一种大肠杆菌的微离心式培养方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物培养技术领域，具体涉及一种大肠杆菌的微离心式培养方法。
【背景技术】
[0002]大肠杆菌是与我们日常生活关系非常密切的一类细菌，属于肠道杆菌大类中的一种。各种动物大肠杆菌灭活疫苗的制备中，首要环节就是大肠杆菌的培养。为了获得理想的活菌浓度，业界对大肠杆菌培养工艺进行了大量研究。影响大肠杆菌培养菌浓度的因素有很多，如培养基组成、培养时间、菌种接种量以及细菌生长环境等一般情况下，生物药物的产率与大肠杆菌发酵密度密切相关，大肠杆菌的收率直接关系到生物药物的产率。所以在菌体表达蛋白效率相当的情况下，大肠杆菌的发酵密度直接影响到生物药物的生产成本。
【发明内容】
[0003]为解决现有技术的不足，本发明提供了一种大肠杆菌的微离心式培养方法。
[0004]—种大肠杆菌的微离心式培养方法，包括以下步骤:
[0005]I)将大肠杆菌菌种接种于第一培养基中，将培养基固定在离心旋转机中，转速3?4秒/转，36.5?37.5°C条件下培养16?24小时，在琼脂平板上划线接种，37.5?38.5°C条件下培养15?20小时，得到一级培养种子；
[0006]2)将步骤I)得到的一级培养种子接种到第二培养基中，将培养基固定在离心旋转机中，转速2?3秒/转，34.5?35.5°C条件下培养12?15小时，得到二级培养种子；
[0007]3)将步骤2)得到的二级培养种子接种于菌液中，再导入至离心管中，加入15?20%的琼脂，摇床过夜，再加入氯化钙溶液，混悬菌液，离心分离，将上层清液去除，即得。
[0008]具体的，步骤I)中，所述的第一培养基中的营养成分包括:硫酸铵、磷酸氢二钠、七水硫酸镁、酵母提取物、甘油、二水钼酸钠、五水硫酸铜、生物素、硫酸锰、六水氯化钴和蒸馏水。
[0009]具体的，步骤2)中，所述的第二培养基中的营养成分包括:葡萄糖、蛋白胨、磷酸二氢钾、磷酸二氢钾、柠檬酸、硫酸镁、镁、酵母提取物、六水氯化铁、硼酸、七水硫酸锌、谷氨酸钠和蒸馏水。
[0010]优选的，步骤3)中，所述摇床的转速为90?150转/分钟。
[0011]优选的，步骤3)中，所述氯化钙溶液的浓度为2?3%。
[0012]本发明所提供的大肠杆菌的微离心式培养方法能稳定的对大肠杆菌进行快速培养，显著的缩短的培养时间的消耗，能够获得符合实验室使用标准的高浓度活菌。
【具体实施方式】
[0013]以下对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
[0014]实施例1
[0015]—种大肠杆菌的微离心式培养方法，包括以下步骤:
[0016]I)将大肠杆菌菌种接种于第一培养基中，将培养基固定在离心旋转机中，转速3秒/转，37.0件下培养20小时，在琼脂平板上划线接种，38.0°C条件下培养18小时，得到一级培养种子。其中，第一培养基中的营养成分包括:硫酸铵、磷酸氢二钠、七水硫酸镁、酵母提取物、甘油、二水钼酸钠、五水硫酸铜、生物素、硫酸锰、六水氯化钴和蒸馏水。
[0017]2)将步骤I)得到的一级培养种子接种到第二培养基中，将培养基固定在离心旋转机中，转速3秒/转，35.(TC条件下培养13小时，得到二级培养种子。第二培养基中的营养成分包括:葡萄糖、蛋白胨、磷酸二氢钾、磷酸二氢钾、柠檬酸、硫酸镁、镁、酵母提取物、六水氯化铁、硼酸、七水硫酸锌、谷氨酸钠和蒸馏水。
[0018]3)将步骤2)得到的二级培养种子接种于菌液中，再导入至离心管中，加入18%的琼脂，摇床过夜，再加入氯化钙溶液，混悬菌液，离心分离，将上层清液去除，即得。其中，摇床的转速为120转/分钟。氯化钙溶液的浓度为2.5%。
[0019]所得活菌浓度为8.5 X 109CFU/ml。
[0020]实施例2
[0021]—种大肠杆菌的微离心式培养方法，包括以下步骤:
[0022]I)将大肠杆菌菌种接种于第一培养基中，将培养基固定在离心旋转机中，转速4秒/转，37.5°C条件下培养24小时，在琼脂平板上划线接种，37.5°C条件下培养20小时，得到一级培养种子。其中，第一培养基中的营养成分包括:硫酸铵、磷酸氢二钠、七水硫酸镁、酵母提取物、甘油、二水钼酸钠、五水硫酸铜、生物素、硫酸锰、六水氯化钴和蒸馏水。
[0023]2)将步骤I)得到的一级培养种子接种到第二培养基中，将培养基固定在离心旋转机中，转速2秒/转，35.5°C条件下培养12小时，得到二级培养种子。第二培养基中的营养成分包括:葡萄糖、蛋白胨、磷酸二氢钾、磷酸二氢钾、柠檬酸、硫酸镁、镁、酵母提取物、六水氯化铁、硼酸、七水硫酸锌、谷氨酸钠和蒸馏水。
[0024]3)将步骤2)得到的二级培养种子接种于菌液中，再导入至离心管中，加入20%的琼脂，摇床过夜，再加入氯化钙溶液，混悬菌液，离心分离，将上层清液去除，即得。其中，摇床的转速为90转/分钟。氯化钙溶液的浓度为3 %。
[0025]所得活菌浓度为1.2 X 1010CFU/ml。
[0026]实施例3
[0027]—种大肠杆菌的微离心式培养方法，包括以下步骤:
[0028]I)将大肠杆菌菌种接种于第一培养基中，将培养基固定在离心旋转机中，转速3秒/转，37.5°C条件下培养16小时，在琼脂平板上划线接种，38.5°C条件下培养15小时，得到一级培养种子。其中，第一培养基中的营养成分包括:硫酸铵、磷酸氢二钠、七水硫酸镁、酵母提取物、甘油、二水钼酸钠、五水硫酸铜、生物素、硫酸锰、六水氯化钴和蒸馏水。
[0029]2)将步骤I)得到的一级培养种子接种到第二培养基中，将培养基固定在离心旋转机中，转速3秒/转，34.5°C条件下培养5小时，得到二级培养种子。第二培养基中的营养成分包括:葡萄糖、蛋白胨、磷酸二氢钾、磷酸二氢钾、柠檬酸、硫酸镁、镁、酵母提取物、六水氯化铁、硼酸、七水硫酸锌、谷氨酸钠和蒸馏水。
[0030]3)将步骤2)得到的二级培养种子接种于菌液中，再导入至离心管中，加入15%的琼脂，摇床过夜，再加入氯化钙溶液，混悬菌液，离心分离，将上层清液去除，即得。其中，摇床的转速为150转/分钟。氯化钙溶液的浓度为2%。
[0031]所得活菌浓度为1.3X1010CFU/mlo
[0032]以上所述仅为本发明的较佳实施方式，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1.一种大肠杆菌的微离心式培养方法，其特征在于，包括以下步骤: 1)将大肠杆菌菌种接种于第一培养基中，将培养基固定在离心旋转机中，转速3?4秒/转，36.5?37.5°C条件下培养16?24小时，在琼脂平板上划线接种，37.5?38.5°C条件下培养15?20小时，得到一级培养种子； 2)将步骤I)得到的一级培养种子接种到第二培养基中，将培养基固定在离心旋转机中，转速2?3秒/转，34.5?35.5°C条件下培养12?15小时，得到二级培养种子； 3)将步骤2)得到的二级培养种子接种于菌液中，再导入至离心管中，加入15?20%的琼脂，摇床过夜，再加入氯化钙溶液，混悬菌液，离心分离，将上层清液去除，即得。2.根据权利要求1所述的大肠杆菌的微离心式培养方法，其特征在于:步骤I)中，所述的第一培养基中的营养成分包括:硫酸铵、磷酸氢二钠、七水硫酸镁、酵母提取物、甘油、二水钼酸钠、五水硫酸铜、生物素、硫酸锰、六水氯化钴和蒸馏水。3.根据权利要求2所述的大肠杆菌的微离心式培养方法，其特征在于:步骤2)中，所述的第二培养基中的营养成分包括:葡萄糖、蛋白胨、磷酸二氢钾、磷酸二氢钾、柠檬酸、硫酸镁、镁、酵母提取物、六水氯化铁、硼酸、七水硫酸锌、谷氨酸钠和蒸馏水。4.根据权利要求1至3任一所述的大肠杆菌的微离心式培养方法，其特征在于:步骤3)中，所述摇床的转速为90?150转/分钟。5.根据权利要求1至3任一所述的大肠杆菌的微离心式培养方法，其特征在于:步骤3)中，所述氯化钙溶液的浓度为2?3%。
【专利摘要】本发明涉及生物培养技术领域，具体涉及一种大肠杆菌的微离心式培养方法。该方法包括步骤：1)将大肠杆菌菌种接种于第一培养基中，将培养基固定在离心旋转机中培养，在琼脂平板上划线接种，得到一级培养种子；2)接种到第二培养基中，将培养基固定在离心旋转机中，得到二级培养种子；3)接种于菌液中，再导入至离心管中，加入15～20％的琼脂，摇床过夜，再加入氯化钙溶液，混悬菌液，离心分离，将上层清液去除，即得。本发明所提供的大肠杆菌的微离心式培养方法能稳定的对大肠杆菌进行快速培养，显著的缩短的培养时间的消耗，能够获得符合实验室使用标准的高活菌浓度。
【IPC分类】C12N1/20, C12R1/19
【公开号】CN105255764
【申请号】CN201510710362
【发明人】林炳营
【申请人】桂林瑞丰环保微生物应用研究所
【公开日】2016年1月20日
【申请日】2015年10月27日