肠病毒71型新颖病毒株及其应用

肠病毒71型新颖病毒株及其应用【专利摘要】本发明公开了一种肠病毒71型(Enterovirus71,EV71)新颖病毒株。本发明并公开了一种含有所述新颖的肠病毒71型(EV71)病毒株的免疫组合物、一种肠病毒71型检测试剂盒，以及所述新颖的肠病毒71型(EV71)病毒株的应用。CCTCCNO：V20141220141120【专利说明】肠病毒71型新颖病毒株及其应用
技术领域：
[0001]本发明关于一种新颖的肠病毒71型病毒株、含有所述病毒的免疫组合物、检测试剂盒及应用。【
背景技术：
】[0002]肠病毒（Enterovirus)为微小核糖核酸病毒科（Picornaviridae)中的肠病毒属（Enterovirus)。肠病毒为一群仅20_30nm大小的正向单股RNA(ssRNA)病毒，具有二十面体结构，不具套膜（envelope)而仅含有外膜（capsid)。肠病毒共有67型血清型，包括柯萨基病毒A型（CoxsackievirusgroupA)共23型血清型、柯萨基病毒B型(CoxsackievirusgroupB)共6型血清型、艾柯病毒（Echovirus)共31型血清型、脊髓灰质炎病毒（Poliovirus)共3型，以及肠病毒第68至71型。[0003]肠病毒71型首次于1969年美国加州分离出来，之后世界各地，包括澳洲、日本、香港、马来西亚、瑞典、保加利亚、匈牙利、法国等，都有病例出现。台湾自1994年起经历了许多次不同的血清型肠病毒大流行，其中以1998年肠病毒71型造成405例重症和78人死亡的疫情最为严重，当年预估约有140万的儿童得到手足口症和咽映炎。自1998年至2012为止，肠病毒在台湾地区肆虐至少已造成约250名儿童死亡，病因仍以肠病毒71型为主。[0004]肠病毒71型在病毒学上的基因型可分为A、B、C、D四型，其中B型可再分为Bl至B5，C型可分为Cl至C5等亚型。近年来肠病毒71型主要流行于东南亚、西太平洋地区与中国。肠病毒的传染性很强，主要是经由肠胃道（粪口、污染的水或食物）或呼吸道（飞沫、咳嗽或打喷嚏），也可经由接触病人的分泌物或皮肤上的水泡而受到感染。[0005]由于肠病毒适合在湿、热的环境下生存与传播，台湾地处亚热带，全年都有感染个案发生，所以肠病毒感染症俨然已是台湾地区地方性的流行疾病之一。依据台湾地区历年监测资料显示，幼童为感染并发重症及死亡的高危险群体，重症致死率约在3.8%至25.7%之间。引起肠病毒感染并发重症的型别以肠病毒71型为主，克沙奇病毒居次；一般肠病毒感染主要常见症状为手足口病或泡疹性咽峡炎。肠病毒疫情每年约自3月下旬开始上升，于5月底至6月中达到高峰后，即缓慢降低，而后于9月份开学后再度出现一波流行。以年龄层分析，患者以5岁以下幼童居多，约占所有重症病例90%;在死亡病例方面，以5岁以下幼童最多。[0006]因此，研发有效的肠病毒疫苗对于肠病毒防疫来说，是刻不容缓且极为重要的事。【
发明内容】[0007]本发明于第一部份中提供一种新颖肠病毒71型（Entrovirus71，EV71)病毒株，所述病毒株具有分别如SEQIDN0s:6、8、10所示的氨基酸序列的VP1、VP2、VP3结构蛋白；经鉴定后，确认所述病毒为一种新颖的肠病毒71型（EV71)病毒株，命名为肠病毒71型（EV71)EV71-1501-3-M3病毒株。将所述病毒株保藏于中国典型培养物保藏中心（ChinaCenterforTypeCultureCollection，简称CCTCC)，保藏日为2014年11月20日，其保藏号为CCTCCN0:V201412。[0008]本发明于第二部分中提供一种含有所述新颖的肠病毒71型（EV71)病毒株的免疫组合物。于某些具体实施例中，所述免疫组合物进一步包含药学上可接受的载体(pharmaceuticallyacceptablevehicle)。于某些具体实施例中，所述免疫组合物进一步包含至少一种病原抗原，所述病原抗原包含但不限于：柯萨基病毒（Coxsackievirus)、艾柯病毒（Echovirus)、脊髓灰质炎病毒（Poliovirus)、肠病毒（Enterovirus)、乙型肝炎病毒（HepatitisBvirus)、牛结核分支杆菌（Mycobacteriumbovis)、白喉杆菌（Corynebacteriumdiphtheriae)、破伤风杆菌（Clostridiumtetani)、百日咳杆菌(Bordetellapertussis)、流行性感冒嗜血杆菌（Haemophilusinfluenza)、水痕-带状疱疼病毒（varicella-zostervirus)、麻疼病毒（Measlesvirus)、聰腺炎病毒（Mumpsvirus)、风疼病毒（Rubellavirus)、乙型脑炎疫苗（JapaneseEncephalitisvirus)、轮状病毒（Rotavirus)及流行性感冒病毒（Influenzavirus)。[0009]本发明于第三部分中提供一种抗肠病毒71型（EV71)的抗体，是通过本发明的肠病毒71型（EV71)病毒株所制造而得。于某些具体实施例中，所述抗体包含但不限于：一单株抗体、一多株抗体，以及一经基因重组的抗体。[0010]本发明于第四部分中提供一种多核苷酸，包含一编码如本发明的肠病毒71型(EV71)病毒株所具有的结构蛋白的氨基酸序列，所述结构蛋白的氨基酸序列包含至少下列其中一种：SEQIDN0:2、SEQIDN0:4、SEQIDN0:6、SEQIDN0:8,以及SEQIDN0:10。于某些具体实施例中，所述序列包含至少下列其中一种：SEQIDNO:I、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7,以及SEQIDNO:9。[0011]本发明于第五部分提供一种肠病毒71型（EV71)的检测试剂盒，包含一侦测单元，所述侦测单元包含但不限于：一本发明的肠病毒71型（EV71)病毒株的病毒抗原、一通过本发明的肠病毒71型（EV71)病毒株所制造的抗体、具有如SEQIDN0s:2、4、6、8、10所示的氨基酸序列的蛋白质，以及一编码具有如SEQIDN0s:2、4、6、8、10所示的氨基酸序列的蛋白质的多核苷酸。于某些具体实施例中，所述抗体包含至少下列其中一种：一单株抗体、一多株抗体，以及一经基因重组的抗体。于某些具体实施例中，所述多核苷酸的DNA序列包含至少下列其中一种：SEQIDNO:1、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7,以及SEQIDN0:9〇[0012]本说明书中所述的所有技术性及科学术语，除非另外有所定义，皆为该所属领域具有通常技艺者可共同了解的意义。[0013]本发明以下面的实施例予以示范阐明，但本发明不受下述实施例所限制。【附图说明】[0014]图IA以及图IB所不为以西方墨点法确认肠病毒样品的结果。图IA为以抗-Enterovirus71VP1单株抗体（Abonva公司，台湾）辨认本发明的肠病毒株EV71-1501-3-M3(第1道）以及正对照组肠病毒株E49-1149(第2道）的结果，箭头所指处为VPl蛋白。图IB为以抗Enterovirus71VP0单株抗体（Millpore公司，麻州，美国）、抗Enterovirus71VP2单株抗体（Millpore公司，麻州，美国）辨认本发明的肠病毒株EV71-1501-3-M3(第1道）以及正对照组肠病毒株E49-1149(第2道）的结果。[0015]图2所示为肠病毒EV71-1501-3(P。代）与EV71-1501-3-M3(P8代）的Pl结构蛋白氨基酸序列的比对结果，Query为肠病毒EV71-1501-3(P。代）的Pl结构蛋白氨基酸序列，Subject为肠病毒EV71-1501-3-M3$8代）的Pl结构蛋白氨基酸序列，方框标示处为具有差异的氣基酸残基。[0016]图3A、图3B以及图3C所示为小鼠经过不同肠病毒71型病毒株灭活疫苗免疫后，于试验第42天（第3次免疫后）采集的血液样品进行中和抗体效价分析的结果。图3A为以本发明肠病毒株EV71-1501-3-M3灭活疫苗免疫小鼠的血清样品，分别对C4亚型肠病毒株EV71-1501-3-M3、C4亚型肠病毒株E49-1149以及M亚型肠病毒株2847进行中和反应的结果。图3B为以对照组肠病毒株E49-1149灭活疫苗免疫小鼠的血清样品，分别对C4亚型肠病毒株EV71-1501-3-M3、C4亚型肠病毒株E49-1149以及M亚型肠病毒株2847进行中和反应的结果。图3C为以PBS溶液注射小鼠的血清样品，分别对C4亚型肠病毒株EV71-1501-3-M3、C4亚型肠病毒株E49-1149以及M亚型肠病毒株2847进行中和反应的结果。[0017]图4A以及图4B所示为兔经过本发明肠病毒株EV71-1501-3-M3灭活疫苗免疫后，于试验第42天（第3次免疫后）采集的血液样品，分别对C4亚型肠病毒株EV71-1501-3-M3、C4亚型肠病毒株A、B、C、D，以及M亚型肠病毒株2847进行中和抗体效价分析的结果。图4A为第一只试验兔的血清样品的中和抗体效价分析的结果。图4B为第二只试验兔的血清样品的中和抗体效价分析的结果。【具体实施方式】[0018]于一部分，本发明提供一种新颖肠病毒71型（EV71)病毒株，所述病毒株具有分别如SEQIDN0s:6、8、10所示的氨基酸序列的VP1、VP2、VP3结构蛋白；经鉴定后，确认所述病毒为一种新颖的肠病毒71型（EV71)病毒株，命名为肠病毒71型（EV71)EV71-1501-3-M3病毒株。将所述病毒株保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC)，保藏日为2014年11月20日，其保藏号为CCTCCN0:V201412。[0019]于一部分，本发明提供一种含有所述新颖的肠病毒71型（EV71)病毒株的免疫组合物。于某些具体实施例中，所述免疫组合物为一疫苗，是将上述肠病毒71型（EV71)病毒株灭活，或进行病毒株弱化，再与一药学上可接受的载体（pharmaceuticallyacceptablevehicle)，制造成一适用本发明疫苗的剂型。然而，所述疫苗的剂型包含但不限于：死毒(灭活）疫苗、活毒（减毒）疫苗、次单位疫苗、DNA疫苗、或通过所述新颖肠病毒71型(EV71)病毒株或其核苷酸序列、氨基酸序列所制造而得的疫苗。[0020]本发明所述的灭活处理（inactivatedtreatment)包含但不限于：灭活剂处理、热处理等适用本发明的灭活方法。其中灭活剂包含但不限于：甲醛（formaldehyde)、多聚甲酸（paraformaldehyde)、β-丙内酯（Beta-Propiolactone,BPL)、2_溴乙胺（binaryethyleneimine,ΒΕΙ)，或适用本发明的灭活剂等。[0021]其中所述药学上可接受的载体包含一或多种选自于下列的试剂：溶剂(solvent)、乳化剂（emulsifier)、悬浮剂（suspendingagent)、分解剂（decomposer)、粘结剂（bindingagent)、赋形剂（excipient)、安定剂（stabilizingagent)、螯合剂(chelatingagent)、稀释剂（diluent)、胶凝剂（gellingagent)、防腐剂（preservative)、润滑剂（lubricant)、界面活性剂（surfactant)、佐剂（adjuvant)，及其他类似或适用本发明的试剂。[0022]其中所述佐剂包含但不限于：油质佐剂（如：矿物油、植物油、动物油、佛氏完全佐剂、佛氏不完全佐剂等）、水质佐剂（如：氢氧化铝）、双相油质佐剂（如：水包油包水剂型，w/o/w)、生物型佐剂（如：CpG寡核苷酸、细菌类毒素toxoid)等。其中所述双相油质佐剂包含一界面活性剂以及一油相物质；所述界面活性剂包括一或多种下列所选的群组者：山梨醇（sorbitol)脂肪酸酯；山梨醇脂肪酸酯与环氧乙烧（ethyleneoxide)或环氧丙烧（propyleneoxide)浓缩物；甘露醇（mannitol)脂肪酸酯；甘露醇脂肪酸酯与环氧乙烧或环氧丙烷浓缩物；甘露醇脂肪酸酯与下列所选的亲水基：羧酸（carboxylicacid)、胺基(amine)、酰胺（amide)、醇类（alcohol)、聚酯多元醇（polyol)、醚类（ether)、氧基（oxide)的接合物；无水甘露醇（anhydromannitol)脂肪酸酯；无水甘露醇脂肪酸酯与下列所选的亲水基：羧酸、胺基、酰胺、醇类、聚酯多元醇、醚类、氧基的接合物；鹿糖（saccharose)脂肪酸酯；蔗糖脂肪酸酯与环氧乙烷或环氧丙烷浓缩物；甘油脂肪酸酯；甘油脂肪酸酯与环氧乙烷或环氧丙烷浓缩物；脂肪酸与环氧乙烷或环氧丙烷浓缩物；脂肪醇与环氧乙烷或环氧丙烷浓缩物；以及甘油磷脂（glycerophospholipid)。所述油相物质包括一或多种下列所选的群组者：矿物油、植物油以及动物油。[0023]于某些具体实施例中，本发明所述的免疫组合物，可进一步包含一种或多种病原抗原，所述病原抗原包含但不限于：柯萨基病毒（Coxsackievirus)、艾柯病毒（Echovirus)、脊髓灰质炎病毒（Poliovirus)、肠病毒（Enterovirus)、乙型肝炎病毒（HepatitisBvirus)、牛结核分支杆菌（Mycobacteriumbovis)、白喉杆菌(Corynebacteriumdiphtheriae)、破伤风杆菌（Clostridiumtetani)、百日咳杆菌(Bordetellapertussis)、流行性感冒嗜血杆菌（Haemophilusinfluenza)、水痕-带状疱疼病毒（varicella-zostervirus)、麻疼病毒（Measlesvirus)、聰腺炎病毒（Mumpsvirus)、风疼病毒（Rubellavirus)、乙型脑炎疫苗（JapaneseEncephalitisvirus)、轮状病毒（Rotavirus)及流行性感冒病毒（Influenzavirus)。[0024]于一部分，本发明提供一种抗肠病毒71型（EV71)的抗体，是通过本发明的肠病毒71型（EV71)病毒株所制造而得。于某些具体实施例中，所述抗体包含但不限于至少下列其中一种：一单株抗体、一多株抗体，以及一经基因重组的抗体。[0025]本发明所提供的抗肠病毒71型（EV71)的抗体可由本发明
技术领域：
习知的技术所制得，于某些具体实施例中，所述抗体为多株抗体，其制造方法包含但不限于：将灭活的本发明肠病毒71型病毒株或其特定抗原片段（如々?0、￥?1、￥?2、￥?3、￥?4)的抗原蛋白与适用的佐剂（如：弗氏完全佐剂）混合后施与动物（例如但不限于：鼠、兔、禽（蛋）、猪、山羊、牛、水产动物），以进行初次免疫，经适当时间间隔后（如：2~3周），视需要以灭活后的病毒液及适当的佐剂（如：弗氏不完全佐剂）施与二次免疫甚至三次免疫或更多次免疫，以提高抗体效价。经适当时间间隔后（如：2~3周），采集免疫动物的血清，即制得抗肠病毒71型的多株抗体。于某些具体实施例中，所述多株抗体可视需要与显色剂或萤光结合。[0026]于某些具体实施例中，所述抗体为单株抗体，其制造方法包含但不限于：将浓缩的本发明的肠病毒病毒株，或其特定抗原片段（如：￥?0、￥?1、￥?2、￥?3、￥?4)的抗原蛋白施予动物（如：小鼠），视需要可添加适当的佐剂（如：弗氏完全佐剂），以进行初次免疫。经适当时间间隔后（如：2~3周），视需要以灭活的病毒（或抗原蛋白）及适当的佐剂（如：弗氏不完全佐剂）施与二次免疫。经适当时间间隔后（如：2~3周），采集免疫动物（如：小鼠）的血清，用以评估适合用以采集脾脏细胞的小鼠。从所述适用的小鼠采集脾脏细胞与骨髓瘤细胞（如：FO细胞株、NS细胞株）以PEG(PolyethyleneGlycol，如PEG1500)进行细胞融合。从融合细胞中筛选出具分泌能力的融合瘤并单株化后，可得一适合用以产制抗本发明的肠病毒71型病毒株的单株抗体的融合细胞系。经上述制造所得的抗体，可用于免疫检测试剂、治疗剂等。[0027]于一部分，本发明提供一种多核苷酸，包含一编码如本发明的肠病毒71型（EV71)病毒株所具有的结构蛋白的氨基酸序列，所述结构蛋白的氨基酸序列包含至少下列其中一种：SEQIDN0:2、SEQIDN0:4、SEQIDN0:6、SEQIDN0:8,以及SEQIDN0:10。于某些具体实施例中，所述序列包含至少下列其中一种：SEQIDNO:I、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDN0:7,以及SEQIDN0:9。[0028]于一部分，本发明提供一种肠病毒71型（EV71)的检测试剂盒，包含一侦测单元，所述侦测单元包含但不限于：一本发明的肠病毒71型（EV71)病毒株的病毒抗原、一通过本发明的肠病毒71型（EV71)病毒株所制造的抗体、具有如SEQIDN0s:2、4、6、8、10所示的氨基酸序列的蛋白质，以及一编码具有如SEQIDN0s:2、4、6、8、10所示的氨基酸序列的蛋白质的多核苷酸。于某些具体实施例中，所述抗体包含至少下列其中一种：一单株抗体、一多株抗体，以及一经基因重组的抗体。于某些具体实施例中，所述多核苷酸的DNA序列包含至少下列其中一种：SEQIDNO:1、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7,以及SEQIDN0:9〇[0029]所述检测试剂盒的形式包含但不限于：酵素连结免疫分析（enzyme-1inkedimmunosorbentassay,ELISA)试剂盒、微芯片检测试剂盒（Microchipkit)、免疫萤光分析法（immunofluorescentassay,IFA)检测试剂盒、聚合酶连锁反应（PCR)检测试剂盒、或其他通过本发明肠病毒71型（EV71)病毒株所制得的检测试剂盒。[0030]于某些具体实施例中，所述检测试剂盒至少包含一含有本发明肠病毒71型(EV71)病毒株的抗原盘，可用以检测样品中是否含有抗肠病毒71型（EV71)的抗体。所述检测试剂盒的制造方法包含但不限于：于一微量平底培养盘中加入对肠病毒有感受性的细胞（例如但不限于Vero细胞、RD细胞）悬浮液，并接种适量的本发明的肠病毒71型（EV71)病毒株，于37°C、5%C02环境下培养一适当时间后，以PBS清洗，并以适当浓度的丙酮在室温下固定，再以PBS清洗后，倒置放进37°C培养箱中风干，保存于-20°C下备用。所述抗原盘可用来检测检体样本中是否含有抗肠病毒71型（EV71)的抗体。[0031]于某些具体实施例中，所述检测试剂盒为含有本发明的肠病毒71型（EV71)病毒株的重组VP0、VP1、VP2、VP3或VP4结构蛋白的抗原盘。所述重组VP0、VP1、VP2、VP3、VP4结构蛋白分别具有如SEQIDN0s:4、6、8、10、12所示的氨基酸序列，以作为抗原盘上的抗原。重组VP0、VP1、VP2、VP3或VP4结构蛋白的制造可以本发明
技术领域：
习知的方法获得，包含但不限于：以蛋白质合成仪合成、以分子克隆（molecularcloning)方式，将具有如编码所述结构蛋白的核苷酸序列（例如但不限于：SEQIDN0s:3、5、7、9、ll)插入表达载体中并转殖至表达宿主中以表达纯化所述蛋白质。接着将获得的蛋白调整至适当浓度后，包覆于微量平底培养盘，于37°C下作用适当时间后，于4°C包覆过夜；以PBS清洗后，加入BSA阻隔液（blockingsolution)阻隔（block)所述微量平底培养盘，置于37°C作用适当时间后以PBS洗涤，并存放于4°C下作为肠病毒71型（EV71)检测试剂盒备用。[0032]本发明所述的新颖的肠病毒71型（EV71)病毒株，亦应包含其继代培养的后代，或突变株，但仍具有与本发明所述的病毒株特性、基因体（genomic)、或致病性相同者。[0033]本发明所述的「DNA(核酸）」、「多核苷酸」、「氨基酸」、「胜肽」、「多肽」可为自然存在、单离的、重组的，或人工合成的。[0034]本说明书中所述的所有技术性及科学术语，除非另外有所定义，皆为所述所属领域具有通常技术人员可共同了解的意义。[0035]本发明以下面的实施例予以示范阐明，但本发明不受下述实施例所限制。[0036]实施例一肠病毒71型（EV71)的分离与鉴定[0037]1.肠病毒株的临床检体分离与鉴定[0038]以咽喉拭子采检患者检体后接种到人胚胎纤维母细胞（humanembryonicfibroblast)、LLC_MK2、HEp_2和横纹肌肉瘤（rhabdomyosarcoma，RD)细胞中，当超过50%的细胞呈现细胞病变效应（Cytopathiceffect，CPE)时，将细胞刮下以取得检体病毒液。以肠病毒特异性抗体（ChemiconInternationalInc.，Temecula,CA,USA)对检体病毒液进行间接萤光抗体染色（indirectfluorescentantibodystaining)，确认检体中肠病毒存在。另一方面，将检体病毒液进行肠病毒Pl结构蛋白基因序列定序，经由反转录聚合酶连锁反应（RT-PCR)及半套迭式聚合酶连锁反应（semi-nestedRT-PCR)所得的PCR产物纯化后以ABI3730XL自动定序仪进行定序以分型病毒，所得的肠病毒编号为EV71-1501-3,其Pl结构蛋白氨基酸序列如SEQIDNO:13所示。[0039]2.肠病毒株的再放大与鉴定[0040]将上述由检体中选出的肠病毒EV71-1501-3的代次定义为P。代。接着，将Vero细胞（非洲绿猴肾细胞，ATCCCCL81)以5.0x105cells/2ml/well的密度接种于6孔培养盘中，于37°C、5%CO2培养箱中培养16-20小时后，移除培养基并以磷酸盐缓冲溶液（phosphatebufferedsaline，PBS)清洗细胞，接着加入100μ1上述检体病毒EV71-1501-3的病毒液（Ρ。代）以及400μIMEM培养基，于37°C、5%0)2培养箱中进行病毒感染2小时后，各细胞样本中加入含有2%FBS的2mlMEM培养基，并于37°C、5%0)2培养箱中培养2-4天。[0041]将上述感染肠病毒71型EV71-1501-3(P。代）的Vero细胞以显微镜观察，当超过50%的细胞呈现细胞病变效应（Cytopathiceffect，CPE)时，收集细胞并以冰冻解冻(freeze-thaw)方式破坏细胞后离心收集含有肠病毒的上清液，重复上述继代步骤8次后，再以Reed与Muench方法测定病毒力价，选取病毒力价最高者（2xl(f6TCID5Q/ml)编号为EV71-1501-3-M3$8代），并继续进行分析。[0042]此外，以西方墨点分析法（westernblotting)鉴定由Vero细胞增殖的肠病毒株EV71-1501-3-M3是否为一肠病毒株。西方墨点分析法的做法为：将10μ1纯化样品，以5-12%梯度的正十二烷硫酸钠一聚丙烯酰胺胶体，于电压ISOmV之下进行电泳分离40分钟。利用湿式转移槽，将蛋白质样品由胶体转移至硝酸纤维膜上，加入5%脱脂奶粉溶液于纤维膜上，4°C震荡隔夜后，将以1:1000稀释的抗肠病毒71型单株抗体加至所述纤维膜上，在室温作用1小时后，以0.1%TWeen80/PBS清洗三次来清除未结合的抗体。加入1:5000稀释的HRP-conjugatedanti-mouse-IgG抗体，在37°C室温下作用I.5小时，以0·I%Tween80/PBS清洗三次来清除未结合的抗体。将适量的ECL呈色剂倒于纤维膜上，进行显影、定影与压片。[0043]西方墨点法分析结果如图1A、1B所示，本发明的肠病毒株EV71-1501-3-M3以及正对照组肠病毒株E49-1149(为EV71C4基因亚型，由台湾卫生福利部疾病管制署提供）分别可被抗-Enterovirus71VP1单株抗体（Abonva公司，台湾）（图1A)、抗Enterovirus71VP0单株抗体（Millpore公司，麻州，美国）（图1B)、抗Enterovirus71VP2单株抗体（Millpore公司，麻州，美国）（图1B)辨认，确认本发明所分离的病毒株为一肠病毒株。[0044]3.肠病毒株的基因序列分析[0045]萃取上述得到的肠病毒71型病毒株EV71-1501-3-M3$8代）的RNA，经过反转录聚合酉每连锁反应（reversetranscriptionpolymerasechainreaction,RT-PCR)后，将病毒基因进行核酸定序分析，得到Pl结构蛋白的DNA序列如SEQIDN0:1所示，其氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。[0046]比较上述由检体中分离的肠病毒71型EV71-1501-3(P。代）与其继代后肠病毒71型EV71-1501-3-M3(PsR)的Pl结构蛋白氨基酸序列，比对结果如图2所示，EV71-1501-3(P。代）与EV71-1501-3-M3(PsR)的Pl结构蛋白氨基酸序列中共有4个氨基酸残基的差异，分别为第114、269、467、684个氨基酸残基。比对结果显示，经过继代后，肠病毒EV71-1501-3发生变异，其Pl结构蛋白共有上述4个氨基酸残基发生变异，得到与肠病毒EV71-1501-3病毒株具有差异的EV71-1501-3-M3病毒株。[0047]接着，将上述EV71-1501-3-M3病毒株的DNA序列与氨基酸序列分别与美国国家生物技术信息中心（NCBI)基因资料库（GenBank)进行比对，结果分别如表1及表2所示（各仅列出比对结果前5笔资料），本发明的肠病毒71型病毒株EV71-1501-3-M3的基因序列与肠病毒71型病毒株（EV71)相似，相似度可达99%，但并无发现GenBank资料库中有与肠病毒71型病毒株EV71-1501-3-M3的基因序列完全一样（相似度100%)的肠病毒71型病毒株的存在。因此，由比对结果可知，本发明所得到的肠病毒71型病毒株EV71-1501-3-M3属于C4基因亚型，且为一新颖病毒株。[0048]表1肠病毒71型病毒株EV71-1501-3-M3的Pl结构蛋白的DNA序列于NCBI比对的结果[0049][0053]分析结果显示，本发明的肠病毒71型病毒株EV71-1501-3-M3的Pl结构蛋白的DNA序列如SEQIDNO:1所示，其氨基酸序列如SEQIDN0:2所示；Pl结构蛋白可被进一步水解为VPO、VP1、VP3结构蛋白，而VPO结构蛋白可再被进一步水解为VP2、VP4结构蛋白。本发明的肠病毒71型病毒株EV71-1501-3-M3的VPO、VP1、VP2、VP3、VP4结构蛋白的DNA序列分别如SEQIDN0:3,5,7,9,11所示，其氨基酸序列分别如SEQIDN0:4,6,8,10,12所不。[0054]经上述结果证实，本发明所提供的肠病毒71型病毒株EV71-1501-3-M3为一新颖的肠病毒71型病毒株，所述病毒株已于2014年11月20日保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC)，保藏号为CCTCCNO:V201412。[0055]实施例二肠病毒71型（EV71)灭活疫苗的制造[0056]以感染本发明的肠病毒株EV71-1501-3-M3的单层Vero细胞在含有2%FBS的MEM培养基内，于37°C、5%CO2培养箱中培养，至超过50%的细胞呈现细胞病变效应（CPE)时，收集细胞并以冰冻解冻方式破坏细胞后离心收集含有肠病毒的上清液，并以Reed与Muench方法测定病毒力价。[0057]将甲醛（formaldehyde)加入上述肠病毒收获液至最终浓度为0.01%，并于37°C震荡台均勾摇晃进行灭活。反应期间定期取样检测50%TissueCultureInfectionDose(TCIDm)观察病毒力价的变化，直至无病毒存活为止。[0058]接着，取100~120ml已灭活的病毒液，以27000rpm离心2-4小时后去除上清液，以l-3mlPBS重新悬浮病毒沉淀团块。将此悬浮液加至含有20mL15%蔗糖缓冲液离心管的液面表层，以23000rpm离心16小时后去除上清液，以20mlPBS冲散沉淀团块后，再以27000rpm离心2-4小时，去除上清液，以ImlPBS冲散沉淀团块，即得灭活病毒纯化液。[0059]所得的灭活病毒纯化液可直接作为灭活疫苗使用，或是再以AlPO4佐剂配制为含有佐剂的灭活疫苗。[0060]实施例三肠病毒71型（EV71)灭活疫苗的效力试验1[0061]1.小鼠免疫计画[0062]以6至8周龄健康雌性ICR品系小鼠50只作为试验动物，小鼠购买自台湾大学动物中心（台北，台湾），并于台湾大学动物中心进行试验。所有小鼠的血清在试验前皆呈现肠病毒抗体阴性的状态。将这50只小鼠随机分为10组，每组5只，分别依照下列组别施打肠病毒疫苗，以腹腔注射进行免疫，注射剂量为100μ1/只/次，分别于试验第〇天、第14天、第28天进行初次免疫、二次免疫、三次免疫，并且于试验第0天、第7天、第27天、第42天进行采血，并将各组5只小鼠的血液样本合而为一，再分离取得血清样品。试验组别如下：[0063]第1组：Iyg肠病毒株EV71-1501-3-M3病毒蛋白；[0064]第2组：1μg肠病毒株EV71-1501-3-M3病毒蛋白+30μgAlPO4佐剂；[0065]第3组：5μg肠病毒株EV71-1501-3-M3病毒蛋白；[0066]第4组：5μg肠病毒株EV71-1501-3-M3病毒蛋白+30μgAlPO4佐剂;[0067]第5组：1μg肠病毒株E49-1149病毒蛋白；[0068]第6组：1μg肠病毒株E49-1149病毒蛋白+30μgAlPO4佐剂；[0069]第7组：5μg肠病毒株E49-1149病毒蛋白；[0070]第8组：5μg肠病毒株E49-1149病毒蛋白+30μgAlPO4佐剂;[0071]第9组：PBS阴性对照组；[0072]第10组：PBS+30μg磷酸铝（AlPO4)佐剂阴性对照组。[0073]2.中和抗体测试：[0074]将RD细胞株（横纹肌瘤细胞株，Rhabdomyosarcoma，ATCCCCL-136)以5xl04cells/well的密度接种于96孔细胞培养盘中，于37°C、5%CO2培养箱中培养16-20小时。另一方面，将上述采集的各血清样品置于56°C水浴槽恒温加热30分钟，接着于96孔细胞培养盘上使用含有2%FBS的MEM培养基，将血清样品进行2倍连续稀释后，各样品中加入等体积的IOOTCId5。肠病毒（C4亚型肠病毒株EV71-1501-3-M3,或C4亚型肠病毒株E49-1149,或M亚型肠病毒株2847)，并以血清样品作为血清对照组，以含有2%FBS的MEM培养基作为细胞对照组。接着将各样品置于37°C、5%0)2培养箱中进行中和作用2小时后，以PBS清洗后，将已完成中和作用的血清样品移至含有RD细胞的96孔细胞培养盘中(100μΙ/well)，于37°C、5%CO2培养箱中培养5天后，进行结晶紫染色后以肉眼判读结果，以血清在最高稀释浓度下，仍可抑制病毒感染细胞的倍率为中和抗体效价。[0075]中和抗体测试结果如图3A、3B、3C所示；施打含磷酸铝佐剂的Iyg本发明肠病毒株EV71-1501-3-M3病毒蛋白的小鼠血清样品，于稀释1024倍之后，仍具有中和C4亚型肠病毒株EV71-1501-3-M3、C4亚型肠病毒株E49-1149以及M亚型肠病毒株2847的能力，使细胞免于肠病毒的感染。而施打含磷酸铝佐剂的5yg本发明肠病毒株EV71-1501-3-M3病毒蛋白的小鼠血清样品，于稀释512倍之后，亦仍具有中和C4亚型肠病毒株EV71-1501-3-M3、C4亚型肠病毒株E49-1149以及M亚型肠病毒株2847的能力。本发明的肠病毒株EV71-1501-3-M3除了可使小鼠产生抗肠病毒株EV71-1501-3-M3的中和抗体之外，亦可诱发对C4亚型肠病毒株E49-1149以及M亚型肠病毒株2847的交叉保护能力。且相较于对照组肠病毒株E49-1149的中和抗体效价，本发明的肠病毒株EV71-1501-3-M3明显具有较高的中和抗体效价。[0076]实施例四肠病毒71型（EV71)灭活疫苗的效力试验2[0077]1.兔免疫计画[0078]以6至8周龄健康NewZealand品系雌兔4只作为试验动物，试验兔购买自台湾大学动物中心（台北，台湾），并于台湾大学动物中心进行试验。所有试验兔的血清在试验前皆呈现肠病毒抗体阴性的状态。将这4只试验兔随机分为2组（试验组与阴性对照组），每组2只；试验组以腹腔注射施打含有30μg磷酸铝佐剂的100μg肠病毒株EV71-1501-3-M3病毒蛋白，而阴性对照组则以腹腔注射施打含有30μg磷酸铝佐剂的PBS溶液；每只试验兔的注射剂量为600μ1/只/次，分别于试验第0天、第14天、第28天进行初次免疫、二次免疫、三次免疫，并且于试验第〇天、第14天、第28天、第42天进行采血分离取得血清样品[0079]2.中和抗体测试[0080]将Vero细胞株以2.5x104cells/well的密度接种于96孔细胞培养盘中，于37°C、5%CO2培养箱中培养16-20小时。另一方面，将上述采集的各血清样品置于56°C水浴槽恒温加热30分钟，接着于96孔细胞培养盘上使用含有2%FBS的MEM培养基，将血清样品进行2倍连续稀释后，各样品中加入等体积的IOOTCId5。肠病毒（C4亚型肠病毒株EV71-1501-3-M3,或C4亚型肠病毒株A、B、C、D，或M亚型肠病毒株2847)，并以血清样品作为血清对照组，以含有2%FBS的MEM培养基作为细胞对照组。接着将各样品置于37°C、5%0)2培养箱中进行中和作用2小时后，以PBS清洗后，将已完成中和作用的血清样品移至含有Vero细胞的96孔细胞培养盘中（100μΙ/well)，于37°C、5%CO2培养箱中培养7天后，以肉眼判读结果，以血清在最高稀释浓度下，仍可抑制病毒感染细胞的倍率为中和抗体效价。[0081]中和抗体测试结果如图4A、4B所示；施打含磷酸铝佐剂的100μg本发明肠病毒株EV71-1501-3-M3病毒蛋白的兔血清样品，于稀释512倍之后，仍具有中和C4亚型肠病毒株EV71-1501-3-M3的能力，使细胞免于肠病毒的感染。而上述两只兔血清样品于稀释512倍时，仍具有中和C4亚型肠病毒株B的能力；上述两只兔血清样品分别于稀释1024倍与512倍时，仍具有中和C4亚型肠病毒株C的能力；上述两只兔血清样品分别于稀释2048倍与512倍时，仍具有中和C4亚型肠病毒株D的能力；上述两只兔血清样品分别于稀释1024倍与256倍时，仍具有中和B亚型肠病毒株的能力。由此可知，本发明的肠病毒株EV71-1501-3-M3除了可使兔产生抗肠病毒株EV71-1501-3-M3的中和抗体之外，亦可诱发对C4亚型肠病毒株以及B亚型肠病毒株的交叉保护能力。[0082]上列详细说明系针对本发明之一可行实施例的具体说明，惟该实施例并非用以限制本发明的专利范围，凡未脱离本发明技艺精神所为的等效实施或变更，均应包含于本案的专利范围中。【主权项】1.一种肠病毒71型（Entrovirus71，EV71)病毒株，其特征在于，所述病毒株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCNO:V201412。2.如权利要求1所述的肠病毒71型（EV71)病毒株，其特征在于，所述病毒株的VP1结构蛋白的氨基酸序列如SEQIDN0:6所示。3.如权利要求1所述的肠病毒71型（EV71)病毒株，其特征在于，所述病毒株的VP2结构蛋白的氨基酸序列如SEQIDN0:8所示。4.如权利要求1所述的肠病毒71型（EV71)病毒株，其特征在于，所述病毒株的VP3结构蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO:10所示。5.-种含有如权利要求1所述的肠病毒71型（EV71)病毒株的免疫组合物。6.如权利要求5所述的免疫组合物，其特征在于，所述免疫组合物进一步包含药学上可接受的载体。7.如权利要求5所述的免疫组合物，其特征在于，进一步包含至少一种病原抗原，所述病原抗原为柯萨基病毒（Coxsackievirus)、艾柯病毒（Echovirus)、脊髓灰质炎病毒(Poliovirus)、肠病毒（Enterovirus)、乙型肝炎病毒（HepatitisBvirus)、牛结核分支杆菌（Mycobacteriumbovis)、白喉杆菌（Corynebacteriumdiphtheriae)、破伤风杆菌（Clostridiumtetani)、百日咳杆菌（Bordetellapertussis)、流行性感冒嗜血杆菌(Haemophilusinfluenza)、水痕-带状疱疼病毒（varicella-zostervirus)、麻疼病毒(Measlesvirus)、聰腺炎病毒（Mumpsvirus)、风疹病毒（Rubellavirus)、乙型脑炎疫苗(JapaneseEncephalitisvirus)、轮状病毒（Rotavirus)及流行性感冒病毒（Influenzavirus)〇8.-种抗肠病毒71型（EV71)的抗体，其特征在于，是通过如权利要求1所述的肠病毒71型（EV71)病毒株所制造而得。9.如权利要求8所述的抗体，其特征在于，所述抗体为下列其中至少一种：一单株抗体、一多株抗体，以及一经基因重组的抗体。10.-种多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸编码如权利要求1所述的肠病毒71型(EV71)病毒株的结构蛋白的氨基酸序列，所述结构蛋白的氨基酸序列为下列其中至少一种：SEQIDN0:2、SEQIDN0:4、SEQIDN0:6、SEQIDN0:8，以及SEQIDN0:10。11.如权利要求10所述的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸的DNA序列为下列其中至少一种：SEQIDN0:1、SEQIDN0:3、SEQIDN0:5、SEQIDN0:7,以及SEQIDN0:9。12.-种肠病毒71型（EV71)的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒包含一侦测单元，所述侦测单元是选自于下列群组所组成中至少一者：一如权利要求1所述的肠病毒71型（EV71)病毒株的病毒抗原、一通过如权利要求1所述的肠病毒71型（EV71)病毒株所制造的抗体、如SEQIDN0s:2、4、6、8、10所示的氨基酸序列的蛋白质，以及一如权利要求10所述的多核苷酸。13.如权利要求12所述的检测试剂盒，其特征在于，所述抗体为下列其中至少一种：一单株抗体、一多株抗体，以及一经基因重组的抗体。14.如权利要求12所述的检测试剂盒，其特征在于，所述多核苷酸的DNA序列为下列其中至少一种：SEQIDN0:1、SEQIDN0:3、SEQIDN0:5、SEQIDN0:7,以及SEQIDN0:9。【文档编号】C12R1/93GK105861448SQ201510026853【公开日】2016年8月17日【申请日】2015年1月20日【发明人】黄立民,张銮英,郭村勇【申请人】基亚生物科技股份有限公司