一种番鸭细小病毒病、小鹅瘟二联疫苗的制作方法
【专利摘要】本发明提供一种番鸭细小病毒病和小鹅瘟二联灭活疫苗，所用抗原为灭活的番鸭细小病毒和番鸭源小鹅瘟病毒，其中番鸭细小病毒的保藏编号为CGMCC No.8504；番鸭源小鹅瘟病毒的保藏编号为CCTCC NO:V201620。本发明通过筛选出具有病毒含量高，免疫原性好的番鸭细小病毒YBMDP株和番鸭源小鹅瘟病毒YBGPV?M株。再接种鸭胚后收取感染的胚体和尿囊液，经匀浆、超滤浓缩、甲醛溶液灭活后，加油佐剂混合乳化制成疫苗。本发明制备的疫苗免疫种番鸭能同时提高种番鸭的两种抗体水平，保证其子代母源抗体水平，预防番鸭细小病毒和番鸭源小鹅瘟病毒引起的雏番鸭细小病毒病和小鹅瘟病毒感染。CGMCC No.850420131108CCTCC NO:V20162020160331
【专利说明】
-种番鸭细小病毒病、小鹤痘二联疫苗
技术领域
[0001] 本发明属于家禽病原微生物筛选技术领域，具体设及一种番鸭细小病毒病和小碟 攝二联灭活疫苗的制备及其应用。
【背景技术】
[0002] 番鸭细小病毒病是侵害维番鸭的一种急性或亚急性传染病，是W喘气、腹泻及膜 脏坏死和出血为主要特征的传染病;具有高度传染性，且发病率和死亡率都很高，常造成严 重的经济损失。该病主要发生于1~3周龄的维番鸭，尤其是10日龄左右的维番鸭，而当达到 3周龄W上就基本不发病了。本病最早于20世纪80年代中后期出现于中国福建和法国西部 化ittany地区，20世纪90年代初才认识到它是不同于小碟攝的独立疾病。
[0003] 碟细小病毒病又称Derzsy氏病，俗称碟流感、碟或小碟攝、碟肝炎、碟肠炎、传染性 屯、肌炎、复水性肝肾炎等，是一种侵害幼碟和番鸭的一种高度接触传染性疾病，病名的多样 性反映了该病多个病理学特征。根据感染维碟、维鸭的日龄不同，该病可表现为急性、亚急 性和慢性型。急性型可引起10日龄W内的维碟100%死亡。许多国家也报道了一种抗原性完 全不同的番鸭细小病毒感染，死亡率高达80%。该病主要发生于1~3周龄的维碟和维番鸭， 尤其是1周龄左右的更易感，4周龄W上的碟或番鸭感染后，很少表现临床症状。本病最早于 20世纪60年代中后期出现于中国和许多欧洲国家，直到1978年才将该病称为碟细小病毒感 染，但是通过病毒中和试验、分子生物学研究证明，从碟和番鸭分离到的细小病毒有明显的 差异。
[0004] 如果对死亡的番鸭处理不当，往往造成病毒的蔓延，产生更大的危害。因此，就需 要筛选出效价高、免疫原性好的番鸭细小病毒、小碟攝病毒来制备疫苗。而且，由于病毒变 异导致使用的疫苗效价降低，也需要筛选出变异的病毒株来制备疗效更高的疫苗。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供种番鸭细小病毒病和小碟攝二联灭活疫苗，能够有效预防番 鸭细小病毒病和小碟攝。
[0006] 本发明提供的番鸭细小病毒病、小碟攝二联灭活疫苗，包括有抗原和疫苗佐剂，所 用抗原为灭活的番鸭细小病毒和番鸭源小碟攝病毒，
[0007] 其中番鸭细小病毒，为YBMDP株，已于2013年11月08日保藏于北京市朝阳区北辰西 路1号院3号中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中屯、， 保藏编号为CGMCC No.8504。
[000引其中番鸭源小碟攝病毒，为番鸭源小碟攝病毒YBGPV-M株，于2016年3月31日保藏 在中国典型培养物保藏中屯、(地址：中国武汉武汉大学），保藏编号为CCTCC N0:V201620。
[0009] 其中的番鸭细小病毒和番鸭源小碟攝病毒均经过甲醒溶液灭活；
[0010] 作为优选，疫苗用中番鸭细小病毒的含量应不低于105'7化化〇;番鸭源小碟攝病毒 的含量不低于1〇6'5化LDso。
[0011] 上述灭活疫苗的制备方法如下：
[0012] 1)油相制备:取兽用白油95份，硬脂酸侣1份，置于油相制备罐中加热至80°C后，再 加 5份的司本-80，至溫度达到115 °C时，维持30min，冷却后备用；
[001引 2)水相制备：将灭活的YBMDP株和YBGPV-M株病毒液按1:1的比例加入水中，使每 0.2ml水中YBMDP株病毒含量不低于105'^LD5q;YBGPV-M株病毒含量不低于lOS'^ELDso。取灭 菌后的5份吐溫-80,加入配液罐中，同时加入病毒混液95份，揽拌20~30min，使吐溫-80完 全溶解；
[0014] 3)乳化:取油相2份放于高速剪切机内，开动电机慢速转动揽拌，同时徐徐加入水 相1份，W lOOOOr/min，乳化5分钟，乳化后，取10ml，W3000r/min离屯、15分钟完成制备。
[0015] 本发明通过筛选出具有病毒含量高，免疫原性好的用番鸭细小病毒YBMDP株和番 鸭源小碟攝病毒YBGPV-M株。再接种鸭胚后收取感染的胚体和尿囊液，经匀浆、超滤浓缩、甲 醒溶液灭活后，加油佐剂混合乳化制成疫苗。本发明制备的疫苗免疫种番鸭能同时提高种 番鸭的两种抗体水平，保证其子代母源抗体水平，预防番鸭细小病毒和番鸭源小碟攝病毒 引起的维番鸭细小病毒病和小碟攝病毒感染;免疫1日龄维番鸭，两种抗体均是10天就可产 生，能有效预防维番鸭细小病毒和番鸭源小碟攝病毒引起的维番鸭细小病毒病和小碟攝病 毒感染。此疫苗具有高效、安全性好，且有打一针防两病的优点。
【具体实施方式】
[0016] 下面结合具体实施例对本发明进行详细的描述。本发明所应用的方法可W采用疫 苗制备领域中常用的方法，而不仅限于本发明实施例的具体记载，本领域的普通技术人员 可W其它常规方法来实现本发明。
[0017] 实施例1番鸭细小病毒制苗毒株(YBMDP)筛选
[001引1 .YBMDP株的筛选2011年从浙江省某鸭场爆发了急性的番鸭细小病毒病，取病死 鸭的膜脏及肠道，将膜脏及肠道组织用无生理盐水匀浆制成20%悬液，300化/min离屯、 15min，取上清除菌后经尿囊腔分别接种13日龄番鸭胚，解化120小时，收集尿囊液及胚体组 织，经匀浆后，反复冻融3次，取上清液冻存。收获的病毒液经纯化后进行了病毒含量、免疫 原性、特异性及纯净性等方面的病毒特性的分析检测，结果表明该毒株病毒含量为 105'7ELD50/0.2ml，最小免疫剂量为102'DeLD50/0.2ml，该病毒仅与番鸭细小病毒发生特异性 反应，无细菌、支原体及外源病毒污染，适合作为制苗用毒株。将筛选的病毒株于2013年11 月08日保藏于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所的中国微生物菌 种保藏管理委员会普通微生物中屯、，保藏编号为CGMCC No. 8504。
[0019] 对于本发明筛选的毒株的性状进行检测，结果表明，该株病毒属细小病毒，圆形无 囊膜，直径在20nm左右、对乙酸、膜蛋白酶、酸不敏感，对红细胞无凝集现象。该病毒可引起 维番鸭发生W出血性肠炎为特征的急性败血性传染病。该毒株制备的疫苗免疫成年番鸭 后，能保护免疫4个月内种番鸭所产子代免受流行毒株的攻击。该毒株作100倍稀释后，与等 量维番鸭细小病毒病抗血清中和，接种12日龄番鸭胚，结果中和组番鸭胚全部健活，而病毒 对照组番鸭胚全部死亡。
[0020] 对筛选的YBMDP株的结构基因 VP进行测序，结果VP基因全长为2199bp，编码约732 个氨基酸。将该基因与NCBI GenBank中收录的7个国内外MDPV毒株的VP基因进行进化树及 核巧酸序列同源性分析，结果表明，YBMDP株的结构基因 VP与已公开的MDPV的VP基因的序列 同源性介于89.3 %~99 % ;同时由于MDPV与GPV毒株的VP基因序列相似性相对较高，还进行 了与国内外29个GPV的VP基因进行了进化树及基因序列同源性分析，结果发现，MDPV和GPV 存在较大差异，处于两个明显不同的进化分支，YBMDP株与29个GPV毒株的VP基因序列同源 性介于79.9 %~89.4 %之间。
[0021] 2. YBGPV-M 株的筛选
[0022] 2013年从福建省某鸭场的维番鸭群中出现了 W腹泻、部分鸭肠粘膜脱落形成栓塞 为主要特征的疫病，发病率50 %~80 %，病死率45 %~70 %，临床上使用抗菌素、番鸭细小 病毒病疫苗及番鸭细小高免卵黄抗体均不能控制病情，我们无菌采集溯死鸭的肝脏、脾脏 及膜腺，将肝脏、脾脏及膜腺用无菌生理盐水匀浆制成20 %悬液，300化/min离屯、15min，取 上清除菌后经尿囊腔分别接种11日龄番鸭胚，解化168小时，收集24小时后死亡胚的尿囊液 及胚体组织，经匀浆后，反复冻融3次，取上清液冻存。收获的病毒液经纯化后进行了病毒含 量、免疫原性、特异性及纯净性等方面的病毒特性的分析检测，结果表明该毒株病毒含量为 106'WeLD5q/0.2ml，最小免疫剂量为102'吃LDsq/O . 2ml，该病毒仅与小碟攝病毒发生特异性反 应，无细菌、支原体及外源病毒污染，适合作为制苗用毒株。将筛选的病毒株于2016年3月31 日保藏在中国典型培养物保藏中屯、（地址：中国武汉武汉大学），保藏编号为CCTCC NO: V201620。
[0023] 对于本发明筛选的毒株的性状进行检测，结果表明，该株病毒属细小病毒，圆形无 囊膜，直径在20~22皿左右、对理化因素的灭活作用有很强的抵抗力65°C加热处理30min病 毒滴度不受影响，37°C作用1小时仍稳定，对乙酸、膜蛋白酶、酸不敏感，对红细胞无凝集现 象。该病毒可引起维番鸭发生W腹泻、部分鸭肠粘膜脱落形成栓塞为特征疫病。该毒株制备 的疫苗免疫1日龄维番鸭，10天就可产生抗体，免疫期可达6个月W上;免疫成年番鸭后，能 保护免疫6个月内种番鸭所产子代免受流行毒株的攻击。该毒株作100倍稀释后，与等量番 鸭源小碟攝毒病抗血清中和，接种11日龄番鸭胚，结果表明，中和组番鸭胚全部健活，而病 毒对照组番鸭胚全部死亡。
[0024] 对筛选的YBGPV-M株的结构基因 VP进行测序，结果VP基因全长为2199bp，编码约 732个氨基酸。将该基因与NCBI GenBank中收录的28个国内外GPV毒株的VP基因进行进化树 及核巧酸序列同源性分析，结果表明，YBGPV-M株的VP基因与已公开的GPV的VP基因的序列 同源性介于85.9%~90.3 %之间；同时由于MDPV与GPV毒株的VP基因序列相似性相对较高， 还进行了 YBGPV-M株与国内外8个MDPV (含YBMDP株)的VP基因进行了进化树及基因序列同源 性分析，结果发现，GPV与MDPV存在较大差异，处于两个明显不同的进化分支，YBGPV-M株与8 个MDPV毒株的VP基因序列同源性介于80.4 %~89.6 %之间。
[00巧]3. YBMDP与YBGPV-M株同源性比较
[0026] 从基于MDPV、GPV毒株VP基因进化树W及基因序列同源性比较结果来看，制苗的两 个毒株YBMDP、YBGPV-M处于进化树的两个明显的进化分支，两者结构基因 VP的同源性仅有 80.9%。
[0027] 实施例2制备疫苗
[00%] 1.制苗用病毒液的制备
[0029] 1.1YBMDP株病毒液的制备将生产用毒种YBMDP株用无菌生理盐水稀释100倍，尿 囊腔接种11~12日龄易感番鸭胚，每胚0.2ml，37°C解育，每日2次照胚检查。选择接种后48 ~168小时内死亡的鸭胚，置2~8°C4~12小时，无菌条件下打开气室，挑取胚体有广泛出 血，毛囊出血，肝脏变性和坏死，绒毛尿囊膜有轻度水肿的胚，取其胚体(去掉头和四肢)放 入组织捣碎机中粉碎，收取尿囊液、羊水，用胚液匀浆，取粉碎后的组织按1:1加入生理盐水 混合，冻融3次，400化/min离屯、30min，取上清混合于无菌容器中，置2~8°C保存。
[0030] 1.2YBGPV-M株病毒液的制备将生产用毒种YBGPV-M株用无菌生理盐水稀释100 倍，尿囊腔接种11~12日龄易感番鸭胚，每胚0.2ml，37°C解育，每日2次照胚检查。选择接种 后48~168小时内死亡的鸭胚，置2~8°C4~12小时，无菌条件下打开气室，挑取胚体有广泛 出血，毛囊出血，肝脏变性和坏死，绒毛尿囊膜有轻度水肿的胚，取其胚体(去掉头和四肢） 放入组织捣碎机中粉碎，收取尿囊液、羊水，用胚液匀浆，取粉碎后的组织按1:1加入生理盐 水混合，冻融3次，40(K)r/min离屯、30min，取上清混合于无菌容器中，置2~8°C保存。
[0031] 2.灭活将￥810口株和￥86口￥-1株病毒液分别置于灭活瓶内，计量加入10%甲醒溶 液，随加随摇，使其充分混合，甲醒溶液的最终浓度为0.2%。加甲醒溶液后倒入另一灭活瓶 中，W避免瓶口附近粘附的病毒未能接触灭活剂。37°C灭活16小时后取出，置2~8°C保存。
[0032] 3.半成品检验
[0033] (1)无菌检验取灭活的两种胚液，分别按现行《中国兽药典》附录进行无菌检验。
[0034] (2)病毒含量测定将YBMDP株和YBGPV-M株病毒液分别用灭菌生理盐水作10倍系 列稀释，取1〇-3、1〇-4、1〇-5、1〇-6 4个稀释度，分别尿囊腔接种11~12日龄易感番鸭胚，每胚 0.2ml，同时设接种生理盐水对照5枚，每胚0.2ml。置37°C继续解育，每日照胚2次，观察168 小时。W鸡胚死亡并出现尿囊膜水肿增厚，头、颈、背部等全身出血性病变判为感染，分别计 算 YBMDP 株和 YBGPV-M 株的 ELDso。
[0035] (3)灭活检验分别将YBMDP株和YBGPV-M株灭活后的病毒液尿囊腔接种11~12日 龄易感番鸭胚10枚，每胚0.2ml，置37°C继续解育，连续观察168小时。
[0036] 4.灭活疫苗的制备
[0037] 经过检验合格后的半成品抗原进行疫苗制备下配制中各液体成分按体积比 计)。
[003引（1)油相制备取兽用白油95份，硬脂酸侣1份，置于油相制备罐中加热至80°C后， 再加司本一80 5份，至溫度达到115°C时，维持30min，冷却后备用。
[0039] (2)水相制备将灭活检验合格的YBMDP株和YBGPV-M株病毒液按1:1比例混合，再 按所测定的YBMDP株和YBGPV-M株病毒液的效价计入一定量的无菌生理盐水，使每0.2ml水 相中YBMDP株病毒含量不低于104'吃LD50;YBGPV-M株病毒含量不低于104'WeLD5〇。取灭菌后的 吐溫-80 5份，加入配液罐中，同时加混合抗原液95份，开动揽拌电机揽拌20~30min，使吐 溫-80完全溶解。
[0040] (3)乳化取油相2份放于高速剪切机内，开动电机慢速转动揽拌，同时徐徐加入水 相1份，W1000化/min，乳化5分钟。乳化后，取10ml，W3000r/min离屯、15分钟，管底析出的水 相应不超过0.5ml。
[0041] 5.疫苗成品检验
[0042] (1)性状
[0043] 外观疫苗应为乳白色乳剂，无杂质并且外包装应合格。
[0044] 剂型为油包水型。取一清洁吸管，吸取少量疫苗滴入冷水中，除第1滴外，均应不 扩散。
[0045] 稳定性吸取疫苗10ml加入离屯、管中，W3000r/min离屯、15分钟，管底析出的水相 应不超过0.5ml。
[0046] 黏度按现行《中国兽药典》附录进行，应符合规定。
[0047] (2)装量检查按现行《中国兽药典》附录进行，应符合规定。
[0048] (3)无菌检验按现行《中国兽药典》附录进行，应符合规定。
[0049] (4)安全检验用1日龄健康易感维番鸭10只，每只腿部肌肉注射疫苗2.0ml(左右 各1.0ml)，同时设对照5只，在相同的条件下饲养，连续观察20日，记录试验鸭采食、饮水及 临床情况。应不出现由疫苗引起的任何局部和全身不良反应。
[0050] (5)效力检验
[0化1] ①免疫攻毒法取1日龄维番鸭40只，随机分成两组，每组20只，其中一组每只颈部 皮下注射疫苗，0.2ml/只，另一组20只同日龄维番鸭不免疫作对照，隔离饲养。于免疫后15 日免疫组和对照组均各随机分成两组，每组10只。其中免疫组和对照组各10只攻击维番鸭 细小病毒YBMDP，每只颈部皮下注射0.2ml/只（105'7ELD50/0.2ml);剩下的免疫组和对照组各 10只攻击维鸭源小碟攝病毒YBGPV-M株，每只颈部皮下注射0.2ml/只（106'5吃LDso/0.2ml)， 连续观察15日，免疫组鸭均应至少8只保护，对照组鸭均应至少9只发病。
[0052]②子代母源抗体与攻毒保护的关系90日龄种番鸭20只，每只颈部皮下注射疫苗， 2ml/只，另取10只同日龄种番鸭不免疫作对照。于免疫后15日相同途径相同剂量再免疫一 次，收集开产后4月时所产种蛋解化出维，于维番鸭7日龄时，免疫组子代取20只，随机分成 两组，每组10只，一组攻击维番鸭细小病毒YBMDP，每只颈部皮下注射0.2ml/只（105·化LDso/ 0.2m 1);另一组攻击维鸭源小碟攝病毒YBGPV-M株，每只颈部皮下注射0.2m 1 /只 (1〇6'5吃LDsg/O . 2ml);对照组子代取20只，随机分成两组，每组10只，一组攻击维番鸭细小病 毒YBMDP，每只颈部皮下注射0.2ml/只（105'7化化〇/0.2ml);另一组攻击维鸭源小碟攝病毒 YBGPV-M株，每只颈部皮下注射0.2ml/只（106'^ELDso/0.2ml);连续观察15日，免疫组子代鸭 均应至少8只保护，对照组子代鸭均应至少9只发病。
[0化3]实施例3
[0054] 一、制苗用抗原的制备
[0055] 1.制苗用病毒液的制备
[0化6] 1.1将生产用毒种YBMDP株用无菌生理盐水稀释100倍，尿囊腔接种11~12日龄易 感番鸭胚，每胚0.2ml，37 °C解育，每日2次照胚检查。选择接种后48~168小时内死亡的鸭 胚，置2~8°C4~12小时，无菌条件下打开气室，挑取胚体有广泛出血，毛囊出血，肝脏变性 和坏死，绒毛尿囊膜有轻度水肿的胚，取其胚体(去掉头和四肢)放入组织捣碎机中粉碎，收 取尿囊液、羊水，用胚液匀浆，取粉碎后的组织按1:1加入生理盐水混合，冻融3次，400化/ min离屯、30min，取上清混合于无菌容器中，置2~8°C保存。（参见表1)。
[0化7] 1.2将生产用毒种YBGPV-M株用无菌生理盐水稀释100倍，尿囊腔接种11~12日龄 易感番鸭胚，每胚〇.2ml，37°C解育，每日2次照胚检查。选择接种后48~168小时内死亡的鸭 胚，置2~8°C4~12小时，无菌条件下打开气室，挑取胚体有广泛出血，毛囊出血，肝脏变性 和坏死，绒毛尿囊膜有轻度水肿的胚，取其胚体(去掉头和四肢)放入组织捣碎机中粉碎，收 取尿囊液、羊水，用胚液匀浆，取粉碎后的组织按1:1加入生理盐水混合，冻融3次，400化/ min离屯、30min，取上清混合于无菌容器中，置2~8°C保存。（参见表1)。
[005引表1:毒液的制备表 [0化9]
[0060] ~2.灭活将病毒液倒入灭活瓶内，计量加入10%甲醒溶液，使其充分混合，甲醒溶 液的最终浓度为0.2%。加甲醒溶液后倒入另一灭活罐中，W避免罐口附近粘附的病毒未能 接触灭活剂。37°C灭活16小时后取出，置2~8°C保存。
[0061] 3.疫苗半成品检验
[0062] (1)无菌检验取灭活的胚液，按现行《中国兽药典》附录进行，无菌生长。
[0063] (2)病毒含量测定将两种病毒液分别用灭菌生理盐水作10倍系列稀释，取10-2、 1〇-3、1〇Λ?〇-5 4个稀释度，分别尿囊腔接种11~12日龄易感番鸭胚，每胚0.2ml，同时设接 种生理盐水对照5枚，每胚0.2ml。置37 °C继续解育，每日照胚2次，观察168小时。W鸡胚死亡 并出现尿囊膜水肿增厚，头、颈、背部等全身出血性病变判为感染，计算化〇5〇。结果，YBMDP株 为 1〇5JeLD5〇/0.2ml; YBGPV-M株为 1〇6'5eLD5〇/0.2ml。
[0064] (3)灭活检验将病毒液尿囊腔接种11~12日龄易感番鸭胚10枚，每胚0.2ml，置37 C继续解育，连续观察168小时，鸭胚均无死亡。
[0065] 二、灭活疫苗的制备:经过检验合格后的半成品抗原进行疫苗制备（W下配制中各 液体成分按体积比计，参见表2)。
[0066] (1)油相制备取兽用白油95份，硬脂酸侣1份，置于油相制备罐中加热至80°C后， 再加司本一80 5份，至溫度达到115°C时，维持30min，冷却后备用。
[0067] (2)水相制备将灭活检验合格的病毒液混合，检测每0.2ml水相中含YBMDP株病毒 含量不低于105'7ELD50。取灭菌后的吐溫-80 5份，加入配液罐中，同时加混合抗原液95份，开 动揽拌电机揽拌20~30min，使吐溫-80完全溶解。
[0068] (3)乳化取油相2份放于高速剪切机内，开动电机慢速转动揽拌，同时徐徐加入水 相1份，W1000化/min，乳化5分钟。乳化后，取10ml，W3000r/min离屯、15分钟，管底无水相析 出。
[0069] (4)分装定量分装，加盖密封。
[0070] 表2:疫苗乳化和分装 「00711
[0072] Ξ、疫苗成品检验
[0073] (1)性状
[0074] 外观乳白色乳剂。
[0075] 剂型油包水型，取一清洁吸管，吸取少量疫苗滴于冷水，呈油滴状不扩散。
[0076] 稳定性吸取疫苗10ml加入离屯、管中，W3000r/min离屯、15分钟，管底无水相析出。
[0077] 黏度按现行版《中国兽药典》附录进行，为58.6cp。
[0078] (2)装量检查按现行版《中国兽药典》附录进行，符合标准。
[0079] (3)无菌检验按现行版《中国兽药典》附录进行，无菌生长。
[0080] (4)安全检验用1日龄健康易感维番鸭10只，每只腿部肌肉注射疫苗2.0ml(左右 各1.0ml)，同时设对照5只，在相同的条件下饲养，连续观察20日，记录试验鸭采食、饮水及 临床情况。试验番鸭全部健活，且均未出现任何因疫苗引起的局部和全身反应。
[0081 ] (5)效力检验
[0082] ①取1日龄维番鸭40只，随机分成两组，每组20只，其中一组每只颈部皮下注射疫 苗，0.2ml/只，另一组20只同日龄维番鸭不免疫作对照，隔离饲养。于免疫后15日免疫组和 对照组均各随机分成两组，每组10只。其中免疫组和对照组各10只攻击维番鸭细小病毒 YBMDP株，每只颈部皮下注射0.2ml/只（105'化LDso/0.2ml);剩下的免疫组和对照组各10只攻 击维鸭源小碟攝病毒YBGPV-M株，每只颈部皮下注射0.2ml/只（106'5吃L化〇/0.2ml)，连续观 察15日，免疫组鸭用YBMDP株攻击的10只仅1只发病，保护率为90%，用YBGPV-M株攻击的10 只均未见发病，保护率为100% ;对照组鸭用YBMDP株攻击的10只有9只发病，保护率为10%， 用YBGPV-M株攻击的10只均发病，保护率为0(参见表3)。
[0083] 表3:二联苗疫苗效力检验结果
[0084]
[0085]
[0086] ②子代母源抗体与攻毒保护的关系90日龄种番鸭20只，每只颈部皮下注射疫苗， 2ml/只，另取10只同日龄番鸭不免疫作对照。于免疫后15日相同途径相同剂量再免疫一次， 收集开产后4月时所产种蛋解化出维，于维番鸭7日龄时，免疫组子代取10只，对照组子代取 10只，攻毒YBMDP株，每只肌肉注射0.2ml ( 105'7ELD50/0.2ml)，另取免疫组子代取10只，对照 组子代取10只，攻击维鸭源小碟攝病毒YBGPV-M株，每只颈部皮下注射0.2ml/只 (106'5吃LDso/0.2ml)，连续观察15日，免疫组子代鸭用YBMDP株攻击的10只仅1只发病，保护 率为90%，用YBGPV-M株攻击的10只也仅1只发病，保护率为90%，；对照组子代鸭用YBMDP株 攻击的10只有9只发病，保护率为10%，用YBGPV-M株攻击的10只均发病，保护率为0(见表 4)。而且用YBGPV-M株的攻毒实验表明，本发明的疫苗的免疫效果明显好于已有的疫苗，推 测是由于YBGPV-M株基因发生变异导致的。
[0087] 表4:子代母源抗体与攻毒保护结果 [008引
[0089]
ο
【主权项】
1. 一种二联灭活疫苗，其特征在于，所述的灭活疫苗包含有抗原和疫苗佐剂，其中所用 抗原为灭活的番鸭细小病毒和番鸭源小鹅瘟病毒。2. 如权利要求1所述的灭活疫苗，其特征在于，所述的番鸭细小病毒的保藏编号为 CGMCC No.8504〇3. 如权利要求1所述的灭活疫苗，其特征在于，所述的番鸭源小鹅瘟病毒的保藏编号为 CCTCC NO:V201620。4. 如权利要求1所述的灭活疫苗，其特征在于，所述的番鸭细小病毒和番鸭源小鹅瘟病 毒经过甲醛溶液灭活。5. 如权利要求1所述的灭活疫苗，其特征在于，所述的疫苗中番鸭细小病毒的含量应不 低于 l〇5'7ELD5〇。6. 如权利要求1所述的灭活疫苗，其特征在于，所述的疫苗中番鸭源小鹅瘟病毒的含量 不低于 l〇6'5()ELD50。7. 权利要求1所述的灭活疫苗的制备方法，其特征在于，所述的方法包括如下的步骤： 1) 油相制备：取兽用白油95份，硬脂酸铝1份，置于油相制备罐中加热至80°C后，再加5 份的司本-80，至温度达到115 °C时，维持30min，冷却后备用； 2) 水相制备:将灭活的YBMDPV株和YBGPV-M株病毒液按1:1的比例加入水中，使每0.2ml 水中YBMDPV株病毒含量不低于105'7ELD5(); YBGPV-M株病毒含量不低于106'5()ELD5()。取灭菌后 的5份吐温-80,加入配液罐中，同时加入病毒混液95份，搅拌20~30min，使吐温-80完全溶 解； 3) 乳化：取油相2份放于高速剪切机内，开动电机慢速转动搅拌，同时徐徐加入水相1 份，以10000r/min，乳化5分钟，乳化后，取IOml，以3000r/min离心15分钟完成制备。
【文档编号】A61P31/20GK105920596SQ201610442981
【公开日】2016年9月7日
【申请日】2016年6月18日
【发明人】邹敏, 吴发兴, 张志鸿, 朱艳梅, 孙健, 刘蕾
【申请人】青岛易邦生物工程有限公司