专利名称：超强毒传染性法氏囊病毒高免蛋黄抗体制备方法
技术领域：
本发明属于病毒学和免疫学的领域，是利用分离到的超强毒制备传染性法氏囊高免蛋黄抗体，尤其涉及一种超强毒传染性法氏囊病毒(vvIBDV)高免蛋黄抗体制备方法。
背景技术：
传染性法氏囊病毒是由双链RNA病毒科的传染性法氏囊病病毒(IBDV)所引起的一种鸡的急性暴发性传染病。表现为法氏囊淋巴组织和淋巴细胞坏死，发病率及死亡率均高。而高免蛋黄液是防治IBDV的有效措施。(王志杰，鸡传染性法氏囊病高免卵黄抗体液的研制，西昌农业高等专科学校学报2004年，18卷，2期51-54)针对目前发病情况，大多是由于超超强毒株感染引起的，而变异株的抗原性和经典疫苗株间有差异，主要引起免疫抑制。因此，传统的疫苗不足以对超超强毒株造成的感染提供很好的保护(蒋静，孙建和等传染性法氏囊病毒上海超超强毒株VP2-4-3基因真核表达质粒的构建与表达，华中农业大学学报，2004年4月23卷第2期:179-182)，因此很多养殖场免疫过两次传染性法氏囊疫苗，后又发生传染性法氏囊病，这与我们从发病鸡场分离到的超超强毒株的情况相吻合，证明了超超强毒株能引起鸡群免疫抑制，大量死亡(张存，范坤晓等，鸡传染性法氏囊病超超强毒的感染与防制，畜牧与兽医1996，28 (3) =130-132 ;韦平，龙进学等，传染性法氏囊病病毒快速检测与分型技术的研究，中国兽医学报，2004，24 (4):313-316)，而高免蛋黄液是防治其的有效措施，虽然目前世界不同地区也有过研究传染性法氏囊病的高免蛋黄抗体的报道。(王志杰，鸡传染性法氏囊病高免卵黄抗体液的研制，西昌农业高等专科学校学报2004年，18卷，2期51-54 ;郑素琴，李翠云等。鸡法氏囊病和法氏囊-新城疫二联高免卵黄液制备与应用研究吉林畜牧兽医3-7 ;俞炳梅。法氏囊高免卵黄抗体在制作和使用中应注意的几个问题，山东家禽1998年，5期:16)。但由于传染性法氏囊病毒超强毒株的出现造成疫苗控制不力，发病急，死亡率高等情况，而技术相对落后的监测鉴定方法以及制备高免蛋黄液的方法对防治超 超强毒株传染性法氏囊病造成很大的困难，而且山西省处于高原多山地带，养鸡户分散，给采集病料造成一定的困难，因此分离鉴定工作繁琐复杂，工作量较大，难于分离。现有技术生产高免蛋黄抗体主要是用从发病养殖场中分离到的传染性法氏囊病毒经过灭活，接种产蛋鸡后取蛋黄来制作，在制作过程中并没有确定所分离到病原的致病力。这种种传统方法不能保证制作出来的高免蛋黄抗体的通用性，只能针对单个的养殖场。不能确定其他养殖场的鸡群在发病期的治疗效果。
发明内容
针对上述问题，本发明实施例的目的在于提供一种超强毒传染性法氏囊病毒高免蛋黄抗体制备方法及应用。本发明实施例是这样实现的，一种超强毒传染性法氏囊病毒高免蛋黄抗体制备方法，其特征在于，采集不同地区、不同鸡场疑似传染性法氏囊病鸡病料，进行病原的分离培养、设计一对引物扩增传染性法氏囊病毒vp2基因序列、由于vp2属于其特征性保守序列，能扩增出这段序列即能对其鉴定，利用扩增出来的产物经过电泳、观察，确保扩增出与设计的目的条带大小相符的条带，对含有扩增产物的琼脂糖凝胶回收，测序，同国际和国内已发表的已知序列比对，即可对其分型，分为超强毒毒株、强毒毒株、普通毒株等，最终确定本次分离到的传染性法氏囊病毒毒株属于超强毒株。进一步，该超强毒传染性法氏囊病毒高免蛋黄抗体制备方法具体包括病料采集处理及病毒纯化繁殖，vvIBDV-PCR鉴定，步骤如下:病料的采集处理:从不同地区疑似法氏囊病鸡中采集法氏囊病料；主要选择法氏囊外观水肿呈胶冻样、出血呈紫葡萄状。将法氏囊反复冻融三次，充分释放病毒粒子，增加病毒粒子含量，无菌研磨，再加等体积加入4000IU青霉素、2000IU链霉素/ml的双抗，放入-20°C保存，备用；用琼脂扩散试验检测病毒效价，被检病毒与标准法氏囊阳性血清出现明显的沉淀线，证明法氏囊病毒的存在；病毒纯化繁殖:法氏囊病毒乳液在鸡胚中繁殖:购买60枚PFS鸡蛋，分三批孵育，每批20枚。将第一批20枚鸡蛋放入温箱中，每日翻蛋2-3次，注意保持湿度。4日后放入第二批，再4日后放入第三批。当第一批鸡胚10日龄时，鸡胚绒毛膜接种法氏囊病毒，0.2ml/枚，接种完毕用熔化石蜡封闭两孔，逐日观察，24h内死亡胚弃去，48h死胚保留，120h死活胚从孵化器中取出，放入4°C冰箱静置，收获内死、活鸡胚绒毛膜和尿囊液；采用琼脂扩散试验方式测法氏囊病毒效价，绒毛膜和尿囊液与标准法氏囊阳性血清都出现明显的沉淀线，效价为21。将胚体和绒毛膜无菌取出加PBS缓冲液充分研磨，反复冻融3次后，进行第二次接毒，方法同上，绒毛膜和尿囊液与标准法氏囊阳性血清都出现明显的沉淀线，病毒效价为23 ;同样进行第三次接病毒，绒毛膜和尿囊液与标准法氏囊阳性血清都出现明显的沉淀线，病毒效价为26;进一步，该超强毒传染性法氏囊病毒高免蛋黄抗体制备方法包括wIBDV-PCR鉴定，步骤如下:引物的设计与合成:根据genbank登录IBDV vp2基因参考序列和表达载质粒PFastBacHTA表达阅读框设计vp2基因扩增引物:Pl:5/ -CGGAATTCATGACAAACCTGCAAGATCAAACC-3'；P2:5/ ~CCCTCGAGCACCGGCACAGCTATCCTCCTTAT~3/ ；两头分别引入EcoRI和XhoI酶切位点；病毒RNA的提取:用Trizol法提取RNA，取250ul病毒液于一普通的1.5mlEP管中，加入750ulTrizol，震 荡混匀，静置5min ;加入150ul氯仿，震荡混匀，4°C离心，12000r/min, 5min ;取上清加入450ul异丙醇,颠倒混勻,4°C离心，12000r/min, 12min ;弃液体,加Iml 75% DEPC乙醇洗漆，4°C离心，12000r/min, 5min ;弃液体,虹吸,干燥沉淀。加9ulDEPC水、，50°C水浴lOmin，开始反转录。反转录步骤为:10ulRNA、lul随机引物和4ul dNTP混勻，65°C水浴8min后迅速冰浴5min。再加入4ulBuffer、Iul反转录酶和lullul RNaseinhibitor，37°C水浴2_3h ;以反转录产物为模板，，Pl和P2为引物进行PCR反应。PCR反应体系:5XStar Buffer5ul, dNTP2ul，4ul 模板，Pl 和 P2 各 0.5ul, Primestar0.25ul,ddH2012.75ul ;PCR 反应条件:98 °C 预变性 IOs ;98°C 变性 10s，55 °C 退火 15s，72 °C 延伸100s共30个循环，72 °C终延伸IOmin ;凝胶电泳以鉴定分子量大小；将PCR产物按照AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒说明书进行回收；取4.5ul回收产物加入5ul Sollution I和
0.5ulVenter，混匀，4°C过夜。将连接产物转化入E.coli DH5 α感受态细菌，涂布在用LB配制的1.5%琼脂平皿上，含氨苄青霉素100mg/L，37°C培养14h ;挑单菌落接种入含氨苄青霉素100mg/L的LB()，振摇培养12h ;按Plasmid Mini kit I(IOO)说明书提取质粒。质粒用EcoR I和Xho I双酶切鉴定，阳性重组质粒命名为T-VP2 ；分离株VP2序列分析及推导氨基酸序列分析:测序结果表明，分离株VP2基因核苷酸长度为1389bp，推导氨基酸序列含有347个氨基酸，采用DNAstar软件对测序结果进行分析，对照IBDV经典强、弱毒株及超超强毒株高变区氨基酸序列分析分离株VP2分子特征；分离株符合强度株的特征:分离株VP2第328-334位氨基酸序列为S-W-S-A-S-G-S，这与IBDV经典超强毒株VP2七肽区序列相同，超超强毒分子特征为222 A、256 1,294 I和299 S本分离株符合256 1,294 I和299 S三个特征，证明本毒株为vvIBDV经典超强毒株。进一步，该超强毒传染性法氏囊病毒高免蛋黄抗体制备方法具体包括超强毒传染性法氏囊病毒(vvIBDV)灭活苗的制备，步骤为:取分离鉴定的vvIBDV绒毛膜和尿囊液加4%吐温为水相；白油加司盘再加硬脂酸招为油相，水相与油相按一定比例进行乳化即为vvIBDV灭活苗。进一步，该超强毒传染性法氏囊病毒高免蛋黄抗体制备方法具体包括超强毒传染性法氏囊病毒(vvIBDV)高免蛋黄抗体制备，步骤为:选择产蛋20%左右的健康鸡500只；用市场上卖的法氏囊弱毒苗基础免疫；基础免疫10天后，用我们制备的WlBDV灭活苗免疫，1ml% /只，颈部皮下注射；间隔15天后，用我们制备的vvIBDV灭活苗免疫，2ml% /只，颈部皮下注射；免疫30天后采血检测IBD抗体，用琼脂扩散试验检测IBD抗体，达到27时留蛋，即为vvIBDV高免蛋；vvIBDV高免蛋洗干净，然后放入万分之一的高锰酸钾水里泡5-10分钟，取出放入消毒好的容器里，将蛋清与蛋黄分离，蛋黄放入无菌容器里搅拌1分钟，倒入500ml的瓶子里，冰箱冻存；用于法氏囊病毒感染的病鸡；30日龄以下的鸡，1-1.5ml/只；30日龄以上的鸡1.5-2.0ml/只。胸部肌肉或皮下注射。进一步，采用高免技术，制备高免蛋黄抗体，接种于传染性法氏囊病的鸡群，使鸡群在短时间内产生传染性法氏病病毒抗体，在24小内中和体内的法氏囊病毒，达到治疗的目的。本发明提供的超强毒传染性法氏囊病毒高免蛋黄抗体制备方法，采用高免技术，制备高免蛋黄抗体，接种于传染性法氏囊病的鸡群，使鸡群在短时间内产生传染性法氏病病毒抗体，在24小内中和体内的法氏囊病毒，达到治疗的目的。
具体实施例方式为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
采集不同地区、不同鸡场疑拟传染性法氏囊病鸡病料，进行病原的分离培养、设计引物扩增vp2基因序列、以及鉴定、分型、回收、测序等基因工程的方法和技术，将扩增产物与国际上超强毒株固有特征进行比对，确定其属于超超强毒株。利用我们分离的超强毒传染性法氏囊病毒株，研制高免蛋黄抗体治疗剂，来治疗鸡群感染超强毒传染性法氏囊病。传染性法氏囊病在我国被发现以后一直不停的变异，专家学者研究其发展趋势是毒力变弱，但在最近几年突然出现超超强毒株，导致养禽业的失败和大批量鸡的死亡，虽然大多数养殖户都免疫过传染性法氏囊病疫苗两次，但这些疫苗产生的抗体不能抵抗超强毒株的感染，造成大量养鸡场鸡群的发病死亡，而本发明应用法氏囊超强毒株制作的高免蛋黄抗体能够治疗鸡群感染超强毒传染性法氏囊病。本发明实施例提供的超强毒传染性法氏囊病毒(vvIBDV)高免蛋黄抗体制备方法，具体包括如下步骤:1.1、病料采集处理及病毒纯化繁殖。1.1.1.病料的采集处理从全省不同地区疑似法氏囊病鸡中采集法氏囊病料。主要选择法氏囊外观水肿呈胶冻样、出血呈紫葡萄状。将法氏囊反复冻融三次，充分释放病毒粒子，增加病毒粒子含量，无菌研磨，再加等体积加入4000IU青霉素、2000IU链霉素/ml的双抗，放入_20°C保存，备用。用琼脂扩散试验检测病毒效价，被检病毒与标准法氏囊阳性血清出现明显的沉淀线，基本证明法氏囊病毒的存在。1.1.2、病毒纯化繁殖法氏囊病毒乳液在鸡胚中繁殖。购买60枚PFS鸡蛋，分三批孵育，每批20枚。将第一批20枚鸡蛋放入温箱中，每日翻蛋2-3次，注意保持湿度。4日后放入第二批，再4日后放入第三批。当第一批鸡胚10日龄时，鸡胚绒毛膜接种法氏囊病毒，0.2ml/枚，接种完毕用熔化石蜡封闭两孔，逐日观察，24h内死亡胚弃去，48h死胚保留，120h死活胚从孵化器中取出，放入4°C冰箱静置，收获内死、活鸡胚绒毛膜和尿囊液；采用琼脂扩散试验方式测法氏囊病毒效价，绒毛膜和尿囊液与标准法氏囊阳性血清都出现明显的沉淀线，效价为21。将胚体和绒毛膜无菌取出加PBS缓冲液充分研磨，反复冻融3次后，进行第二次接毒，方法同上，绒毛膜和尿囊液与标准法氏囊阳性血清都出现明显的沉淀线，病毒效价为23。同样进行第三次接病毒，绒毛膜和尿囊液与标准法氏囊阳性血清都出现明显的沉淀线，病毒效价为26。1.2vvIBDV-PCR 鉴定:1.2.1引物的设计与合成根据genbank登录IBDV vp2基因参考序列和表达载质粒pFastBacHTA表达阅读框设计vp2基因扩增引物:Pl:5/ ~CGGAATTCATGACAAACCTGCAAGATCAAACC~3/ ；P2:5/ -CCCTCGAGCACCGGCACAGCTATCCTCCTTAT-3';两头分别弓I入 EcoRI 和 XhoI酶切位点。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
1.2.2病毒RNA的提取用Trizol法提取RNA，具体步骤为:取250ul病毒液于一普通的1.5mlEP管中，加入750ulTrizol,震荡混匀，静置5min。加入150ul氯仿，震荡混匀，4°C离心，12000r/min,5min。取上清加入450ul异丙醇,颠倒混勻,4°C离心，12000r/min, 12min。弃液体，力口lml75% DEPC乙醇洗漆,4°C离心，12000r/min, 5min。弃液体,虹吸,干燥沉淀。加9ulDEPC水、，50°C水浴I Omin，开始反转录。反转录步骤为:10ulRNA、lul随机引物和4uldNTP混勻，65 °C水浴8min后迅速冰浴5min。再加入4ulBuffer、Iul反转录酶和IullulRNaseinhibitor，37°C水浴2-3h。以反转录产物为模板，，Pl和P2为引物进行PCR反应。PCR反应体系:5XStar Buffer 5ul, dNTP 2ul，4ul 模板，Pl 和 P2 各 0.5ul, Primestar 0.25ul,ddH20 12.75ul。PCR 反应条件:98 °C 预变性 IOs ;98°C 变性 10s，55 °C 退火 15s，72。。延伸100s共30个循环，72°C终延伸lOmin。凝胶电泳以鉴定分子量大小。将PCR产物按照AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒说明书进行回收。取4.5ul回收产物加入5ul Sollution I和0.5ulVenter，混匀，4°C过夜。将连接产物转化入E.coliDH5 α感受态细菌，涂布在用LB配制的1.5%琼脂平皿上(含氨苄青霉素100mg/L)，37°C培养14h。挑单菌落接种入LB (含氨节青霉素100mg/L),振摇培养12h。按Plasmid Mini kit I (100)说明书提取质粒。质粒用EcoR I和Xho I双酶切鉴定，阳性重组质粒命名为T-VP2。测序结果见序列表。1.2.3分离株VP2序列分析及推导氨基酸序列分析测序结果表明，分离株VP2基因核苷酸长度为1389bp，推导氨基酸序列含有347个氨基酸，采用DNAstar软件对测序结果进行分析，对照IBDV经典强、弱毒株及超超强毒株闻变区氨基酸序列分析分尚株VP2分子特征。分尚株符合强度株的特征:分尚株VP2第328-334位氨基酸序列为S-W-S-A-S-G-S，这与IBDV经典超强毒株VP2七肽区序列相同，超超强毒分子特征为222 A、256 1,294 I和299 S本分离株符合222 A、256 1,294 I和299S四个特征。证明本 毒株为vvIBDV经典超强毒株。1.2、超强毒传染性法氏囊病毒(vvIBDV)灭活苗的制备:取分离鉴定的wIBDV绒毛膜和尿囊液加4%吐温为水相；优质白油加司盘再加硬脂酸铝为油相，水相与油相按一定比例进行乳化即为wIBDV灭活苗。注射。
1.3、超强毒传染性法氏囊病毒(vvIBDV)高免蛋黄抗体制备:
1.3.1选择产蛋20%左右的健康鸡500只。
1.3.2用市场上卖的法氏囊弱毒苗基础免疫。
1.3.3基础免疫10天后，用我们制备的vvIBDV灭活苗免疫，Iml % /只，颈部皮下
1.3.4间隔15天后，用我们制备的vvIBDV灭活苗免疫，2ml%/只，颈部皮下注射。1.3.5免疫30天后采血检测IBD抗体，用琼脂扩散试验检测IBD抗体，达到27时留蛋，即为vvIBDV高免蛋。1.3.6vvIBDV高免蛋洗干净，然后放入万分之一的高锰酸钾水里泡5_10分钟，取出放入消毒好的容器里，将蛋清与蛋黄分离，蛋黄放入无菌容器里搅拌I分钟，倒入500ml的瓶子里，冰箱冻存。1.3.6用于法氏囊病毒感染的病鸡。30日龄以下的鸡，1_1.5ml/只；30日龄以上的鸡1.5-2.0ml/只。胸部肌肉或皮下注射。2、如权利要求1所述的超强毒传染性法氏囊病毒高免蛋黄抗体制备方法，其特征在于，采用高免技术，制备高免蛋黄抗体，接种于传染性法氏囊使鸡群在短时间内产生传染性法氏病病毒抗体，在2 4小内中和体内的法氏囊病毒，达到治疗的目的。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均`应包含在本发明的保护范围之内。
权利要求
1.超强毒传染性法氏囊病毒vvIBDV高免蛋黄抗体制备方法，其特征在于，采集不同地区、不同鸡场疑似传染性法氏囊病鸡病料，进行病原的分离培养、设计一对引物扩增传染性法氏囊病毒vp2基因序列、由于vp2属于其特征性保守序列，能扩增出这段序列即能对其鉴定，利用扩增出来的产物经过电泳、观察，确保扩增出与设计的目的条带大小相符的条带，对含有扩增产物的琼脂糖凝胶回收，测序，同国际和国内已发表的已知序列比对，即可对其分型，分为超强毒毒株、强毒毒株、普通毒株等，最终确定本次分离到的传染性法氏囊病毒毒株属于超超强毒株。
2.如权利要求1所述的超强毒传染性法氏囊病毒高免蛋黄抗体制备方法，其特征在于，该超强毒传染性法氏囊病毒高免蛋黄抗体制备方法具体包括病料采集处理及病毒纯化繁殖，vvIBDV-PCR鉴定，步骤如下: 病料的采集处理:从不同地区疑似法氏囊病鸡中采集法氏囊病料；主要选择法氏囊外观水肿呈胶冻样、出血呈紫葡萄状；将法氏囊反复冻融三次，充分释放病毒粒子，增加病毒粒子含量，无菌研磨，再加等体积加入4000IU青霉素、2000IU链霉素/ml的双抗，放入_20°C保存，备用；用琼脂扩散试验检测病毒效价，被检病毒与标准法氏囊阳性血清出现明显的沉淀线，证明法氏囊病毒的存在； 病毒纯化繁殖:法氏囊病毒乳液在鸡胚中繁殖:购买60枚PFS鸡蛋，分三批孵育，每批20枚；将第一批20枚鸡蛋放入温箱中，每日翻蛋2-3次，注意保持湿度；4日后放入第二批，再4日后放入第三批；当第一批鸡胚10日龄时，鸡胚绒毛膜接种法氏囊病毒，0.2ml/枚，接种完毕用熔化石蜡封闭两孔，逐日观察，24h内死亡胚弃去，48h死胚保留，120h死活胚从孵化器中取出，放入4°C冰箱静置，收获内死、活鸡胚绒毛膜和尿囊液；采用琼脂扩散试验方式测法氏囊病毒效 价，绒毛膜和尿囊液与标准法氏囊阳性血清都出现明显的沉淀线，效价为21 ;将胚体和绒毛膜无菌取出加PBS缓冲液充分研磨，反复冻融3次后，进行第二次接毒，方法同上，绒毛膜和尿囊液与标准法氏囊阳性血清都出现明显的沉淀线，病毒效价为23 ;同样进行第三次接病毒，绒毛膜和尿囊液与标准法氏囊阳性血清都出现明显的沉淀线，病毒效价为26。
3.如权利要求1所述的超强毒传染性法氏囊病毒高免蛋黄抗体制备方法，其特征在于，该超强毒传染性法氏囊病毒高免蛋黄抗体制备方法包括vvIBDV-PCR鉴定，步骤如下: 引物的设计与合成:根据genbank登录IBDV vp2基因参考序列和表达载质粒PFastBacHTA表达阅读框设计vp2基因扩增引物:Pl:5/ ~CGGAATTCATGACAAACCTGCAAGATCAAACC~3/ ；P2:5/ ~CCCTCGAGCACCGGCACAGCTATCCTCCTTAT~3/ ； 两头分别引入EcoRI和XhoI酶切位点； 病毒RNA的提取:用Trizol法提取RNA，取250ul病毒液于一普通的1.5ml EP管中，加入750ul Trizol，震荡混匀，静置5min ;加入150ul氯仿，震荡混匀，4°C离心，12000r/min, 5min ;取上清加入450ul异丙醇，颠倒混勻,4°C离心，12000r/min, 12min ;弃液体，力口lml75 % DEPC乙醇洗漆,4°C离心，12000r/min, 5min ;弃液体，虹吸，干燥沉淀；加9ulDEPC水、，50°C水浴lOmin，开始反转录；反转录步骤为:10ulRNA、lul随机引物和4uldNTP混勻，65°C水浴8min后迅速冰浴5min ;再加入4ul Buffer、Iul反转录酶和Iul IulRNaseinhibitor，37°C水浴2-3h ;以反转录产物为模板，，Pl和P2为引物进行PCR反应；PCR反应体系:5XStar Buffer5ul, dNTP2ul，4ul 模板，Pl 和 P2 各 0.5ul, Primestar0.25ul,ddH2012.75ul ;PCR 反应条件:98 °C 预变性 IOs ;98°C 变性 10s，55 °C 退火 15s，72 °C 延伸100s共30个循环，72 °C终延伸IOmin ;凝胶电泳以鉴定分子量大小；将PCR产物按照AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒说明书进行回收；取4.5ul回收产物加入5ul Sollution I和`0.5ulVenter，混匀，4°C过夜；将连接产物转化入E.coliDH5 α感受态细菌，涂布在用LB配制的1.5%琼脂平皿上，含氨苄青霉素100mg/L，37°C培养14h ;挑单菌落接种入含氨苄青霉素100mg/L的LBO，振摇培养12h ;提取质粒；质粒用EcoR I和Xho I双酶切鉴定，阳性重组质粒命名为T-VP2 ； 分离株VP2序列分析及推导氨基酸序列分析:测序结果表明，分离株VP2基因核苷酸长度为1389bp，推导氨基酸序列含有347个氨基酸，采用DNAs tar软件对测序结果进行分析，对照IBDV经典强、弱毒株及超超强毒株高变区氨基酸序列分析分离株VP2分子特征；分离株符合强度株的特征:分离株VP2第328-334位氨基酸序列为S-W-S-A-S-G-S，这与IBDV经典超强毒株VP2七肽区序列相同，超超强毒分子特征为222A、2561、294I和299S本分离株符合2561、2941和299S三个特征，证明本毒株为vvIBDV经典超强毒株。
4.如权利要求1所述的超强毒传染性法氏囊病毒高免蛋黄抗体制备方法，其特征在于，该超强毒传染性法氏囊病毒高免蛋黄抗体制备方法具体包括超强毒传染性法氏囊病毒(vvIBDV)灭活苗的制备，步骤为: 取分离鉴定的vvIBDV绒毛膜和尿囊液加4%吐温为水相；白油加司盘再加硬脂酸铝为油相，水相与油相按一定比例进行乳化即为vvIBDV灭活苗。
5.如权利要求1所述的超强毒传染性法氏囊病毒高免蛋黄抗体制备方法，其特征在于，该超强毒传染性法氏囊病毒高免蛋黄抗体制备方法具体包括超强毒传染性法氏囊病毒(vvIBDV)高免蛋黄抗体制备，步骤为:` 选择产蛋20%左右的健康鸡500只； 用市场上卖的法氏囊弱毒苗基础免疫； 基础免疫10天后，用我们制备的vvIBDV灭活苗免疫，Iml% /只，颈部皮下注射； 间隔15天后，用我们制备的vvIBDV灭活苗免疫，2ml% /只，颈部皮下注射； 免疫30天后采血检测IBD抗体，用琼脂扩散试验检测IBD抗体，达到27时留蛋，即为vvIBDV高免蛋； VVIBDV高免蛋洗干净，然后放入万分之一的高锰酸钾水里泡5-10分钟，取出放入消毒好的容器里，将蛋清与蛋黄分离，蛋黄放入无菌容器里搅拌I分钟，倒入500ml的瓶子里，冰箱冻存； 用法以:用于法氏囊病毒感染的病鸡；30日龄以下的鸡，1-1.5ml/只；30日龄以上的鸡1.5-2.0ml/只；胸部肌肉或皮下注射。
6.如权利要求1所述的超强毒传染`性法氏囊病毒高免蛋黄抗体制备方法，其特征在于，采用高免技术，制备高免蛋黄抗体，接种于传染性法氏囊病的鸡群，使鸡群在短时间内产生传染性法氏病病毒抗体，在24小内中和体内的法氏囊病毒，达到治疗的目的。
全文摘要
本发明公开了一种超强毒传染性法氏囊病毒(vvIBDV)高免蛋黄抗体制备方法，通过走访不同地区养殖场，对发病鸡群采样、病原的分离培养、设计引物扩增vp2基因序列、利用鉴定、分型、回收、测序方法和技术将扩增产物与国际上超强毒株固有特征进行比对，确定其属于超超强毒株。利用我们分离的超强毒传染性法氏囊病毒株，研制高免蛋黄抗体治疗剂，来治疗鸡群感染超强毒传染性法氏囊病。本发明提供的超强毒传染性法氏囊病毒高免蛋黄抗体制备方法，采用高免技术制备高免蛋黄抗体，接种于传染性法氏囊病的鸡群，使鸡群在短时间内产生传染性法氏病病毒抗体，在24小内中和体内的法氏囊病毒，达到治疗的目的。
文档编号C07K16/02GK103172733SQ20131004200
公开日2013年6月26日 申请日期2013年1月27日 优先权日2013年1月27日
发明者詹丽娥, 刘华栋, 陆冰洋, 王采先, 唐娟, 詹海杰 申请人:山西省农科院畜牧兽医研究所