒。
[0003] 现有技术中手足口病病原体检测方法包括病毒分离与中和试验鉴定两步，大概要 一周以上的时间，而且步骤繁琐，费时费力。因此及时检测EV71和CoxA16,可为临床医生提 供必要的实验诊断依据。
[0004] 实时焚光定量PCR技术（Real-time quantitative Polymerase Chain Reaction 简称Real Time PCR)是在定性PCR技术基础上发展起来的核酸定量技术，在PCR反应体系中 加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过Ct值和标准曲线对样品 中的DNA(或cDNA)进行定量检测的方法。该技术不仅实现了对DNA/RNA模板的定量，而且具 有灵敏度和特异性高、能实现多重反应、自动化程度高、无污染、成本低廉等特点。目前已有 多种运用定量PCR技术的试剂盒应用于临床疾病相关的病原体检测、基因分型、突变研究 等。
【发明内容】
[0005] 本发明要解决的技术问题是，提供一种结果可靠、用时短的手足口病病毒检测试 剂盒。
[0006] 本发明还要解决的技术问题是，提供上述手足口病病毒检测试剂盒的应用。
[0007] 为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
[0008] -种手足口病病毒快速检测引物，包括如下引物对：
[0009] (1)检测柯萨奇病毒A16型的引物及探针：
[0010]上游引物F1，其核苷酸序列如SEQ ID N0:1所示；
[0011]下游引物R1，其核苷酸序列如SEQ ID N0:2所示；
[0012]荧光探针T1，其核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示；
[0013 ] ⑵检测肠道病毒71型的引物及探针：
[0014] 上游引物F2,其核苷酸序列如SEQ ID N0:3所示；
[0015] 下游引物R2,其核苷酸序列如SEQ ID N0:4所示；
[0016] 荧光探针T2,其核苷酸序列如SEQ ID NO :6所示；
[0017] 上述引物及探针在一次检测中共同使用。
[0018] 作为本发明的优选，所述荧光探针T1的5 '端标记FAM荧光基团，3 '端标记tamra淬 灭基团。
[0019] 作为本发明的优选，所述荧光探针T2的5 '端标记HEX荧光基团，3 '端标记tamra淬 灭基团。
[0020] 上述手足口病病毒快速检测引物在制备手足口病病毒检测试剂中的应用也在本 发明的保护范围之内。
[0021] -种手足口病病毒快速检测试剂盒，该试剂盒中包含权利要求1~3任一所述的引 物，该试剂盒还包括如下试剂：
[0022] (1)病毒RNA提取试剂；
[0023] (2)RT_PCR 反应液。
[0024] 上述手足口病病毒快速检测试剂盒在检测手足口病病毒中的应用也在本发明的 保护范围之内。
[0025] 作为本发明的优选，利用该手足口病病毒快速检测试剂盒检测时，
[0026] RT-PCR扩增体系如下：反应体系为25yL，其中2XRT-PCR缓冲液12.5yL，Ex Taq HS 0.5yL，ITT酶混合物II 0.5yL，上游引物FI、下游引物F2、上游引物F2、下游引物R2 0.48μ mol/L，荧光探针Τ1、荧光探针Τ2 0.24ymol/L，模板RNA8yL，DEPC水 1.5yL;
[0027] RT-PCR 反应条件如下：42°C30min; 95°C2min 进行逆转录;然后 95°C5s，55°C35s，进 行40个循环;荧光采集点在55°C，反应体积设置为25yL。
[0028] 有益效果:利用双通道荧光定量的优点，本发明采用聚合酶链式反应及分子信标 荧光探针技术同时对柯萨奇病毒A16型(CoxA16)和肠道病毒71型(EV71)的基因进行扩增检 测，从而判断是否感染手足口病病毒。该试剂盒及技术方法具有操作简便、特异性强、敏感 性高、成本低廉及高通量等优点，通过双通道荧光定量能实现快速检测手足口病病毒，为临 床治疗提供参考。
【附图说明】
[0029] 图1为1例柯萨奇病毒A16型(CoxA16)基因检测阳性结果图，阳性对照品Ct值为18， 阴性对照品Ct值为无数值;标本Ct值为27。
[0030] 图2为1例肠道病毒71型(EV71)基因检测阳性结果图，阳性对照品Ct值为19,阴性 对照品Ct值为无数值;标本Ct值为"29"。
[0031 ]图1和图2中横坐标为循环数;纵坐标为荧光值；
【具体实施方式】
[0032]根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实 施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本 发明。
[0033] 实施例1:检测柯萨奇病毒A16型(CoxA16)和肠道病毒71型(EV71)的基因的核酸序 列。
[0034] 以下实施例中所用的引物及荧光探针均委托英潍捷基(上海)贸易有限公司合成：
[0035] 上游引物FI (SEQ ID NO: 1): 5' -AAACCCAATGGTGAGCTAGTCC-3';
[0036] 下游引物R1(SEQ ID NOdhS'-GATGGGTTGGTGGCAGTCTG-S';
[0037] 上游引物F2(SEQ ID NOdhS'-GGAGATAGGGTGGCAGATGTAAm';
[0038] 下游引物R2(SEQ ID NOdhS'-AATTTCAGCAGCTTGGAGTGCT-S';
[0039] 荧光探针T1(SEQ ID NOAhFam-S'-TGCAGTACATGTATGTCCH^-tamra;
[0040] 荧光探针T2(SEQ ID NOdhhex-S'-GTGAGCAGTCATCG-S'-tamra。
[0041] 实施例2:检测柯萨奇病毒A16型(CoxA16)和肠道病毒71型(EV71)的方法。
[0042] 仪器:Roche LightCyclery?480 荧光定量PCR检测仪，BECKMANMicrofiige? 22R台式 微量冷冻离心机，E