0 · 96mmol/L~4.8mmol/L。
[0025] 本发明的试剂盒用于肠道病毒的检测中，可以直接将样本加入反应管内进行检 测，而不需要纯化RNA这一繁琐的步骤，减少了操作步骤，可以快速、准确检测肠道病毒通用 型，缩短检测时间，提高检测效率，节省成本，同时可以有效地降低交叉污染的风险。本发明 对由肠道病毒引起的手足口病疫情的防治、早期筛查、诊断提供了准确、简便、有效的监测 手段，同时也对验证新药治疗手足口病效果，以及迅速制定防控措施具有重要意义。
【附图说明】
[0026] 图1为本发明实施例2中肠道病毒CA16型直接扩增的RT-PCR检测方法的曲线图，表 明其灵敏度。
【具体实施方式】
[0027] 下面通过【具体实施方式】结合附图对本发明作进一步详细说明。
[0028] 本发明的关键包括两部分:一是创造性地寻找到合适的引物和探针，能够克服引 物和探针受样本复杂因素的影响以及引物和探针形成复杂结构而导致互相干扰等因素的 影响，可以实现肠道病毒通用型、CA16型、EV71型三重直接扩增的RT-PCR检测，不需要RNA的 提取;二是对反应采用的试剂进行优化，尤其是直接RT-PCR反应液进行优化，配制出一种能 够高效地进行肠道病毒通用型、CA16型、EV71型三重直接扩增的RT-PCR检测的试剂配方。
[0029] 表1示出了本发明一个实施例中使用的肠道病毒通用型、CA16型、EV71型及内标检 测引物探针序列，其中SEQ ID N0:l-3用于检测肠道病毒通用型，SEQ ID N0:4-6用于检测 肠道病毒CA16型，SEQ ID N0:7-9用于检测肠道病毒EV71型，SEQ ID N0:10-12用于检测内 标RNA分子，该内标RNA分子对应的DNA碱基序列为SEQIDN0:13。需要说明的是，只要内标 RNA分子中含有一段对应的DNA喊基序列为SEQ ID N0:13的序列即可，内标RNA分子中还可 以含有其它序列部分(在5'端和/或3'端），只要不影响RNA分子的扩增检测即可。
[0030] 表1肠道病毒及内标检测引物、探针序列
[0031]
[0033] 作为实现本发明的必要条件，SEQ ID NO: 1-9所示的引物和探针序列是必需的。而 SEQ ID N0:10-12所示的内标的引物和探针用于监测反应的有效性，最好具有。
[0034] 需要说明的是，作为探针的SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:6和SEQ ID N0:9需要在两端 分别带有荧光报告基团和荧光淬灭基团，其中荧光报告基团在不同的探针之间最好不同， 以便区分不同类型的病毒的反应结果。荧光报告基团可以从常用的荧光报告基团中选取， 例如冊父（〇81'130叉7-父-1?110(1&111；[116)、]^^(!16叉&。111〇1'0；1^1110代8。6；[11)和卩厶]\1(6-。&1'130叉7- fluorescein)等;荧光淬灭基团可以从常用的能够淬灭相应荧光报告基团的荧光淬灭基团 中选择，例如BHQl(Black Hole Quencher-1)和BHQ2(Black Hole Quencher-2)等。
[0035] 在本发明的一个优选的实施例中，探针SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:6和SEQ ID N0:9 的荧光报告基团分别为R〇X、HEX和FAM，它们分别发出红色、粉红和绿色荧光，能够清楚明显 地区分不同类型的病毒的扩增反应情况。相应地，荧光淬灭基团分别为BHQ2、BHQ1和BHQ1。
[0036] 在本发明的个优选的实施例中，用于检测内标的探针的喊基序列为SEQ ID N0: 12,其荧光报告基团与SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:6和SEQ ID N0:9的荧光报告基团不同，在 本发明的一个优选的实施例中，探针SEQ ID NO: 12的荧光报告基团为CY5,其发出蓝紫色的 荧光；相应地，荧光淬灭基团为BHQ2。当然也可以选择其他的荧光报告基团和荧光淬灭基 团。
[0037]除了上述引物和探针以外，本发明的试剂盒还可以任选地包括直接RT-PCR反应 液、酶混合液和样本采集液中的一种或者多种。虽然最优选的是包括上述引物、探针、内标， 以及直接RT-PCR反应液、酶混合液和样本采集液，然而应当理解由于各部分可以以单独的 形式存在，因此并不意味着必然包括所有部分，才称作本发明的试剂盒。
[0038] 在本发明的试剂盒还包括直接RT-PCR反应液的情况下，一个较优选的直接RT-PCR 反应液包括Tris-HCl、硫酸铵、氯化钾、Triton X-100、氯化镁、dNTPs混合物和PCR增强剂。 并且进一步，在直接RT-PCR反应液中，Tris-HCl的浓度为20mmol/L~110mmol/L ;硫酸铵的 浓度为10111111〇1凡~401111]1〇1/1^;氯化钾的浓度为601]11]1〇1/1^~1201]11]1〇1八;1'1'；[1:011父-100的体积 百分含量为0.02%~3%;氯化镁的浓度为4mmol/L~10mmol/L，dNTPs混合物中每种dNTP的 浓度为2.5mmol/L~5mmol/L，PCR增强剂的浓度为0.96mmol/L~4.8mmol/L。上述直接RT-PCR反应液可以简单地通过将氯化镁、dNTPs混合物和PCR增强剂按照配方量加入RT-PCR缓 冲液(包括Tr is-HCl、硫酸铵、氯化钾和Tri ton X-100)中来获得。应当理解的是，按照本领 域的一般含义dNTPs混合物是指包含了四种dNTP，即(^了？、(11'了？、(101\(16了？的等比例混合 物。
[0039] 其中，涉及到的PCR增强剂，可从选自甜菜碱、四甲基氯化铵、肉碱、海藻糖和非离 子去污剂NP-40中的一种或多种。多种组合使用的典型但非限定性的例子有:甜菜碱和四甲 基氯化铵的组合，四甲基氯化铵和肉碱的组合，肉碱和海藻糖的组合，肉碱、海藻糖和甜菜 碱的组合等。
[0040] 控制酶的使用量和比例关系，对于本发明高效地实现也很关键。在本发明的一个 优选的实施例中，酶混合液包括高耐受性Taq DNA聚合酶、耐热型M-MLV逆转录酶、RNA酶抑 制剂和酶保存液;其中该酶混合液按照高耐受性Taq DNA聚合酶酶活力20U~80U，耐热型M-MLV逆转录酶酶活力25U~100U，RNA酶抑制剂酶活力1U~50U混合形成，其余为酶保存液。 [0041 ]需要说明的是，上述直接RT-PCR反应液中各种组分及其含量对于本发明的直接 RT-PCR反应的成功实现，有重要影响。发明人已经证实，直接RT-PCR反应液中各种组分的含 量在上述范围内变动，本发明的实验效果没有显著的变化，也就是说，各种组分的含量在上 述范围内都可以实现本发明的直接RT-PCR反应。然而，含量突破上述范围，会对实验效果有 影响。本发明的发明人经过长期摸索研究确定上述各种组分及其含量，从而保证本发明的 直接RT-PCR反应不但能够成功实现，而且能够取得显著优异的效果。
[0042]以下通过实施例详细说明本发明的实现，应当理解实施例仅是示例性的，并不构 成对本发明保护范围的限制。
[0043]以下实施例中的引物和探针序列如SEQ ID N0:1-12,所使用的内标为RNA分子，含 有内标扩增所需的序列，其对应的DNA碱基序列为SEQ ID N0:13。
[0044] 实施例1本发明的试剂盒用于临床样本的检测试验
[0045] 1.样本处理：
[0046] 咽拭子样本:用消毒棉签擦拭患者口腔两侧腭弓及咽、扁桃体的分泌物，避免触及 其他部位。然后迅速将棉签放入本试剂盒提供的采集管内，在靠近顶端处折断棉签杆，加入 内标溶液，旋紧管盖，混匀，短期放于4°C备用。
[0047] 2.反应液准备：
[0048] 本实施例中，Tris-HCl在直接RT-PCR反应液中的浓度为31.25mmol/L，硫酸铵在直 接RT-PCR反应液中的浓度为20.83mmol/L，氯化钾在直接RT-PCR反应液中的浓度为 72.92mmol/L，Triton X-100在直接RT-PCR反应液中的体积百分含量为0.125%;氯化镁在 直接RT-PCR反应液中的浓度为0.09 lmmo 1/L; dNTPs混合物中每种dNTP在直接RT-PCR反应液 中的浓度为〇.83mmol/L;PCR增强剂组分的甜菜碱浓度为0.5mmol/L，肉碱浓度为lmmol/L， NP-40 浓度为 lmmo 1 /L;其余为 ddH20，共 12yL。
[0049]酶混合液，其中高耐受性Taq DNA聚合酶活力为60U，耐热型M-MLV逆转录酶活力为 50U，RNA酶抑制剂酶活力为10U，其余是酶保存液，共4yL。
[0050]引物探针混合液(SEQ ID NO: 1-12)，其