一种mdck细胞无血清培养基及其用途和制备
【技术领域】
[0001] 本发明设及生物、医学领域，具体地是设及一种MDCK细胞的无血清培养基及其用 途和制备。
【背景技术】
[0002] MDCK细胞系（MDCK Cell Lines)中文名称为"犬肾细胞"是由Madin和Darby于1958 年从美国Cocker Spaniel母曲架犬的肾脏组织分离培育建立，通常是W贴壁方式生长的上 皮样细胞。目前，MDCK细胞系(MDCK Cell Lines)广泛用于多种病毒的扩增和纯化，如:正粘 病毒科、副粘病毒科、披膜病毒科、瘤疹病毒科、弹状病毒科、逆转录病毒科、呼肠孤病毒科、 黄病毒科、腺病毒科、小RNA病毒科、沙粒病毒科和痘病毒科的多种病毒。由于其病毒感染效 率高、增殖快，且不易变异，MDCK细胞系(MDCK Cell Lines)被公认为最适于甲、乙型流感病 毒疫苗生产的巧巾细胞系之一。传统的MDCK细胞培养大多采用有血清贴壁培养方式。血清是 由血浆去除纤维蛋白而形成的一种复杂混合物，其含有细胞生长所需的生长因子、激素、载 体蛋白、贴壁因子、微量元素 W及其他营养物质，可W有效地促进细胞生长和产物表达。然 而，血清的应用也存在许多问题：易受病毒、支原体或其他病原体的污染;批间差异造成产 品批次间的质量难W严格控制；大量血清蛋白的存在增加了下游分离纯化的难度，部分蛋 白难W通过分离纯化手段彻底去除，影响了产品的最终质量;此外，血清来源困难、价格昂 贵，大规模动物细胞培养过程中使用血清将会大大增加生产成本。目前还有MDCK细胞使用 某些培养基在传代多次后会出现致瘤性，运样会导致疫苗生产的安全性降低。
[0003] MDCK细胞系广泛用于流感病毒的分离，目前的流感病毒分离包括W下步骤：
[0004] i)在培养基中增殖MDCK细胞；
[0005] ii)用流感病毒样本感染MDCK细胞；
[0006] i i i)继续培养，分离在MDCK细胞中复制的病毒。
[0007] 能否快速获得纯度高、滴度高的流感病毒是找出致病因、控制流感疫情中非常重 要的一个环节，因此尽早分离出流感病毒意义重大。在第i)步中，现有的添加血清培养基培 养MDCK细胞分离流感病毒的周期较长，难W满足流感疫情中快速确定病原物的需要。
[000引本发明就是在此基础上研究获得的能够克服上述缺陷的培养基。
【发明内容】
[0009] 本发明将提供一种能提高MDCK细胞增殖速度和快速收获流感病毒的培养基。
[0010] 本发明提供一种MDCK细胞培养基，其特征在于包括如下成分:甘氨酸、心精氨酸盐 酸盐、1^-天冬酷胺、1^-天冬氨酸、心脫氨酸盐酸盐、1^-谷氨酷胺、k谷氨酸、心组氨酸盐酸盐、 k异亮氨酸、k亮氨酸赖氨酸盐酸盐甲硫氨酸、k苯丙氨酸、k脯氨酸丝氨酸 苏氨酸、心色氨酸、酪氨酸鄉氨酸、生物素、氯化胆碱、D-泛酸巧、叶酸、烟酷胺、对氨基 苯甲酸、盐酸化唉醇、盐酸化唉醒、核黄素、硫胺素盐酸盐、维生素 B12、肌醇、硝酸巧(4水）、 硫酸儀(7水）、氯化钟、碳酸氨钢、氯化钢、憐酸氨二钢、葡萄糖、还原型谷脫甘肤(还原型）、 肥阳S、酪红钢盐。
[0011] 进一步，其还包括如下成分:硫酸铜（5水）、硝酸铁(9水）、硫酸亚铁(7水）、氯化儀 (无水）、硫酸锋(7水）、憐酸二氨钢(1水）、丙酬酸钢、腐胺盐酸盐、白蛋白。
[0012] 进一步，各成分含量如下(所述含量单位为mg/L):甘氨酸0.1-300、k精氨酸盐酸 盐0.1-500、心天冬酷胺0.05-200、心天冬氨酸0.05-200、k脫氨酸盐酸盐0.1-200、k谷氨 酷胺0.1 -500、k谷氨酸0.01 -200、k组氨酸盐酸盐0.1 -300、心异亮氨酸0.5-150、k亮氨酸 0.5-150、!^-赖氨酸盐酸盐1-350、心甲硫氨酸0.1-150、心苯丙氨酸0.5-300、k脯氨酸0.01-100、k丝氨酸0.01-150a-苏氨酸0. l-200、k色氨酸0.01-50、k酪氨酸0.05-150、k鄉氨 酸0.05-150、生物素 0.001-0.01、氯化胆碱0.01-50、D-泛酸巧 0.005-20、叶酸0.005-30、烟 酷胺0.005-30、对氨基苯甲酸0.001-50、盐酸化唉醇0.005-50、盐酸化唉醒0.005-50、核黄 素0.001-10、硫胺素盐酸盐0.01-100、维生素 B12 0.01-75、肌醇0.1-150、硝酸巧(4水)0.1-200、硫酸儀(7水)0.1-150、氯化钟0.5-500、碳酸氨钢1-6000、氯化钢10-10000、憐酸氨二钢 1-500、葡萄糖1-5000、谷脫甘肤(还原型)0.001-300、肥阳S100-8000、酪红钢盐0.1-200。
[0013] 进一步，各成分含量为(所述含量单位为mg/L):硫5水酸铜(5水)0.001-0.01、硝9 水酸铁(9水)0.01-0.Ol、7水硫酸亚铁(7水)0.05-100、氯化儀(无水)0.1- 100、7水硫酸锋 (7水)0.01-100、1水憐酸二氨钢（1水)0.1-200、丙酬酸钢0.1-300、腐胺盐酸盐0.001-0.01。 进一步，成分含量如下，所述含量单位为mg/U甘氨酸0.1-300、k精氨酸盐酸盐0.1-500 天冬酷胺0.05-200、1^-天冬氨酸0.05-200、心脫氨酸盐酸盐0.1-200、1^-谷氨酷胺0.1-500、 k谷氨酸0.01 -200、k组氨酸盐酸盐0.1 -300、心异亮氨酸0.5-150、k亮氨酸0.5-150、1^-赖 氨酸盐酸盐1-350、心甲硫氨酸0.1-150、心苯丙氨酸0.5-300、k脯氨酸0.01-100、k丝氨酸 0.01-150苏氨酸0. l-200、k色氨酸0.01-50、k酪氨酸0.05-150、k鄉氨酸0.05-150、生 物素 0.001-0.01、氯化胆碱 〇.〇l-5〇、D-泛酸巧0.005-20、叶酸 0.005-30、烟酷胺0.005-30、 对氨基苯甲酸0.001-50、盐酸化唉醇0.005-50、盐酸化唉醒0.005-50、核黄素0.001-10、硫 胺素盐酸盐0.01-100、15维生素 B12 0.01-75、肌醇0.1-150、硝酸巧(4水)0.1-200、硫酸儀 (7水)0.1-150、氯化钟0.5-500、碳酸氨钢1-6000、氯化钢10-10000、憐酸氨二钢1-500、葡萄 糖1-5000、谷脫甘肤(还原型)0.001-300、肥阳S 100-8000、酪红钢盐0.1-200、硫酸铜巧水） 0.001-0.01、硝酸铁(9水)0.01-0.1、硫酸亚铁(7水)0.05-100、氯化儀(无水)0.1-100、硫酸 锋(7水)0.01-100、憐酸二氨钢(1水)0.1-200、丙酬酸钢0.1-300、腐胺盐酸盐0.001-0.01。
[0014] 进一步，其PH值为7.0-7.6。本发明还提供一种培养MDCK细胞的方法，其特征在于 使用上述培养基培养。
[0015] 本发明还提供一种MDCK培养基的检测方法，其特征在于从如下几个方面检测细胞 培养基:渗透压、内毒素指标、无菌性、支原体检测。
[0016] 本发明还提供一种MDCK培养基的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
[0017] 1)将权利要求1-5之一所述的培养基，用注射用水溶解，
[001引 2)调节PH值，
[0019] 3)用工业滤忍过滤，
[0020] 4)在氮气保护下分装。
[0021] 本发明的培养基还有稳定性好、可质控的特点。
[0022] 不经过血清驯化的MDCK细胞，前5代左右的细胞状态(细胞生长相对缓慢，镜下观 察的细胞有小的空泡)会稍差，之后状态恢复正常，连续传代后，细胞倍增时间、细胞饱满比 用DMEM+10%胎牛血清培养的更好。因培养基成分限定，分离流感病毒快，能极大的方便用 户。
[0023] 本发明制备工艺全部采用在线清洗及在线灭菌设备，保证批间差的稳定，同时生 产中采用惰性气体氮气保护，避免不稳定性成分被氧化，该工艺生产的MDCK细胞无血清培 养基质量稳定，解决了大多数厂家生产质量不易控制的问题。
[0024]
[0025] ^^1为用1号培养基培养的100(细胞第50代细胞200倍下显微照片
[0026] 附图2为用2号培养基培养的MDCK细胞第50代细胞200倍下显微照片
[0027] 附图3为用3号培养基培养的MDCK细胞第50代细胞200倍下显微照片 [002引
【具体实施方式】
[0029] 实施例1
[0030] 按如下配比称取试剂，溶剂为蒸馈水，其最终的浓度单位为mg/L，并调节PH值为 7.2,通过工业滤忍过滤，同时氮气保护进行分装:甘氨酸30、k精氨酸盐酸盐84、k脫氨酸 盐酸盐63、心谷氨酷胺584、k组氨酸盐酸盐42、心异亮氨酸105 a-亮氨酸105、心赖氨酸盐 酸盐146、k蛋氨酸30、1^-苯丙氨酸66、k丝氨酸42、k苏氨酸95、k色氨酸16、k酪氨酸二钢 盐104 a-鄉氨酸94、维生素类、氯化胆碱4、D-泛酸巧4、叶酸4、烟酷胺4、盐酸化唉醇4、核黄 素0.4、硫胺素盐酸盐4、肌醇7.2、氯化巧(无水)200、硝酸铁(9水)0.1、硫酸儀(无水)97.67、 氯化钟400、碳酸氨钢3700、氯化钢6400、憐酸二氨钢（1水）125、葡萄糖4500、酪红钢盐15、丙 酬酸钢110。
[0031] 实施例2
[0032] 按如下配比称取试剂，溶剂为蒸馈水，其最终的浓度单位为mg/L，并调节PH值为 7.2，通过工业滤忍过滤，同时氮气保护进行分装：
[0033] k精氨酸盐酸盐126、k脫氨酸盐酸盐31、k组氨酸盐酸盐42、心异亮氨酸52、心亮 氨酸52、k赖氨酸盐酸盐73、k蛋氨酸isa-苯丙氨酸32、k苏氨酸48 a-色氨酸ioa-酪氨 酸二钢盐52、k鄉氨酸46、心谷氨酷胺292、氯化胆碱UD-泛酸巧1、叶酸1、烟酷胺1、盐酸化 唉醇1、核黄素0.1、硫胺素盐酸盐1、肌醇2、氯化巧(无水)200、硫酸儀(无水)97.67、氯化钟 400、碳酸氨钢2200、氯化钢6800、憐酸二氨钢（1水)140、葡萄糖1000、