ppendorf 5810R台式冷冻离心机，太仓华利达实验室设备公司WH-866型 涡旋振荡器。
[0043] (1)病毒RNA提取试剂
[0044] 病毒RNA的抽提按照Qiagen生物公司生产的Reansy Mini Kit病毒RNA抽提试剂盒 说明书提取，得到病毒RNA备用。
[0045] (2)选用一步法荧光RT-PCR，试剂购自宝生物工程公司，反应体系为25yL，其中2X RT-PCR缓冲液12.5Ml，Ex Taq HS Ο.δμΙ^ΙΤΓ酶混合物II 0.5yL，上游与下游混合引物（20μ mo 1 /L) 0.6yL，探针（20μπιο 1 /L) 0.3yL，模板 RNA8yL，焦碳酸二乙酯（DEPC)处理水 1.5yL。
[0046] (a)配置反应液:从-20°C冰箱取出试剂盒的各组分，室温融化，放冰盒上备用。加 样前10分钟之内，按检测样本数配置PCR反应液ΧμL:
[0047] X=(12.5yL 2XRT-PCR缓冲液+0.5yL Ex Taq HS+0.5yL RT酶混合物II+0.6yL上 下游引物（2对引物)+0.3yL探针(2条探针)+1.5yL DEPC水）X (η份样本+1份阳性对照+1份 阴性对照+1份空白对照）。
[0048] 振荡混匀后，2000rpm离心5s，按每人份17μ1分装到96孔PCR反应板中，传至样本制 备区备用。
[0049] (b)加样：向分装好试剂的反应孔中，分别加入样本RNA模板8μ1 (若样本裂解产物 保存在-20°C，使用前置室温解冻，以13000rpm离心5min)，阳性对照孔加入8μ1阳性对照品， 阴性对照孔加入8μ1阴性对照品，空白对照孔加入8μ1双蒸水，加样过程要求冰上操作。贴好 封口膜，3000rpm离心30s，放入仪器进样槽。
[0050] (c)RT-PCR扩增:Roche LighlCyclery?480荧光定量PCR仪同时进行柯萨奇病毒A16 型和肠道病毒71型基因检测，反应条件如下：42°C30min，95°C2min进行逆转录，然后95°C 5s，55°C35s，进行40个循环，荧光采集点在55°C，反应体积设置为25yL。保存文件，运行。
[0051] (d)结果分析，具体包括如下步骤：
[0052] Roche LighlCyciery?480荧光PCR检测仪点击分析，本产品属于两重荧光检测，荧 光信号收集时设定两个荧光，仪器检测通道选择分别为Fam荧光素和HEX荧光素。荧光信号 收集设在55°C。选取定量模式，进入分析窗口，选定噪音线项，阈值设定为刚好超过无规则 的噪音线的最高点（可根据实际情况适当调整），且阳性曲线无拐点，保证噪音线项下的数 值和分析项下的域值一致。每次实验空白对照孔无 ct值，结果合格。点击计算，自动计算得 到每个测试的ct值。
[0053] (e)阴阳性对照品结果标准及处理，具体按照如下步骤判定：
[0054]阴性对照品PCR扩增的Ct值应无数值或大于40且增长曲线不规则；阳性对照品PCR 扩增增长曲线呈S型曲线且Ct值小于35。
[0055] (3)步骤(2)所得的样本耐药基因检测结果判断，具体按照如下标准：
[0056] (a)如果增长曲线不呈S型曲线或Ct值为无数值或大于40,则判样本结果为阴性。
[0057] (b)如果增长曲线呈S型曲线且Ct值〈40,则按以下方法判断：
[0058]若样本的CT〈35，则判样本结果为阳性；
[0059] 检测样本Ct 2 35,重新配制PCR反应液进行PCR扩增，复查结果如果增长曲线不呈S 型曲线或Ct值为无数值或大于40,则判样本结果为阴性。如果增长曲线呈S型且Ct值仍旧小 于40则判样本结果为阳性。
[0060] 将本发明所述的试剂盒用于50例临床疑似手足口病患者样本检测，检测结果与 Elisa法进行比对，检测结果如下表：
[0061]
[0062]
[J
[0064]上述50例标本中，两种检测方法所得结果一致。综上所述，本试剂盒具有操作简便 快捷，灵敏、特异，成本低廉，本发明解决了现有技术中检测手足口病病原体的方法所需周 期长、灵敏度较低等问题，对手足口病病毒中柯萨奇病毒A16型和肠道病毒71型基因同时进 行快速检测，用于临床能有利于医师进行快速诊断，改善治疗方案，减少抗生素药物的滥 用。该技术方案技术门槛低，且适用于其他类型基因的检测，易于推广，具有较好的应用前 景。
【主权项】
1. 一种手足口病病毒快速检测引物，其特征在于，包括如下引物对： (1) 检测柯萨奇病毒A16型的引物对及探针： 上游引物F1，其核苷酸序列如SEQIDNO: 1所示； 下游引物R1，其核苷酸序列如SEQIDN0:2所示； 荧光探针T1，其核苷酸序列如SEQIDN0:5所示； (2) 检测肠道病毒71型的引物对及探针： 上游引物F2,其核苷酸序列如SEQIDN0:3所示； 下游引物R2,其核苷酸序列如SEQIDN0:4所示； 荧光探针T2,其核苷酸序列如SEQIDNO:6所示； 上述引物及探针在一次检测中共同使用。2. 根据权利要求1所述的手足口病病毒快速检测引物，其特征在于，所述荧光探针T1的 5 '端标记FAM焚光基团，3 '端标记tamra淬灭基团。3. 根据权利要求1所述的手足口病病毒快速检测引物，其特征在于，所述荧光探针T2的 5 '端标记HEX焚光基团，3 '端标记tamra淬灭基团。4. 权利要求1~3任一所述的手足口病病毒快速检测引物在制备手足口病病毒检测试 剂中的应用。5. -种手足口病病毒快速检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒中包含权利要求1~3任 一所述的引物，该试剂盒还包括如下试剂： (1) 病毒RNA提取试剂； (2)RT-PCR反应液。6. 权利要求5所述的手足口病病毒快速检测试剂盒在检测手足口病病毒中的应用。7. 根据权利要求6所述的应用，其特征在于，利用该手足口病病毒快速检测试剂盒检测 时， RT-PCR扩增体系如下：反应体系为25yL，其中2XRT-PCR缓冲液12.5yL，ExTaqHS0.5yL，ITT酶混合物II0.5yL，上游引物FI、下游引物F2、上游引物F2、下游引物R2 0.48μπιο1/L， 荧光探针ΤΙ、荧光探针T2 0.24ymol/L，模板RNA8yL，DEPC水1.5yL; RT-PCR反应条件如下：42°C30min; 95°C2min进行逆转录;然后95°C5s，55°C35s，进行40 个循环;荧光采集点在55°C，反应体积设置为25yL。
【专利摘要】本发明公开了一种手足口病病毒快速检测引物，包括如下引物对：(1)检测柯萨奇病毒A16型的引物及探针；(2)检测肠道病毒71型的引物及探针；引物及探针的序列如SEQ？ID？NO：1～6所示，上述引物在同一次检测中使用。本发明还公开了上述手足口病病毒快速检测引物在检测手足口病病毒中的应用。该试剂盒及技术方法具有操作简便、特异性强、敏感性高、成本低廉及高通量等优点，通过双通道荧光定量能实现快速检测手足口病病毒，为临床治疗提供参考。
【IPC分类】C12Q1/68, C12N15/11, C12Q1/70, C12R1/93
【公开号】CN105483288
【申请号】CN201511008168
【发明人】任绪义, 虞闰六, 施宏
【申请人】杭州迪安生物技术有限公司
【公开日】2016年4月13日
【申请日】2015年12月29日