专利名称：一种检测番鸭小鹅瘟病免疫荧光试剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种检测番鸭小鹅瘟病免疫荧光试剂。
背景技术：
番鸭小鹅瘟病是由鹅细小病毒(Goose parvovirus, GPV)引起一月龄以内雏番鸭以腹泻、肠粘膜脱落形成栓塞为特征的一种病毒性传染病，该病1997年以来在福建省莆田、福清等地的番鸭饲养区暴发流行，目前全国各番鸭饲养区均有发生，发病率 50% -70%、病死率40% -65%，给养鸭业造成一定的经济损失。临床上该病不仅常与番鸭细小病毒病(三周病)混合感染，且常被基层兽医误诊为番鸭细小病毒病。由于抗小鹅瘟高免血清对该病具有较好的治疗效果，因此快速诊断是有效控制该病减少损失的前提。虽然已有报道以小鹅瘟单抗建立的间接免疫荧光方法，但我国至今还未见番鸭小鹅瘟病以单抗介导的直接免疫荧光诊断试剂，且至今国内尚缺乏商品化的番鸭小鹅瘟病快速诊断试剂， 给临床诊断带来很大困难。因此，快速确诊该病的试剂不仅具有较好的应用价值和产业化前景，而且对有效控制该病是必不可少的。
发明内容
本发明的目的就是提供一种检测番鸭小鹅瘟病的直接免疫荧光试剂，它是通过如下技术方案来实现的制备检测检测番鸭小鹅瘟病免疫荧光试剂是取一种来源于人工筛选的抗番鸭源鹅细小病毒(Goose parvovirus,GPV)杂交瘤细胞株Dll株(即抗GPV杂交瘤细胞株Dll株)，应用抗GPV杂交瘤细胞株Dll株制备抗番鸭源鹅细小病毒单克隆抗体(即 抗GPV单克隆抗体)，然后用抗GPV单克隆抗体标记异硫氰酸荧光素(FITC)制备检测番鸭小鹅瘟病免疫荧光(诊断)试剂；所述的抗GPV杂交瘤细胞株Dll株，保藏在CCTCC (即中国典型培养物保藏中心)，保藏日2011年4月15日，保藏编号C201120。本发明的目的还提供番鸭小鹅病免疫荧光试剂的应用。与现有同类技术比较，具有如下优点应用本发明的试剂建立的直接免疫荧光试验可用于临床快速诊断番鸭小鹅瘟病，也可用于鹅细小病毒(GPV)抗原在组织中的定位和 GPV鉴定；直接免疫荧光检测时间短(40分钟内出结果)，特异性强(仅与GPV反应)，重复性好，准确性高(与间接免疫荧光方法的符合率为90%以上)，可用于番鸭小鹅瘟病毒病的快速诊断。2011年委托福建省科技检索部门对本发明检索，其科技查新结论为“委托单位福建省农业科学院畜牧兽医研究所的直接免疫荧光检测雏番鸭小鹅瘟病国内未见相关文献报道。”因此，本发明的检测番鸭小鹅瘟病的免疫荧光试剂具有创新性和实用性。
图1为在DFA中呈荧光阳性的番鸭脾脏；图2为在DFA中呈荧光阴性的番鸭脾脏。
具体实施例方式以下结合具体实施例对本发明进一步说明(但不是对本发明的限制)。并通过定性或定量的实验数据证明本发明的技术方案可以实现所述的用途和/或达到预期效果。制备检测番鸭小鹅瘟病免疫荧光试剂是取一种来源于人工筛选的抗番鸭源鹅细小病毒(Goose parvovirus,GPV)杂交瘤细胞株Dll株(即抗GPV杂交瘤细胞株Dll株)， 应用抗GPV杂交瘤细胞株Dll株制备抗番鸭源鹅细小病毒单克隆抗体(即抗GPV单克隆抗体)，然后用抗GPV单克隆抗体标记异硫氰酸荧光素(FITC)制备检测番鸭小鹅瘟病免疫荧光(诊断)试剂；所述的抗GPV杂交瘤细胞株Dll株，保藏在CCTCC (即中国典型培养物保藏中心)，保藏日2011年4月15日，保藏编号C201120。本发明的检测番鸭小鹅瘟病免疫荧光(诊断)试剂，特征在于，其制备方法是将蛋白浓度为lOmg/mL抗GPV单克隆抗体以透析法对0. lmg/mL异硫氰酸荧光素粉(FITC)4°C标记Mh，经s印handx G-50层析柱纯化并适当浓缩，即为番鸭小鹅瘟病免疫荧光诊断试剂。其中1.抗番鸭源鹅细小病毒单克隆抗体(抗GPV单克隆抗体)的制备即从液氮中取出抗GPV杂交瘤细胞株Dll株，放入预先准备的37°C温水中，使其尽快融化后，IOOOr/ min离心2min，弃冻存液，以细胞营养液(HT-D7777-10% FCS)重悬细胞后，将细胞移至预先加好细胞营养液的培养瓶中，37°C C026 . 0温箱中培养，经扩大培养到足够数量时，收集细胞离心，调细胞浓度达5 X IO6个细胞/ml。腹腔接种12周龄BALB/c小鼠，5 X IO5个细胞 /0. Iml/只，约10天左右小鼠腹部明显臌起，以手触摸时皮肤有紧张感，即可用16 18号消毒针头采集腹水。将腹水lOOOOr/min离心15min，弃沉淀，收集上清即为抗GPV单克隆抗体，经Commassi brilliant blue (考马斯亮蓝R-250)法测定抗体蛋白浓度，分装，_20°C以下保存备用。2.免疫荧光试剂制备2. 1抗体稀释将抗GPV单克隆抗体以0. 025M pH9. 2碳酸盐缓冲液 (0. 025MpH9. 2CBS)稀释成含蛋白浓度为10mg/mL，装入透析袋中备用；2. 2荧光素溶液的准备称取异硫氰酸荧光素粉(FITC)，用0. 025M pH9. 2CBS配制成0. lmg/mL，磁力搅拌避光溶解；2. 3抗体标记将透析袋置于相当抗体10倍体积的荧光素溶液中，采用透析法4°C 避光磁力搅拌下标记Mh ；2. 4荧光标记抗体的纯化取出透析袋中的标记抗体，1000r/min离心3min，取上清液过s印handx G-50层析柱，用灭菌0. OlM Ph7. 2PBS洗脱，除去游离的荧光素和盐；分管收集第一峰，并将IFA阳性的各管混合，适当浓缩，测定其工作浓度后分装，保存于-20°C备用。即为番鸭小鹅瘟病免疫荧光诊断试剂。3.直接免疫荧光试验(DFA)方法的建立3. IGPV感染细胞的制备将番鸭小鹅瘟病毒(GPV)接种于已长成单层的96孔 MDEF细胞培养板，同时设正常MDEF细胞为阴性对照；于37°C 5 % C02条件下培养至细胞病变达30%左右时，弃培养上清液，以无菌PBS或生理盐水洗涤1次，每孔加入冷甲醇 1001^，4°〇固定301^11，弃去固定液同前洗涤1次，_40°C冻存备用。
3. 2组织冰冻切片的制备取人工感染番鸭小鹅瘟病毒(GPV)的发病番鸭肝脏、 脾脏和胰腺等组织或接种GPV死亡番鸭胚心，切成0. 5cm3左右的大小，放置于冰冻切片机的组织固着器上，待组织冷冻后切成6-8um薄片，粘附在载玻片上，冷丙酮固定10-15分钟，-20°C冻存备用。3. 3DFA操作方法取GPV感染细胞板或冰冻切片，加入适量经1 % BSA-PBS稀释的上述免疫荧光试剂工作液，置于湿盒内，37°C感作30min，用PBS或生理盐水洗涤3次后，每孔加30 μ L抗荧光衰减封片剂(50%甘油-PBQ或切片以50% PBS-甘油封片，置荧光倒置显微镜下观察，以出现亮绿色荧光病灶判定阳性结果，拍照保存。同时设未接种病毒的正常细胞孔或正常组织冰冻切片作为阴性对照。4.免疫荧光试剂的特性鉴定4. 1荧光试剂的工作浓度和敏感性取3. 1中制备的感染细胞板和阴性细胞对照，每孔分别加入预先经BSA-PBS系列稀释的免疫荧光试剂，进行DFA试验，以出现清晰明亮特异性荧光(++)的最大稀释度为试剂的DFA敏感性。结果显示荧光试剂的敏感性达1 400。为保证试剂的敏感性和荧光强度，确定工作浓度为1 150。4. 2荧光试剂的特异性将荧光抗体适当稀释后，分别取番鸭小鹅瘟病毒(GPV)、番鸭细小病毒(MPV)、番鸭呼肠孤病毒(MDRV)、禽呼肠孤病毒(ARV)、鸭副粘病毒(PMV)等感染细胞和鸭肝炎病毒 (DHV)感染胚心冰冻切片，同时设阴性对照，每孔加1 150稀释的荧光试剂30ul，进行DFA 试验。结果显示在倒置荧光显微镜下仅GPV感染细胞孔出现亮绿色荧光病灶，呈阳性反应，DFA的荧光特性与IFA相同；而其它病毒感染细胞及正常MDEF细胞均无交叉反应。表明制备的免疫荧光试剂特异性好，可用于GPV感染细胞的鉴定。4. 3荧光试剂的重复性和保存期在96孔细胞培养板中进行。将GPV荧光试剂分装后分别置_40°C保存1、2、3、4、 5、6、9、12个月后，对GPV感染细胞进行DFA试验，测定试剂保存期和批内批间重复性。结果显示在-40°C保存至12个月荧光效价不变(见表1)，因此暂定其保存期为12个月；同时，批内和批间重复性都较好，质量稳定。表1.荧光抗体_40°C保存不同时间的检测结果
权利要求
1.一种检测番鸭小鹅瘟病免疫荧光试剂，其特征在于，制备检测番鸭小鹅瘟病免疫荧光试剂是应用抗GPV杂交瘤细胞株Dll株制备抗GPV单克隆抗体，然后用抗GPV单克隆抗体标记异硫氰酸荧光素(FITC)制备检测番鸭小鹅瘟病免疫荧光试剂；所述的抗GPV杂交瘤细胞株Dll株，保藏在CCTCC，保藏日2011年4月15日，保藏编号C201120。
2.根据权利要求1所述的检测番鸭小鹅瘟病免疫荧光试剂，其特征在于，其制备方法是将蛋白浓度为lOmg/mL抗GPV单克隆抗体以透析法对0. lmg/mL异硫氰酸荧光素粉 (FITC) 4°C标记Mh，经s印handx G-50层析柱纯化并适当浓缩，即为检测番鸭小鹅瘟病免疫荧光试剂。
3.根据权利要求1所述的检测番鸭小鹅瘟病免疫荧光试剂的应用，其特征在于，将番鸭小鹅瘟病免疫荧光试剂建立的直接免疫荧光试验(DFA)，应用于鉴定GPV抗原在组织细胞中的定位和鉴定，或应用于番鸭小鹅瘟病的临床快速诊断。
全文摘要
本发明公开了一种检测番鸭小鹅瘟病免疫荧光试剂，其特征在于，制备检测番鸭小鹅瘟病免疫荧光试剂是用抗GPV杂交瘤细胞株D11株制备抗GPV单克隆抗体，然后用GPV单克隆抗体标记异硫氰酸荧光素(FITC)制备检测番鸭小鹅瘟病免疫荧光试剂；所述的抗GPV杂交瘤细胞株D11株，保藏在CCTCC，保藏日2011年4月15日，保藏编号C201120；本发明还公开了检测番鸭小鹅瘟病免疫荧光试剂应用于番鸭小鹅瘟病的临床快速诊断，以及应用于鹅细小病毒抗原在组织细胞中的定位和鉴定。
文档编号G01N33/577GK102426238SQ201110268998
公开日2012年4月25日 申请日期2011年9月7日 优先权日2011年9月7日
发明者朱小丽, 李兆龙, 林锋强, 王劭, 王燕玲, 程晓霞, 陈仕龙, 陈少莺 申请人:福建省农业科学院畜牧兽医研究所