专利名称：苍白杆菌cts-325及其培养方法以及还原六价铬的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及微生物及其在有氧条件下高效彻底还原六价铬的应用以及培养方法。
背景技术：
铬盐产品是国民经济发展不可缺少的重要化工原料，在电镀、印染、鞣革、木材防腐、石油开采等方面都有广泛的应用。在生产和应用铬盐产品的过程中将不可避免地产生大量的铬污染，严重威胁人类的健康。据报道，若饮用了受到铬污染的水，可致腹部不适及腹泻等中毒症状；铬为皮肤变态反应原，会引起过敏性皮炎或湿疹；铬对呼吸道有刺激和腐蚀作用，会引起鼻炎、咽炎、支气管炎，严重时使鼻中隔糜烂，甚至穿孔；铬还是致癌因子和致突变因子。
铬在自然界中主要以三价铬(Cr(III))和六价铬(Cr(VI))两种价态存在，在一定条件下它们之间可以相互转化，但是二者之间有着明显的不同，三价铬是比较稳定的价态，由于它对氧和氢氧根离子有较高的亲和力，所以很容易与很多有机和无机配体络合，因为三价铬的化学性质的不活泼性，在水溶液中形成的许多配合体都比较稳定并且容易分离，此外，三价铬还是生物体内必需的微量元素之一；而六价铬水可溶高，迁移性强，具有强的氧化性，是被公认的致癌物之一。环境中的铬污染主要是由毒性大、水溶性高、迁移性强、不易被固定的六价铬引起的，但是当六价铬被还原成三价铬后，其毒性则大大降低.而且三价铬一般很容易形成沉淀从水体中分离。因此，把有毒性的六价铬还原成三价铬，是减少环境中铬污染的有效方法。
铬污染的治理历来被认为是世界性难题，治理技术核心是将可溶、易迁移、高毒的六价铬还原为溶解度小、毒性弱、易回收的三价铬，并进行回收利用。对于铬渣的处理，如高温火法解毒和湿法化学解毒均存在易产生二次污染、成本过高以及解毒后易出现“返黄”问题等不足之处，难以广泛推广应用；对于含铬工业污水的处理，则有硫酸亚铁法、离子交换法和微生物还原法等。微生物还原法在铬渣浸取液和含铬工业污水的处理方法中具有基建投资小、运行成本低、解毒彻底、无二次污染以及还原后的三价铬易回收等优点，因此具有广阔的应用前景。
自从1978年Summers等人发现了铜绿假单胞菌抗铬质粒和1983年Bopp等人报道了荧光假单胞菌抗铬质粒，以及1998年Mondaca等人从恶臭假单胞菌分离到抗铬质粒后，各国学者对假单胞细菌用于生物除铬进行了广泛的研究。李德福等对硫酸盐还原细菌(SRB)进行了研究，先把SO42-还原成H2S，再由H2S将六价铬还原，并应用到电镀废水的处理，但是处理过程会产生有毒的H2S气体难以控制，从而限制了该方法的应用。日本学者曾经报道用阴沟肠杆菌HO1(E.cloacae HO1)在厌氧的条件下处理含铬工业废水，该方法要形成厌氧条件，必须在培养基中充入大量的氮气，以去除培养基中的溶解氧，这大大增加了运行成本和工艺可操作性。Muhammad Faisal等人报道用烟碱降解细菌(Ochrobactrum intermediumCrT-1)对六价铬进行还原，在最佳条件下的还原率也仅有73％。
发明内容
本发明的目的在于提供一种利用微生物在有氧条件下高效彻底还原六价铬的应用及其培养方法。
本发明利用的微生物经法国梅里埃系统鉴定为苍白杆菌CTS-325(Ochrobactrum sp.CTS-325)，该菌株已保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址中国北京，保藏日期为2006年5月18日，保藏编号为CGMCC1715。
本发明所用菌株是从湖南长沙某铬盐厂的排污水沟的淤泥中分离出的革兰氏阴性细菌，菌落呈圆形，乳白色，表面光滑，菌落大小约有0.5～1.0mm，光学显微镜(1000×)观察为具平行边和圆端的短杆菌。苍白杆菌CTS-325(Ochrobactrumsp.CTS-325)在好氧、常压、宽的温度范围(25-42℃)及较宽的pH范围(pH 7-9)条件下表现出较高的还原六价铬的能力。
为实现本发明的目的，本发明包括如下技术方案 1.苍白杆菌CTS-325(Ochrobactrum sp.CTS-325)(保藏号为CGMCC1715)。
2.项1的苍白杆菌CTS-325在还原六价铬的应用。
3.如项2所述的苍白杆菌CTS-325在还原六价铬的应用，其特征在于在该菌株还原六价铬的过程中pH值为7-9。
4.如项2所述的苍白杆菌CTS-325在还原六价铬的应用，其特征在于该菌株在微生物学上可选用的培养基中包含木糖、核糖、葡萄糖、果糖、半乳糖、蔗糖、麦芽糖、淀粉、甘油或者甘露醇中的一种或其中任意几种的组合。
5.如项2所述的苍白杆菌CTS-325在还原六价铬的应用，其特征在于所述的培养基中包含木糖或蔗糖。
我们用四种不同的含铬培养基(1#，2#，3#，4#)对苍白杆菌CTS-325进行了培养，在这四种培养基中，苍白杆菌CTS-325均有菌体生长和还原六价铬的能力，但是相比较而言，1#培养基中的菌体生长和还原六价铬效果最好，同时我们还发现在四种培养基(1#，2#，3#，4#)中六价铬还原曲线均会随着生长曲线进入稳定期而进入平台期，即仍有相当一部分六价铬不能被还原(如图1所示)，在初始六价铬浓度为100mg/L的四种含铬培养基中培养72小时后，六价铬浓度分别剩余20mg/L，38mg/L，43mg/L和67mg/L，并且随着培养时间的延长六价铬浓度不再下降。由于苍白杆菌CTS-325在1#培养基中有更好的菌体生长和还原六价铬的能力，我们对1#培养基进行了成分优化。如果我们不对1#培养基进行优化，苍白杆菌CTS-325分别在72小时和96小时内只能将100mg/L和200mg/L的六价铬还原至20mg/L和75mg/L(如表1所示)，但是当我们优化1#培养基后(即在1#培养基中加入木糖或蔗糖等糖类小分子时)，苍白杆菌CTS-325能分别在50小时和120小时内把100mg/L和200mg/L的六价铬还原到零(如表2所示)。为了在实际应用中降低培养基成本，我们用生产木糖或蔗糖剩余的甘蔗渣代替木糖或蔗糖进行实验，实验结果表明六价铬仍能被高效彻底的还原成三价铬。我们用苍白杆菌CTS-325在优化的培养基中处理含铬工业废水和铬渣浸出液，其中的六价铬均能被还原达到污水排放标准。本发明中六价铬在培养基中的含量采用二苯碳酰二肼法(GB7476-87)检测。
本发明首次采集分离到具有高效还原六价铬能力的苍白杆菌CTS-325。苍白杆菌CTS-325的培养和还原六价铬过程均可以在好氧、常压、较宽的温度范围(25-42℃)及较宽的pH范围(pH 7-9)条件下进行；对比苍白杆菌CTS-325在四种含铬培养基(1#，2#，3#，4#)中的菌体生长和六价铬还原情况，其中1#的效果最佳，但是却不能使六价铬彻底还原，当我们使用木糖或蔗糖或廉价的甘蔗渣优化1#培养基后，苍白杆菌CTS-325均能高效彻底的处理含铬工业废水和铬渣浸出液中的六价铬污染。
根据布达佩斯条约，苍白杆菌CTS-325(Ochrobactrum sp.CTS-325)，已保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址中国北京，保藏日期为2006年5月18日，保藏编号为CGMCC1715。
图1苍白杆菌CTS-325在四种培养基中的菌体生长曲线，其中■)1#培养基，(
)2#培养基(▲)3#培养基，(●)1#培养基，初始Cr(VI)浓度为100mg/L。
图2苍白杆菌CTS-325在四种培养基中还原Cr(VI)的曲线。
图3苍白杆菌CTS-325在初始六价铬浓度为100mg/L的1#培养基中，培养68h后还原进入平台期，加入不同的单糖分子后六价铬的还原曲线，其中D-核糖(D-ribose)；D-木糖(D-xylose)；D-果糖(D-fructose)；D-甘露糖(D-mannose)；D-半乳糖(D-galactose)；D-葡萄糖(D-glucose)。
图4苍白杆菌CTS-325在初始六价铬浓度为100mg/L的1#培养基中，培养68h后还原进入平台期，加入双糖分子后六价铬的还原曲线，其中乳糖(Lactose)；麦芽糖(Maltose)；蔗糖(Sucrose)。
图5苍白杆菌CTS-325在初始六价铬浓度为100mg/L的1#培养基中，培养68h后还原进入平台期，加入糖醇分子后六价铬的还原曲线，其中甘油(Glycerol)；D-甘露醇(D-mannitol)。
图6苍白杆菌CTS-325在初始六价铬浓度为100mg/L的1#培养基中，培养68h后还原进入平台期，加入淀粉后六价铬的还原曲线，其中淀粉(Starch)。
具体实施例方式 实例1.苍白杆菌CTS-325在四种培养基中的生长及还原六价铬情况 1.1菌种的复苏 取液氮保藏的种子菌，按1100比例接入装有20ml1#液体培养基(pH 7～8)的100ml三角瓶中，在好氧、常压、30℃条件下将其置于200转/分钟摇床中振荡培养过夜使菌种复苏。
1.2苍白杆菌CTS-325在不同培养基中的培养及还原六价铬的情况 将复苏后的菌种按照菌液与培养基1100的比例转接入四个分别装有100ml培养基的250ml三角瓶中，其中四个三角瓶中所装培养基成分不同，具体配方如下，1#培养基(L-1)胰化蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g pH＝7.0～7.5；2#培养基(L-1)胰化蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化钠7.5g pH＝7.0～7.5；3#培养基(L-1)蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化钠5g pH＝7.0～7.5；4#培养基(L-1)蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠7.5g pH＝7.0～7.5。每种培养基均含有100mg/L的六价铬。在整个培养过程中实时监测六价铬的浓度变化及菌体的生长情况，培养72小时之后，四种培养基中剩余的六价铬浓度分别为20.3mg/L，38.1mg/L，43.7mg/L和67.4mg/L，并且随着培养时间的延长六价铬浓度不再下降。从菌体生长方面来看，均在72小时后进入了稳定期。比较苍白杆菌CTS-325在四种不同培养基中的菌体生长和还原效果，结果发现无论是菌体生长情况还是还原六价铬情况均为1#培养基>2#培养基>3#培养基>4#培养基。具体见图1、2。
实例2.苍白杆菌CTS-325在1#培养基中还原六价铬的情况 根据实例1我们选用了生长和还原效果最佳的1#培养基进行下面的实验，培养基中加入不同初始六价铬浓度，分别为100mg/L和200mg/L。
2.1菌种的复苏 取液氮保藏的种子菌，按1100比例接入装有20ml1#液体培养基(pH 7-8)的100ml三角瓶中，在好氧、常压、30℃条件下将其置于200转/分钟摇床中振荡培养过夜使菌种复苏。
2.2苍白杆菌CTS-325在不同初始铬浓度下还原六价铬的情况 将复苏后的菌种按照菌液与培养基1100的比例转接入两个装有100ml1#培养基的250ml三角瓶中，其中两瓶培养基中的六价铬浓度分别为100mg/L和200mg/L，在好氧、常压、30℃条件下将其置于200转/分钟摇床中振荡培养，实时监测不同培养时间下的六价铬浓度。培养72小时后，初始六价铬浓度为100mg/L的培养基中六价铬浓度下降至25.3mg/L，以后随着培养时间的延长六价铬浓度不再下降；培养96小时后，初始六价铬浓度为200mg/L的培养基中六价铬浓度下降至75.4mg/L，以后随着培养时间的延长六价铬浓度不再下降。无论六价铬浓度为100mg/L或是200mg/L苍白杆菌CTS-325都不能将六价铬彻底还原，在随着时间的推移六价铬浓度不再下降，还原进入停滞期。如表1所示 表1 CTS-325在1#培养基中，苍白杆菌还原六价铬浓度—时间变化表
实例3.苍白杆菌CTS-325在优化的1#培养基中还原六价铬的情况 为了解决苍白杆菌CTS-325在1#培养基中不能彻底还原六价铬的问题，我们对1#培养基进行了优化。通过向1#培养基中添加木糖或者蔗糖或者生产木糖和蔗糖剩余的甘蔗渣等，结果发现苍白杆菌CTS-325在优化后的1#培养基中还原六价铬效果得到明显改善，并且在初始六价铬浓度分别为100mg/L和200mg/L的情况下均能彻底还原六价铬。
3.1菌种的复苏 取液氮保藏的种子菌，按1100比例接入装有20ml1#液体培养基(pH 7～8)的100ml三角瓶中，在好氧、常压、30℃条件下将其置于200转/分钟摇床中振荡培养过夜使菌种复苏。
3.2苍白杆菌CTS-325在优化的1#培养基中还原六价铬的情况 将复苏后的菌种按照菌液与培养基1100的比例转接入两个装有100ml1#培养基的250ml三角瓶中。优化的培养基分别为①1#培养基(含1％木糖)；②1#培养基(含1％蔗糖)；③1#培养基(含2％甘蔗渣)，在每种培养基中分别添加浓度为100mg/L和200mg/L的六价铬。培养条件为好氧、常压、30℃，于200转/分钟摇床中振荡培养，实时监测不同培养时间下的六价铬浓度。实验结果表明
在三种优化后的1#培养基中苍白杆菌CTS-325均能将不同浓度的初始六价铬彻底还原，达到排放标准。具体数据如表2、3、4所示 表2 1#培养基(含1％木塘)中，苍白杆菌CTS-325还原六价铬浓度-时间变化表
表3 1#培养基(含1％蔗糖)中，苍白杆菌CTS-325还原六价铬浓度—时间变化表
表4 1#培养基(含2％甘蔗渣)中，苍白杆菌CTS-325还原六价铬浓度—时间变化表
实例4不同糖类物质对苍白杆菌CTS-325在1#培养基中还原六价铬的影响 如前所述，在初始六价铬浓度为100mg/ml的1#培养基中，苍白杆菌CTS-325不能彻底还原六价铬，并在68小时后达到平台期；而当我们在1#培养基中分别加入1％木糖或蔗糖时，苍白杆菌CTS-325可以彻底还原六价铬。为了进一步研究糖类对苍白杆菌CTS-325在1#培养基中还原六价铬的影响，在初始六价铬浓度为100mg/ml，培养68小时后，分别在培养基中加入D-核糖，D-木糖，D-果糖，D-甘露糖，D-半乳糖，D-葡萄糖，乳糖，麦芽糖，蔗糖，甘油，D-甘露醇和淀粉。试验结果表明除乳糖外，其余糖类物质均可以促进该菌彻底还原六价铬。具体数据见表5、6、7及图3、4、5、6。
表5 68小时后，1#培养基中分别加入1％的D-核糖，D-木糖，D-果糖，D-甘露糖，D-半乳糖，D-葡萄糖，苍白杆菌CTS-325还原六价铬浓度—时间变化表
表6 68小时后，1#培养基中分别加入1％乳糖，麦芽糖，蔗糖，苍白杆菌CTS-325还原六价铬浓度—时间变化表
表7 68小时后，1#培养基中分别加入1％甘油，D-甘露醇，苍白杆菌CTS-325还原六价铬浓度—时间变化表
表8 68小时后，1#培养基中加入1％淀粉，苍白杆菌CTS-325还原六价铬浓度—时间变化表
实例5.利用苍白杆菌CTS-325处理福建榕屏联营化工有限公司铬渣浸出液 为了在实际应用中降低培养基的成本，我们在实际处理含六价铬废液中选用甘蔗渣作为优化1#培养基的主要原料。利用优化后的培养基对福建榕屏联营化工有限公司铬渣浸出液进行了处理，铬渣浸出液中六价铬的浓度为254.8mg/L，经苍白杆菌CTS-325处理72小时后，六价铬浓度可基本被还原，达到污水排放标准。
5.1种子菌的扩大培养 取出液氮保藏的种子菌苍白杆菌CTS-325，按1100接入1#液体培养基，30℃条件下200rpm振荡培养到OD600约为0.6时，即可用于含铬废水处理。
5.2工业废水处理过程 将工业铬渣浸出液(废水中六价铬含量为254.8mg/L，调pH值至7.5)与1#培养基按体积比1:1混合后，加入经扩大培养的种子菌液，按10％的接种量接种于生化处理池中，然后投入2％的甘蔗渣，混合液在30℃条件下进行搅拌处理，实时监测反应不同时间的六价铬浓度，96小时后，测得六价铬完全被还原。具体数据如表9所示 表9 优化后的培养基中，苍白杆菌CTS-325对铬渣浸出液还原时间表
权利要求
1.苍白杆菌CTS-325(Ochrobactrum sp.CTS-325)(保藏号为CGMCC1715)。
2.权利要求1的苍白杆菌CTS-325在还原六价铬的应用。
3.如权利要求2所述的苍白杆菌CTS-325在还原六价铬的应用，其特征在于在该菌株还原六价铬的过程中pH值为7-9。
4.如权利要求2所述的苍白杆菌CTS-325在还原六价铬的应用，其特征在于该菌株在微生物学上可选用的培养基中包含木糖、核糖、葡萄糖、果糖、半乳糖、蔗糖、麦芽糖、淀粉、甘油或者甘露醇中的一种或其中任意几种的组合。
5.如权利要求2所述的苍白杆菌CTS-325在还原六价铬的应用，其特征在于所述的培养基中包含木糖或蔗糖。
全文摘要
苍白杆菌CTS-325及其培养方法以及还原六价铬的应用，涉及微生物及其在有氧条件下高效彻底还原六价铬的应用及其培养方法。本发明提供的苍白杆菌CTS-325(Ochrobactrum sp.CTS-325)(保藏号为CGMCC1715)。该菌株能高效彻底还原六价铬。在该菌株还原六价铬的过程中pH值为7-9。该菌株在微生物学上可选用的培养基中包含木糖、核糖、葡萄糖、果糖、半乳糖、蔗糖、麦芽糖、淀粉、甘油或者甘露醇中的一种或其中任意几种的组合。我们用苍白杆菌CTS-325在优化的培养基中处理含铬工业废水和铬渣浸出液，其中的六价铬均能被还原达到污水排放标准。
文档编号C12N1/20GK101418266SQ20071000969
公开日2009年4月29日 申请日期2007年10月23日 优先权日2007年10月23日
发明者璋 林, 马晓艳, 程扬健, 斌 栗, 廖逸群, 吴兆贤 申请人:中国科学院福建物质结构研究所