一种绵羊肺炎支原体低血清高效培养基及其制备方法与流程

技术领域

本发明涉及兽用制剂技术领域，具体涉及一种绵羊肺炎支原体低血清高效培养基及其制备方法。

背景技术：

绵羊肺炎支原体（Mycoplasma ovipneumoniae，Mo）能够引起绵羊和山羊的间质性肺炎，临床特征主要表现为咳嗽、气喘、流鼻涕、消瘦、贫血、生长发育迟缓等。1963年Mackay等首次从苏格兰绵羊病肺中分离出绵羊肺炎支原体。绵羊肺炎支原体主要感染绵羊和山羊，目前在全世界许多国家都有绵羊肺炎支原体引起的绵羊和山羊的发病报道，给世界养羊业造成的巨大经济损失。1978年我国学者首次在四川省从新西兰引进边区莱斯特种羊的后代羔羊中分离出绵羊肺炎支原体。随后我国多个省市相继有山羊和绵羊感染绵羊肺炎支原体发病的报道，该病在我国广泛流行，成为危害我国养羊业的一种重要病原。

疫苗免疫是预防控制绵羊肺炎支原体感染发生的一个重要手段。目前防控绵羊肺炎支原体感染主要依赖灭活疫苗。培养基是疫苗生产工艺的关键。目前绵羊肺炎支原体的培养基主要有改良KM2培养基、改良Thiaucourt's培养基、TSB-1培养基等。现有技术培养基培养绵羊肺炎支原体存在培养时间长、活菌滴度低、繁殖能力差等问题。此外，现有技术培养基中血清含量普遍为20%，高含量血清制备的疫苗无疑增加了异源血清对羊体的过敏应激反应，最终影响疫苗的免疫效果，同时也增加了制苗成本。如果单纯降低现有技术培养基中血清含量，会导致培养绵羊支原体抗原滴度低10～100倍左右，既达不到免疫所需抗原剂量，又需提高浓缩倍数，实际增加了生产成本。因此，开发绵羊肺炎支原体低血清高效培养基成为绵羊肺炎支原体疫苗研究和生产中急需解决的重要问题。

技术实现要素：

本发明的目的就是针对上述现有技术中的缺陷，提供了一种绵羊肺炎支原体低血清高效培养基及其制备方法。

为了实现上述目的，本发明提供的技术方案为：一种绵羊肺炎支原体低血清高效培养基，每1000ml低血清高效培养基由基础培养基和辅助培养基组成；

所述基础培养基中含有以下组分：

（1）MEM 6.0～7.0 g，

（2）丙酮酸钠 5.0～6.0 g，

（3）葡萄糖 5.0～6.0 g，

（4）质量浓度为1%的酚红 2.0～2.5 ml，

（5）Hank’s液 500 ml，

（6）去离子水300 ml；

所述辅助培养基中含有以下组分：

（7）质量浓度为25%的新鲜酵母浸出液 30～50 ml，

（8）质量浓度为3%的L-谷氨酰胺16～17 ml，

（9）质量浓度为10%的L-半胱氨酸4.0～6.0 ml，

（10）质量浓度为15%的水解乳蛋白 32.0～35.0 ml，

（11）10 mg/ml的转铁蛋白 0.8～1.5ml，

（12）10 mg/ml的胰岛素 0.8～1.5 ml，

（13）2mg/ml的小牛胸腺DNA 8.0～10.0 ml，

（14）20万IU/ml的青霉素 0.25 ml，

（15）无菌马血清50 ml。

本发明的第二个目的是提供了上述一种绵羊肺炎支原体低血清高效培养基的制备方法，包括以下步骤：

1）基础培养基的制备：

取上述的基础培养基组分中的（1）-（5）逐一加入300ml去离子水（6）中，充分混合，115℃高压灭菌20min后冷却至室温备用；

2）辅助培养基的制备：

取经0.22 微米滤膜滤过除菌的上述的（7）-（15）成分，充分混合，即得辅助培养基；

3）混合定容：

无菌条件下，将步骤1）得到的基础培养基和步骤2）得到的辅助培养基混合，用灭菌水补齐定容至1000ml，用灭菌的1M NaOH（4 g溶于100 ml去离子水）调pH值到7.2-7.4，充分摇匀，分装后置4℃保存备用。

本发明的第三个目的是提供了上述一种绵羊肺炎支原体低血清高效培养基在培养绵羊肺炎支原体中的应用。

本发明的第四个目的是提供了上述一种绵羊肺炎支原体低血清高效培养基在制备绵羊肺炎支原体疫苗抗原中的应用。

本发明的有益效果为：本发明的绵羊肺炎支原体低血清高效培养基是根据绵羊肺炎支原体的生长特性，通过对不同的碳源、氮源、蛋白质、无机盐等诸多营养组分的组合进行了筛选，对培养基的pH值、渗透压、离子强度等进行比较分析，研究出了适合培养绵羊肺炎支原体的低血清高效培养基。该培养基中MEM和Hank’s液是支原体生长基础液；培养基中的葡萄糖为绵羊肺炎支原体生长提供碳源和能量；丙酮酸钠可作为支原体生长的替代碳源；通过添加新鲜酵母浸出液，为绵羊肺炎支原体生长提供所需的氮源、维生素及微量元素等营养成分；添加L-谷氨酰胺可促进微生物代谢、促进蛋白质合成；添加L-半胱氨酸和水解乳蛋白为绵羊肺炎支原体生长提供合适的氨基酸和生长因子；胰岛素不仅具有促进糖元与脂肪酸的合成，而且能促进蛋白质、脂类和RNA的合成；转铁蛋白是微生物获取微量元素的重要方式，具有促进胰岛素发挥作用；通过添加马血清，向绵羊肺炎支原体提供生长所需的胆固醇和必需的饱和或不饱和脂肪酸；通过添加青霉素可抑制杂菌生长，对支原体无抑制效果，可避免培养基污染和延长培养基保存时间；添加酚红作为pH值指示剂，可判断支原体的生长状况。该培养基的配方中除基本成份外，在培养基中还添加了新鲜酵母浸出液、L-谷氨酰胺、L-半胱氨酸、水解乳蛋白、小牛胸腺DNA、转铁蛋白、胰岛素等成分，上述成分的添加能明显提高绵羊肺炎支原体的活菌滴度；经反复实验证实，未添加之前活菌滴度为10⁷～10⁸CCU/ml，添加之后活菌滴度可达10¹⁰ CCU/ml。而本发明最大的优势在于培养基中低血清含量和培养绵羊肺炎支原体活菌滴度高。本发明培养基马血清用量仅为5%，是现有技术培养基血清含量的1/4；用本发明方法制备的绵羊肺炎支原体半成品菌液滴度达10¹⁰ CCU/ml，改良KM2培养基培养绵羊肺炎支原体活菌滴度为10⁷CCU/ml，改良Thiaucourt's培养基和TSB-1培养基培养绵羊肺炎支原体活菌滴度为10⁸～10⁹CCU/ml，使用本发明低血清高效培养基的培养绵羊肺炎支原体的活菌滴度明显高于改良KM2培养基、改良Thiaucourt's培养基和TSB-1培养基。低血清高效培养基大大减轻了疫苗中异源体血清对羊体的过敏应激反应，提高了生物安全；同时培养绵羊肺炎支原体活菌滴度高，降低了疫苗生产成本，为绵羊肺炎支原体优质疫苗的研制奠定了基础。

附图说明

图1显示为绵羊肺炎支原体在本发明低血清高效培养基的生长情况。

具体实施方式

本发明所用制剂来源：

MEM：GIBCO公司产品，货号61100-087。

葡萄糖：北京化工厂产品。

丙酮酸钠：AMRESCO公司产品，货号为0342。

L-谷氨酰胺：sigma公司产品，货号为V900419。

L-半胱氨酸：AMRESCO公司产品，货号为J994。

水解乳蛋白：北京索莱宝科技有限公司产品，货号为L8100。

转铁蛋白：sigma公司产品，货号为T8158。

胰岛素：HUMOBIO公司产品，货号为HAK4570。

小牛胸腺DNA：sigma公司产品，货号为D1501。

青霉素：为上海公谊兽药厂产品。

马血清：Hyclone公司产品，货号为SH30074.03。

酚红：sigma公司产品，货号为P3532。

质量浓度为1%的酚红的配制：称取酚红1.0 g，置玻璃研钵中，逐滴加入0.1M NaOH（0.4 g溶于10 ml去离子水），研磨至完全溶解。将溶解的酚红吸入100 ml量瓶中，用去离子水小心洗下研钵中残留酚红液至量瓶中，最后补加去离子水至100 ml。

Hank’s 液的配制：称取5.0 g氯化钠（NaCl）、0.4 g氯化钾（KCl）、1.6 g磷酸氢二钠（Na₂HPO_4。12H₂O）、0.1 g磷酸二氢钾（KH₂PO₄)、0.2 g硫酸镁（MgSO₄.7H₂O）、10 g葡萄糖，用800 ml去离子水溶解并定容至1000 ml，115℃高压蒸气灭菌20分钟，置4℃保存备用。

质量浓度为25%的新鲜酵母浸出液的制备：取鲜酵母500 g，加入去离子水2000 ml中，搅拌溶解，用浓盐酸：去离子水以=1:1（体积比）调pH值至4.5-5.0，80℃水浴（瓶内温度）30分钟，3000 转/分离心20分钟，取上清液。将上清液用1 M NaOH（4 g溶于100 ml去离子水）调pH值至7.8-8.0，煮沸，置室温放凉后用双层滤纸过滤，再补去离子水至2000 ml，-20℃保存备用。

实施例1：

1、本发明培养基的制备：

基础培养基：

（1）MEM 6.5 g

（2）丙酮酸钠 6.0 g

（3）葡萄糖 6.0 g

（4）质量浓度为1%的酚红 2.5 ml

（5）Hank’s液 500 ml

（6）去离子水300 ml。

辅助培养基：

（7）质量浓度为25%的新鲜酵母浸出液 30 ml

（8）质量浓度为3%的L-谷氨酰胺16 ml

（9）质量浓度为10%的L-半胱氨酸5.0 ml

（10）质量浓度为15%水解乳蛋白 32.5 ml

（11）转铁蛋白（10 mg/ml）1.0 ml

（12）胰岛素（10 mg/ml）1.0 ml

（13）小牛胸腺DNA （2mg/ml） 10.0 ml

（14）青霉素 (20万IU/ml) 0.25 ml

（15）无菌马血清50 ml

将基础培养基中（1）-（5）成分逐一溶入300ml去离子水（6）中，115℃高压灭菌20min。待冷却至室温后，在无菌条件下加入经0.22 微米滤膜滤过除菌的辅助培养基（7）-（15）成分，混合，用灭菌水补齐定容至1000ml，用灭菌的1M NaOH调pH值到7.4，充分摇匀后分装，置4℃保存备用。

实施例2：

本发明培养基的制备：

基础培养基：

（1）MEM 6.0 g

（2）丙酮酸钠 6.0 g

（3）葡萄糖 6.0 g

（4）质量浓度为1%的酚红 2.5 ml

（5）Hank’s液 500 ml

（6）去离子水300 ml。

辅助培养基：

（7）质量浓度为25%的新鲜酵母浸出液 35 ml

（8）质量浓度为3%的L-谷氨酰胺17 ml

（9）质量浓度为10%的L-半胱氨酸5.0 ml

（10）质量浓度为15%的水解乳蛋白 35.0 ml

（11）转铁蛋白（10 mg/ml）1.0 ml

（12）胰岛素（10 mg/ml）0.8 ml

（13）小牛胸腺DNA （2mg/ml） 10.0 ml

（14）青霉素 (20万IU/ml) 0.25 ml

（15）无菌马血清50 ml

将基础培养基中（1）-（5）成分逐一溶入300ml去离子水（6）中，115℃高压灭菌20min。待冷却至室温后，在无菌条件下加入经0.22 微米滤膜滤过除菌的辅助培养基（7）-（15）成分，混合，用灭菌水补齐定容至1000ml，用灭菌的1M NaOH调pH值到7.4，充分摇匀后分装，置4℃保存备用。

实施例3：

应用本发明培养基、改良KM2培养基、改良Thiaucourt's培养基、TSB-1培养基对绵羊肺炎支原体Y98株进行比较试验：

1、本发明培养基的制备

基础液：

（1）MEM 6.0 g

（2）丙酮酸钠 5.0 g

（3）葡萄糖 6.0 g

（4）质量浓度为1%的酚红 2.5 ml

（5）Hank’s 液 500 ml

（6）去离子水300 ml。

辅助培养基：

（7）质量浓度为25%的新鲜酵母浸出液 30 ml

（8）质量浓度为3%的L-谷氨酰胺16.7 ml

（9）质量浓度为10%的L-半胱氨酸5.0 ml

（10）质量浓度为15%的水解乳蛋白 33.4 ml

（11）转铁蛋白（10 mg/ml）1.0 ml

（12）胰岛素（10 mg/ml）1.0 ml

（13）小牛胸腺DNA （2mg/ml） 10.0 ml

（14）青霉素 (20万IU/ml) 0.25 ml

（15）无菌马血清50 ml

将基础培养基中（1）-（5）成分逐一溶入300ml去离子水（6）中，115℃高压灭菌20min。待冷却至室温后，在无菌条件下加入经0.22 微米滤膜滤过除菌的辅助培养基（7）-（15）成分，混合，用灭菌水补齐定容至1000ml，用灭菌的1M NaOH调pH值到7.4，充分摇匀后分装，置4℃保存备用。

2、改良Thiaucourt's培养基的制备（1000ml）

基础液：

PPLO肉汤21.0 g

去离子水700 ml。

115℃高压灭菌20 min；

培养基：

基础液 700ml

50%丙酮酸钠4.0 ml

50%葡萄糖2.0 ml

质量浓度为1%的酚红2.5 ml

质量浓度为25%的新鲜酵母浸出液100 ml

青霉素（20万IU/ml）1.0 ml

10%醋酸铊1.0 ml

无菌马血清200 ml

混合用灭菌的1M NaOH调pH值到7.4，经0.22 微米滤膜滤过除菌分装备用。

3、TSB-1培养基（1000ml）

胰蛋白胨大豆肉汤 30g

乳糖 10 g

DNA 0.02g

质量浓度为1%的酚红2.5 ml

青霉素（20万IU/ml）1.0 ml

10%醋酸铊1.0 ml

无菌猪血清200 ml

用去离子水定容至1000ml，用灭菌的1M NaOH调pH值到7.4，经0.22 微米滤膜滤过除菌分装备用。

4、改良KM2培养基（500ml）

1.7%水解乳蛋白Hank’s液150 ml

MEM 2.5 g

葡萄糖2.0 g

丙酮酸钠1.0 g

质量浓度为1%的酚红1.25 ml

质量浓度为25%的新鲜酵母浸出液10 ml

青霉素（20万IU/ml）0.5 ml

10%醋酸铊0.5 ml

无菌马血清100 ml

用去离子水定容至500ml，用灭菌的1M NaOH调pH值到7.4，经0.22 微米滤膜滤过除菌分装备用。

5、绵羊肺炎支原体的培养 将绵羊肺炎支原体Y98株（购自中国兽医微生物菌种保藏中心CVCC，编号CVCC384）分别接种本发明低血清高效培养基（血清含量为5%）、改良KM2培养基（血清含量为20%）、改良Thiaucourt's培养基（血清含量为20%）、TSB-1培养基（血清含量为20%），种子继代复壮后，分别按10% (V/V) 的比例接种对应培养基，37℃恒温培养，当培养基的颜色变黄、pH值由7.4降至6.5～6.8时，无菌取出培养物。

6、活菌滴度（CCU）测定。方法如下：取12支试管，每管加对应培养基4.5 ml，在第1管中加入0.5 ml生长良好的绵羊肺炎支原体培养物，用振荡器充分混匀，换新的移液管，从第1管吸取0.5 ml加入到第2管中，依次进行10倍稀释至第11管，第11管中弃去0.5 ml培养液；得到培养液的稀释度分别为10^-1-10^-11，第12管为对应培养基对照。试验管设3个重复。将试管置37℃恒温培养箱中静置培养，每天观察颜色变化，连续观察10天，发生颜色变化的最高稀释度即为该培养物的活菌滴度，用颜色变化单位（CCU）表示。试验重复3次。

7、结果：

绵羊肺炎支原体接种4种培养基3次生长试验CCU测定结果见表1。

表1

3次试验结果显示，在同样条件下，使用改良KM2培养基、改良Thiaucourt's培养基、TSB-1培养基培养绵羊肺炎支原体的生长时间均为48h，本发明培养基的生长时间为24h，比现有技术培养时间缩短了1/2。使用改良KM2培养基培养绵羊肺炎支原体3次CCU测定结果均为10⁷CCU/ml，改良Thiaucourt's培养基培养绵羊肺炎支原体3次CCU测定结果为10⁸～10⁹ CCU/ml，TSB-1培养基培养绵羊肺炎支原体的3次CCU测定结果为10⁸ ～10⁹CCU/ml；本发明低血清高效培养基培养绵羊肺炎支原体，生长情况见图1。本发明培养基培养绵羊肺炎支原体3次CCU测定结果均为10¹⁰ CCU/ml。结果表明，同样条件下，使用本发明低血清高效培养基的活菌滴度远远高于改良KM2培养基，显著高于改良Thiaucourt's培养基和TSB-1培养基。以上结果说明，本发明的绵羊肺炎支原体培养基具有血清含量低、生长迅速和活菌滴度高的特点。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。