专利名称：一种连续增菌培养鸡毒支原体培养基及制备方法
技术领域：
本发明属于生物制品技术领域，涉及一种改良的增菌培养鸡毒支原体培养基，尤其涉及一种鸡毒支原体增菌培养工艺。
背景技术：
鸡毒支原体(Mycoplasmagalliseptium, MG)是鸡慢性呼吸道病(chronicrespiratory disease, CRD)的病原,且感染率很高。CRD可通过水平和垂直方式传播并在鸡群中长期存在和蔓延。鸡场感染MG后，雏鸡的弱雏率升高，蛋鸡的产蛋率、肉鸡的体重及饲料转化率均下降，对养鸡业的发展造成严重危害。目前各鸡场对鸡毒支原体的治疗主要是使用抗生素，而鸡毒支原体易产生耐药性，效果也不理想。免疫疫苗是控制鸡毒支原体病的最好措施，但优质疫苗的前提需要有一种好的培养基来支撑。目前生产鸡毒支原体疫苗，主要应用改良Frey氏培养基或其他支原体培养基培养鸡毒支原体。其制苗用菌液培养工艺为将合格的鸡毒支原体生产用种子液按1: 10的比例接种于培养基，逐步扩大培养，一直到所需的量；每代均置37°c培养24-48h，待培养基的PH下降到6. 4左右收获；按此传统工艺培养所获得的鸡毒支原体制苗用菌液(半成品)的浓度最高只能达到I X 109(XU/ml。
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上述传统培养基及培养工艺所培养的鸡毒支原体培养滴度低(培养菌液浓度低)，制苗用菌液(半成品)生产灭活疫苗时不能直接使用，需对半成品进行一定浓缩后方可制备成品疫苗，而半成品的浓缩操作繁琐、浓缩过程损失较大，最终影响成品疫苗的保护效力，并且使疫苗生产成本提高。
发明内容
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本发明要解决的技术`问题是提供一种连续增菌培养鸡毒支原体培养基及其制备方法，该方法能够提高鸡毒支原体菌液浓度及培养滴度。本发明提供的一种连续增菌培养鸡毒支原体培养基及其制备方法，包括如下步骤1、连续增菌培养鸡毒支原体培养基
PPLO 肉汤20.0-25.5g
酵母浸出粉3-7g
葡萄糖7-9g
质量浓度为0.4%的酚红溶液2ml加去离子水700-800ml
121°C高压灭菌15分钟，4°C保存。培养时，再加150-200ml猪血清和1000单位/ml青霉素，20%Na0H调ρΗ7· 6-7. 8。
2、上述连续增菌培养鸡毒支原体培养基制备按如下步骤进行(I)将鸡毒支原体生产用种子按1: 10的比例接种于所述的鸡毒支原体培养基中，在36-37°C培养18-24h收获；以同样方法将收获的培养液按1: 10的比例再接种传代I次；(2)将上述传代后的菌液按1: 10的比例接种于本发明的连续增菌培养基中，37°C培养，待pH下降至6. 5左右，添加连续增菌培养鸡毒支原体培养基为原培养体积的30%，用20%Na0H调pH7. 6-7. 8，如此进行两次增菌培养，待第二次增菌培养pH下降到6. 4时，加甲醛灭活，连续增菌培养结束。本发明的连续增菌培养鸡毒支原体培养基对不同碳源、氮源、无机盐、蛋白质和胆固醇等诸多营养组分进行了筛选，在培养过程中对鸡毒支原体的生长特性进行了全面的了解掌握，在培养过程中适时地添加培养基，使得鸡毒支原体繁殖菌体延长生长稳定期时段，最大限度地利用消耗培养基中的有效成分，从而鸡毒支原体有效抗原大大增值增量，最终菌液可直接或稀释后制备灭活疫苗，菌液无需浓缩，不仅简化了生产工艺，而且降低了生产成本。
具体实施例方式实施例1本发明培养基的制备1、连续增菌培养鸡毒支原体培养基
PPLO 肉汤21g
酵母浸出粉4g 葡萄糖7g
质量浓度为0.4%的酚红溶液2ml加去离子水700ml
121°C高压灭菌15分钟，4°C保存。培养时，再加200ml猪血清和1000单位/ml青霉素，20%Na0H调ρΗ7· 6-7. 82、上述连续增菌培养鸡毒支原体培养基制备按如下步骤进行(I)将鸡毒支原体生产用种子按1: 10的比例接种于所述的鸡毒支原体培养基中，在36-37°C培养18-24h收获；以同样方法将收获的培养液按1: 10的比例再接种传代I次；(2)将上述传代后的菌液按1: 10的比例接种于本发明的连续增菌培养基中，37°C培养，待pH下降至6. 5左右，添加连续增菌培养鸡毒支原体培养基为原培养体积的30%，用20%Na0H调pH7. 6-7. 8，如此进行两次增菌培养，待第二次增菌培养pH下降到6. 4时，加甲醛灭活，连续增菌培养结束。实施例2本发明培养基的制备1、连续增菌培养鸡毒支原体培养基PPLO肉汤酵母浸出粉葡萄糖质量浓度为0.4%的酚红溶液加去离子水121°C高压灭菌15分钟，4°C保存。
培养时，再加180ml猪血清和1000单位/ml青霉素，20%Na0H调ρΗ7· 6-7. 8。
2、上述连续增菌培养鸡毒支原体培养基制备按如下步骤进行
(I)将鸡毒支原体生产用种子按1: 10的比例接种于所述的鸡毒支原体培养基中，在36-37°C培养18-24h收获；以同样方法将收获的培养液按1: 10的比例再接种传代 I次；
(2)将上述传代后的菌液按1: 10的比例接种于本发明的连续增菌培养基中， 37°C培养，待PH下降至6. 5左右，添加连续增菌培养鸡毒支原体培养基为原培养体积的 30%，用20%Na0H调pH7. 6-7. 8，如此进行两次增菌培养，待第二次增菌培养pH下降到6. 4 时，加甲醛灭活，连续增菌培养结束。
实施例3本发明培养基的制备
1、连续增菌培养鸡毒支原体培养基
PPLO 肉汤168g酵母浸出粉30g葡萄糖55g质量浓度为0.4%的酚红溶液16ml 加去离子水5500ml121°C高压灭菌15分钟4°C保存
培养时，再加1800ml猪血清和1000单位/ml青霉素，20%Na0H调ρΗ7· 6-7. 8。
2、上述连续增菌培养鸡毒支原体培养基制备按如下步骤进行
(I)将鸡毒支原体生产用种子按1: 10的比例接种于所述的鸡毒支原体培养基中，在36-37°C培养18-24h收获；以同样方法将收获的培养液按1: 10的比例再接种传代 I次；
(2)将上述 传代后的菌液按1: 10的比例接种于本发明的连续增菌培养基中， 37°C培养，待pH下降至6. 5左右，添加连续增菌培养鸡毒支原体培养基为原培养体积的 30%，用20%Na0H调pH7. 6-7. 8，如此进行两次增菌培养，待第二次增菌培养pH下降到6. 4 时，加甲醛灭活，连续增菌培养结束。
权利要求
1.一种连续增菌培养鸡毒支原体培养基及制备方法，所述疫苗经鸡毒支原体培养基配制、种子制备、制苗菌液连续增菌培养及灭活疫苗制备工序制成，其特征在于，所述鸡毒支原体培养基按如下工艺配制 PPLO 肉汤20. 0-25. 5g 酵母浸出粉3-7 g 葡萄糖7-9g 质量浓度为0. 4%的酚红溶液2ml 加去离子水700— 800ml 121°C高压灭菌15分钟4°C保存； 培养时，再加150-200ml猪血清和1000单位/ml青霉素，20%Na0H调pH7. 6-7. 8。
2.根据权利要求1所述的连续增菌培养鸡毒支原体培养基的制备方法，其特征在于，所述培养制苗用培养基的制备按如下步骤进行 (1)将鸡毒支原体生产用种子按1: 10的比例接种于所述的鸡毒支原体培养基中，在36-37°C培养18-24h收获；以同样方法将收获的培养液按1: 10的比例再接种传代I次； (2)将上述传代后的菌液按1: 10的比例接种于本发明的连续增菌培养基中，37°C培养，待PH下降至6. 5左右，添加连续增菌培养鸡毒支原体培养基为原培养体积的30%，用20%Na0H调pH7. 6-7. 8，如此进行两次增菌培养，待第二次增菌培养pH下降到6. 4时，加甲醛灭活，连续增菌培养结束。
3.根据权利要求1和2所述的连续增菌培养鸡毒支原体培养基的制备方法，包括鸡毒支原体所有灭活疫苗抗原的制备。
全文摘要
发明涉及连续增菌培养鸡毒支原体培养基及制备方法，属于兽医生物学技术领域。包括PPLO、酵母浸出粉、葡萄糖等组成，使用前加入健康猪血清。该培养基能够既保证半成品生长滴度高而且稳定，用本发明方法制备的半成品菌液高达1012CCU/ml；同时该培养基采用连续增菌培养工艺培养鸡毒支原体，使得鸡毒支原体繁殖菌体延长生长稳定期时段，最大限度地利用消耗培养基中的有效成分，从而使得鸡毒支原体有效抗原大大增值增量，最终菌液可直接或稀释后制备灭活疫苗，菌液无需浓缩，不仅简化了生产工艺，而且降低了生产成本。
文档编号A61P31/04GK103060221SQ20121031997
公开日2013年4月24日 申请日期2012年8月31日 优先权日2012年8月31日
发明者不公告发明人 申请人:南京天邦生物科技有限公司