短嘴矮小综合症小鹅瘟灭活疫苗的制备方法
【专利摘要】本发明公开了短嘴矮小综合症GPV分离株（SBGPV?M15株），保藏在CCTCC，保藏日期：2016年3月16日，保藏编号：CCTCC V201612，本发明还公开了SBGPV?M15株应用于短嘴矮小综合症小鹅瘟灭活疫苗的制备方法，该疫苗能有效预防和控制由短嘴矮小综合症小鹅瘟病毒引起半番鸭和樱桃谷鸭的短嘴矮小综合症。CCTCC NO: V20161220160316
【专利说明】
短嘴矮小综合症小鹅瘟灭活疫苗的制备方法
技术领域
[0001 ]本发明涉及短嘴矮小综合症小鹅瘟灭活疫苗的制备方法。
【背景技术】
[0002] 2015年以来，我国半番鸭和樱桃谷鸭流行一种以软脚、短嘴和生长障碍为主要特 征的新发疫病（暂名"短嘴矮小综合症"，养殖户称之为"短嘴病"、"玻璃鸭"、"长舌鸭"等 等）。其中福建省漳州地区（含漳浦、龙海)的半番鸭最为严重，山东、安徽、江苏、河南和浙江 等省的樱桃谷鸭也出现不同程度流行。该病发病率1 〇%~1 〇〇%，死亡率低2%~10%，但僵鸭淘 汰率可高达80%，发病耐过鸭的出栏体重比健康鸭平均低2斤左右(按5元/斤计算，出栏鸭每 只净减少10元收入，不包括淘汰鸭的损失），病因不明，缺乏有效的防控措施，给我国养殖业 造成很大的经济损失。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的是提供一种安全有效的短嘴矮小综合症小鹅瘟灭活疫苗制备方法， 以达到预防和控制因短嘴型（或短嘴矮小型）小鹅瘟病毒感染引起半番鸭和樱桃谷鸭的短 嘴矮小综合症。福建省农业科学院畜牧兽医研究所在国内外首先分离、鉴定了该病病原为 新型小鹅瘟病毒或小鹅瘟病毒变异株，鉴于该病以短喙和生长障碍为临床特征，暂将该病 原命名为短嘴型(或短嘴矮小型)小鹅瘟病毒。
[0004] 本发明是通过如下技术方案来实现的： 分离自软脚、短嘴和生长障碍的半番鸭肝脾组织的短嘴矮小综合症小鹅瘟病毒(SBDS-GPV M15株）[保藏在CCTCC，保藏日2016年3月16日，保藏编号:CCTCCNO: V201612]，在番鸭 胚成纤维细胞或番鸭胚尿囊腔中增殖，收取LPA效价达24的病毒液，经甲醛灭活后，按适当 比例与油佐剂混匀，制备成安全有效的短嘴矮小综合症小鹅瘟灭活疫苗。该疫苗能有效预 防和控制由短嘴型小鹅瘟病毒引起半番鸭和樱桃谷鸭的短嘴矮小综合症。
【具体实施方式】
[0005] 以下结合具体实施例对本发明进一步说明（但不是对本发明的限制）。
[0006] 短嘴矮小综合症小鹅瘟病毒（SBDS-GPV M15株)能在11日龄番鸭胚尿囊腔和MDEF 细胞中稳定增殖传代，并能致部分胚胎死亡和细胞病变，具有如下特性:SBGPV-M15株经尿 囊腔接种11日龄番鸭胚，胚液LPA效价达2 3以上；对番鸭胚成纤维细胞TCID5q 2 10-3· V 0.1 ml;该毒株保藏在中国武汉大学的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏日2016年3月 16日，保藏编号:CCTCC N0:V201612,分类命名：短嘴矮小综合症小鹅瘟病毒(SBDS-GPV M15 株)。
[0007] 本发明所述的上述短嘴矮小综合症小鹅瘟病毒(SBDS-GPV M15株）用于短嘴矮小 综合症小鹅瘟灭活疫苗的制备方法： (I)SBDS-GPV M15株的增殖:将SBDS-GPV M15株用灭菌Hanks液1:10稀释后，经尿囊腔 途径接种10~11日龄番鸭胚，o.lml/枚，37°C温箱培养，每日观察2次至第7天，弃去24h内的 死胚，收获48h~168h的胚液，-20 °C冻存。
[0008] (2)病毒含量LPA效价测定:取灭活前胚液毒以本团队制备的抗GPV单抗致敏胶乳 测定LPA效价，当胚液LPA 2 24时，可用于病毒的灭活。
[0009] (3)病毒灭活和浓缩:将LPA 2 24的胚液，加入终浓度为0.1%的甲醛，37°C24h灭活， 置于4 °C保存备用。
[0010] (4)灭活验证:取灭活并浓缩后的胚液接种11日龄番鸭胚，O.lml/枚，37°C温箱培 养，丢弃24h内死亡的番鸭胚，第2天至第7天，番鸭胚应全部存活且LPA为阴性。
[0011] (5)疫苗配制：按1:1.5的比例加入灭活胚液和油佐剂，搅拌均匀制成油包水型乳 剂疫苗。
[0012] (6)疫苗免疫学指标测定 6.1无菌检验:按现行《中华人民共和国兽药典》附录进行，均无菌生长。
[0013] 6.2安全检验：用2日龄无母源抗体樱桃谷鸭各20羽，随机分成2组，每组10羽。试 验组每羽颈部皮下注射0.5ml疫苗;对照组每羽腿部肌肉注射0.5ml Hanks液；隔离饲养并 观察20天，接种鸭采食、饮水等未见异常，全部存活，且体重和喙发育均正常。表明该灭活疫 苗对2日龄樱桃谷鸭具有良好的安全性。
[0014] 6.3效力检测 6.3.1疫苗免疫樱桃谷鸭的攻毒保护力 取2d樱桃谷鸭(抗体阴性)30羽，随机分成3组，其中健康对照组和攻毒对照组各10羽， 不免疫；免疫攻毒组10羽，每羽腿肌注射灭活苗〇.2mL，并于免疫后7天连同攻毒对照组10 羽，口服感染SBGPV-Ml 5株0.3ml/羽，观察28天，测定各组体重、喙长宽、发病率和死亡率。 [0015] 结果显示(见表1):攻毒对照组(9日龄樱桃谷鸭）口服感染后7天(PI7d)个别鸭拉 白色稀便、拱背羽毛蓬松，喜卧至软脚，精神萎顿、食欲下降，PI20d后可观察到短喙、长舌、 骨折鸭，至PI 28d的发病率为60%，死亡率为零;而健康对照组和免疫攻毒组鸭均未出现上 述症状，且体重、喙长等均明显高于攻毒对照组。表明2d樱桃谷鸭免疫后7天可有效抵抗短 嘴矮小综合症GPV强毒的攻击。
[0016]表1、2d樱桃谷鸭免疫后7天对强毒的保护结果
注:表中数据为攻毒后28d(即37日龄)的结果 6.3.2疫苗免疫抗体水平测定 取55d半番鸭(抗GPV LPAI抗体阴性)30羽，随机分成2组，其中对照组10羽不免疫;免疫 组每羽腿肌注射灭活苗1.0 mL;分别于免疫前、免疫后(PI) 14d、2Id、28d、56d采血分离血清， 测定GPV LPAI抗体效价。
[0017] 结果显示(见表2):对照组直至试验结束血清抗体均为阴性;免疫组免疫后14天抗 SB GPV抗体全部阳转，平均抗体达2.61og2,免疫后21天抗体逐渐升高至较高水平，直至免 疫后56天抗体仍处于高峰期。表明该灭活苗免疫半番鸭能诱导良好的抗体应答。
[0018] 表2、半番鸭灭活痔苗免痔后的LPAI抗体水平测宙结果
注:表中数据表示10羽鸭血清LPAI效价平均值(Log2负对数的平均数）。
【主权项】
1. 短嘴矮小综合症小鹅瘟病毒(SBDS-GPV M15株），该毒株保藏在中国武汉大学的中国 典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏日2016年3月16日，保藏编号:CCTCC V201612。2. 根据权利要求1所述的短嘴矮小综合症小鹅瘟病毒(SBDS-GPV M15株)用于短嘴矮小 综合症小鹅瘟灭活疫苗的制备方法： (1) SBDS-GPV M15株的增殖:将SBDS-GPV M15株用灭菌Hanks液1:10稀释后，经尿囊腔 途径接种10~11日龄番鸭胚，0.1ml/枚，37°C温箱培养，每日观察2次至第7天，弃去24h内的 死胚，收获48h~168h的胚液，-20 °C冻存； (2) 病毒含量LPA效价测定：取灭活前胚液毒以本团队制备的抗GPV单抗致敏胶乳测定 LPA效价，当胚液LPA 2 24时，可用于病毒的灭活； (3) 病毒灭活和浓缩:将LPA 2 24的胚液，加入终浓度为0.1%的甲醛，37°C24h灭活，置于4 °C保存备用； (4) 灭活验证:取灭活并浓缩后的胚液接种11日龄番鸭胚，0.1ml/枚，37°C温箱培养，丢 弃24h内死亡的番鸭胚，第2天至第7天，番鸭胚应全部存活且LPA为阴性； (5) 疫苗配制：按1:1.5的比例加入灭活胚液和油佐剂，搅拌均匀制成油包水型乳剂疫 苗。
【文档编号】A61K39/23GK105861449SQ201610193595
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年3月31日
【发明人】陈少莺, 陈仕龙, 程晓霞, 俞伏松, 林锋强, 朱小丽, 王劭, 肖世峰, 吴南洋, 王锦祥
【申请人】福建省农业科学院畜牧兽医研究所, 陈少莺