一种肠道病毒三重直接荧光rt-pcr的检测试剂盒和反应体系的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及肠道病毒的分子生物学检测技术领域，具体涉及一种肠道病毒通用 型、CA16型、EV71型三重直接荧光RT-PCR的检测试剂盒和反应体系。
【背景技术】
[0002] 手足口病(Hand，foot，and mouth disease，HFMD)是一种肠道病毒引起的传染病， 多发于学龄前儿童，可引起患儿手、足、口腔等部位的疱疹，少数患儿可引起心肌炎、肺水 月中、无菌性脑膜脑炎等并发症，重症患儿死亡率较高。引起手足口病的病原主要为肠道病毒 属的柯萨奇病毒(Coxasckie virus)A组16、4、5、7、9、10型，13组2、5、13型；埃可病毒(ECHO viruses)、肠道病毒通用型和肠道病毒71型(EV71型），其中以EV71型及CA16型最为常见。
[0003] 目前，肠道病毒感染的特异性诊断技术包括病原学、免疫学、分子生物学三个方面 五种方法，即病毒分离鉴定、血清学检测技术、免疫荧光法、酶联免疫吸附(ELISA)以及反转 录聚合酶链式反应(RT-PCR)。病毒分离鉴定、血清学检测技术、免疫荧光法、酶联免疫吸附 (ELISA)诊断技术存在耗时长、敏感性较低、不易标准化等缺点，在实际应用中具有一定的 局限性，无法满足大量样本的快速诊断。
[0004] 反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)的检测技术需要提取病毒RNA反转录成cDNA，再 进行PCR扩增和后续产物处理，在处理痕量样本上，提取病毒RNA过程容易发生RNA降解或交 叉污染等事件，仍存在较大困难，无法做到高通量、低成本、高效率的方法来进行批量的快 速检测。基于传统荧光RT-PCR检测肠道病毒的方法在操作步骤、灵敏度及特异性等方面还 有待于改进和发展。
[0005] 为了提高肠道病毒感染检测效率、节省成本、避免交叉污染并进行高通量检测，一 种较好的解决方案是设法实现肠道病毒通用型、CA16型、EV71型直接扩增的RT-PCR检测，即 直接以采集的液体样本作为检测对象进行RT-PCR反应，同时检测肠道病毒通用型、CA16型、 EV71型。然而，受限于引物和探针易受样本复杂因素的影响，以及引物和探针易形成复杂结 构而导致互相干扰等因素的影响，目前还没有合适的引物和探针可以用于高效地实现上述 目的。
[0006] 此外，目前也缺乏合适的反应液用于实现肠道病毒通用型、CA16型、EV71型三重直 接扩增的RT-PCR检测。
【发明内容】
[0007] 本发明提供一种肠道病毒通用型、CA16型、EV71型三重直接荧光RT-PCR的检测试 剂盒和反应体系。将本发明的试剂盒用于肠道病毒的检测中，可以直接将样本加入反应管 内进行检测，而不需要纯化RNA这一繁琐的步骤，减少了操作步骤，可以快速、准确检测肠道 病毒通用型，缩短检测时间，提高检测效率，节省成本，同时可以有效地降低交叉污染的风 险。
[0008] 根据本发明的第一方面，本发明提供一种肠道病毒通用型、CA16型、EV71型三重直 接荧光RT-PCR的检测试剂盒，包括：
[0009] 两条用于检测肠道病毒通用型的引物，其碱基序列分别为SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO:2;-条用于检测肠道病毒通用型的探针，其碱基序列为SEQ ID NO:3;其中SEQ ID NO:3 的5 '端标记有荧光报告基团，3 '端标记有荧光淬灭基团；
[0010] 两条用于检测肠道病毒CA16型的引物，其碱基序列分别为SEQ ID N0:4和SEQ ID N0:5; -条用于检测肠道病毒CA16型的探针，其碱基序列为SEQ ID N0:6;其中SEQ ID N0:6 的5 '端标记有荧光报告基团，3 '端标记有荧光淬灭基团；
[0011] 两条用于检测肠道病毒EV71型的引物，其碱基序列分别为SEQ ID N0:7和SEQ ID NO:8; -条用于检测肠道病毒EV71型的探针，其碱基序列为SEQ ID NO:9;其中SEQ ID NO:9 的5 '端标记有荧光报告基团，3 '端标记有荧光淬灭基团。
[0012] 作为本发明的进一步改进的方案，上述探针SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:6和SEQ ID N0:9的焚光报告基团互不相同。
[0013] 作为本发明的优选方案，上述探针SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:6和SEQ ID N0:9的荧 光报告基团分别为R〇X、HEX和FAM。
[0014] 作为本发明的优选方案，上述探针SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:6和SEQ ID N0:9的荧 光淬灭基团分别为BHQ2、BHQ1和BHQ1。
[0015] 作为本发明的进一步改进的方案，上述试剂盒还包括：
[0016] 两条用于检测内标的引物，其碱基序列分别为SEQ ID N0:10和SEQ ID N0:11; - 条用于检测内标的探针，其碱基序列为SEQ ID NO: 12;其中SEQ ID NO: 12的5'端标记有荧 光报告基团，3 '端标记有荧光淬灭基团；
[0017]内标，其为RNA分子，含有内标扩增所需的序列，其对应的DNA碱基序列为SEQ ID N0：13〇
[0018]作为本发明的优选方案，上述探针SEQ ID NO: 12的荧光报告基团不同于上述探针 SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:6和SEQ ID N0:9的荧光报告基团，更优选上述探针SEQ ID N0:12 的荧光报告基团为CY5,且上述探针SEQ ID NO: 12的荧光淬灭基团为BHQ2。
[0019]作为本发明的进一步改进的方案，上述试剂盒还包括:直接RT-PCR反应液，该直接 RT-PCR反应液包括Tri s-HCl、硫酸铵、氯化钾、Tri ton X-100、氯化镁、dNTPs混合物和PCR增 强剂。
[0020] 作为本发明的更进一步改进的方案，在上述直接RT-PCR反应液中，Tris-HCl的浓 度为20mmol/L~110mmol/L;硫酸铵的浓度为10mmol/L~40mmol/L;氯化钾的浓度为 60111111〇1/1~120111111〇1/1 ;1^如11父-100的体积百分含量为0.02%~3%;氯化镁的浓度为 4_〇1凡~1〇1111]1〇1凡;(11^1 ：)8混合物中每种(11^1：)的浓度为2.5_〇1凡~5_〇1凡;？0?增强剂的 浓度为 2mmol/L ~10mmol/L。
[0021] 作为本发明的进一步改进的方案，上述PCR增强剂选自甜菜碱(Betaine)、四甲基 氯化铵（Tetramethylammonium chloride，TMAC)、肉喊（L-carnitine)、海藻糖（D_( + )_ trehalose)和非离子去污剂NP_40中的一种或多种。
[0022] 作为本发明的进一步改进的方案，上述试剂盒还包括:酶混合液，该酶混合液包 括:高耐受性Taq DNA聚合酶、耐热型M-MLV逆转录酶、RNA酶抑制剂和酶保存液。优选地，该 酶混合液按照高耐受性Taq DNA聚合酶酶活力20U~80U，耐热型M-MLV逆转录酶酶活力25U ~100U，RNA酶抑制剂酶活力1U~50U混合形成，其余为酶保存液。
[0023] 作为本发明的进一步改进的方案，上述试剂盒还包括:样本采集液，上述样本采集 液为不含1丐镁离子的HBSS缓冲液(Hank's Balanced Salt Solution，Hank's平衡盐溶液）。
[0024] 根据本发明的第二方面，本发明提供一种肠道病毒通用型、CA16型、EV71型三重直 接荧光RT-PCR的检测反应体系，包括 :SEQIDN0:1、2、4、5、7、8、10、11所示的引物，SEQID NO: 3、6、9、12所示的探针，以及含有SEQ ID NO: 13所示的DNA碱基序列的内标RNA分子，还含 有直接RT-PCR反应液、酶混合液和样本采集液，其中直接RT-PCR反应液包括Tr i s-HCl、硫酸 铵、氯化钾、Triton X-100、氯化镁、dNTPs混合物和PCR增强剂;上述酶混合液包括高耐受性 Taq DNA聚合酶、耐热型M-MLV逆转录酶、RNA酶抑制剂和酶保存液;其中在上述反应体系中， Tris-HCl 的浓度为9 · 6mmol/L~52 · 8mmol/L;硫酸钱的浓度为4 · 8mmol/L~19 · 2mmol/L;氣 化钾的浓度为28 · 8mmol/L~57 · 6mmol/L; Triton X-100的体积百分含量为0 · 0096 %~ 1.44%;氯化镁的浓度为1.92mmol/L~4.8mmol/L，dNTPs混合物中每种dNTP的浓度为 1 · 2mmol/L ~2 · 4mmol/L，PCR 增强剂的浓度为