专利名称：：一种利用silac标记大肠杆菌蛋白质组的方法及其专用培养基的制作方法
技术领域：
：本发明涉及生物
技术领域：
，尤其涉及一种利用SILAC标记大肠杆菌蛋白质组的方法及其专用培养基。
背景技术：
：大肠杆菌是大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)的简称，因1885年被TheodorEscherich发现而得名。大肠杆菌属细菌界(Bacteria)、变形菌门(Proteobacteria)、Y_变形菌纲(Gammaproteobacteria)、肠杆菌目(Enterobacteriales)、肠杆菌科(Enterobacteriaceae)、埃希氏菌属(Escherichia)的大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)，是革兰氏阴性短杆菌，大小0.5X13微米，周身鞭毛，能运动，无芽孢。大肠杆菌在自然界广泛分布，也是人和许多动物肠道中最主要且数量最多的一种细菌，主要寄生在大肠内，大多数不致病，与人终身相伴。其代谢活动能抑制肠道内分解蛋白质的微生物生长，减少蛋白质分解产物对人体的危害，还能合成维生素B和K，并产生有杀菌作用的大肠杆菌素，惠及其寄生的宿主。由于菌体繁殖迅速，易培养，价廉，易变异且易被检出等诸多优点，大肠杆菌已经成为现代生物学中研究最多的一种模式生物。由于其结构简单，大肠杆菌被广泛用于生物化学、遗传学、分子生物学和代谢途径的研究，以揭示生命的奥秘。大肠杆菌对于分子遗传学的建立和发展以及生物工程的兴起均发挥了重要作用。Cohen和Boyer于1973年在大肠杆菌中创造了重组DNA技术，开创了基因工程研究的先河，使得该菌成为代谢途径和生物机制研究最透彻的微生物之一。由于遗传背景清楚、载体和受体系统完备、技术操作简单、生长迅速、培养简单、重组子稳定和大规模发酵便宜等优点，使得大肠杆菌成为基因工程研究中最主要的原核受体菌，广泛应用于外源DNA的克隆和扩增、原核基因高效表达和基因文库构建等基础研究。用大肠杆菌生产的人生长激素、生长激素释放抑制因子、胰岛素等均已经取得了成功，并成功地实现了产业化，创造了巨大的产业价值。尽管大肠杆菌具有诸多优点，但也给人类带来了诸多麻烦，如果控制不当，还可能引起突发事件。作为条件致病菌，在肠道中的大肠杆菌一旦离开肠道进入胆囊、尿道、膀胱、阑尾等，可引起炎症反应。当细菌由于如溃疡等因素导致的穿孔而进入腹腔时，通常会导致致命性的腹膜炎症感染。大肠杆菌的某些菌株本身还具有毒性(其中一些类似导致痢疾的毒素)，可以导致食物中毒，使得细胞脱水引起腹泻等，并可引发群体的急性感染，如1996年5-8月份日本的0157H7大肠杆菌引起的疫情，波及9000多人。不仅如此，由于许多大肠杆菌可在菌体死亡溶解后产生内毒素，对机体产生强烈的毒性，可引起宿主发热、毒血症、败血症、心包炎、肝周炎、气囊炎、输卵管炎、肾炎等严重疾患，甚至休克死亡，使得大肠杆菌所致疾病的治疗更为复杂。而抗药性基因的衍变以及在菌株间的广泛传播，使得耐药菌泛滥成灾，难治愈，死亡率高并且极易复发，这已经成为人类临床治疗的重大难题和养禽业的重大威胁，困扰和阻滞了养殖业的发展。因此，耐药基因及其质粒在大肠杆菌菌株间的转殖、衍变和耐药菌的产生、发展的系统生物学探索也同样具有重要的生物医学研究价值。蛋白质是基因功能的直接执行者，且相互关联，共同执行细胞复杂的生命活动过程。蛋白质组学是系统鉴定和定量细胞内蛋白质，并研究其功能的新兴学科。大肠杆菌的蛋白质组学研究，特别是定量蛋白质组学研究可以发现、鉴别基因差异和生物学处理的效应，揭示其分子调控网络及其分子机制。但由于技术的限制，早期大肠杆菌组学水平的蛋白质鉴定主要依靠双向凝胶电泳，难于分清所有的蛋白质及其量的变化。近来，基于液相色谱-质谱联用技术为简单蛋白质组的高覆盖奠定了技术基础。由于质谱本身并不是好的定量工具，定量蛋白质组学研究需要定量标准。目前基于细胞培养过程中的重稳定性同位素标记氨基酸的整体蛋白质组标记技术(stableisotopelabelingbyaminoacidincellculture,SILAC)已经成为定量蛋白质组学研究的金标准。Krijgsveld等在进行15N标记的线虫定量蛋白质组学研究时利用15N标记的铵盐作为唯一氮源培养大肠杆菌，这种培养基不但价格昂贵，难以达到高水平标记，并且对数据处理要求较高。丁琢等利用哺乳动物细胞的SILAC培养基培养大肠杆菌，用于制备目标导向蛋白质组学研究用的重稳定性同位素标记肽段。但这种标记方法使用哺乳动物细胞的培养基，完全改变了普通的大肠杆菌培养基组成和特性，无法研究大肠杆菌的正常发酵条件，且价格昂贵。Carroll等利用M9盐基础培养基制备目标导向蛋白质组学研究用的重稳定性同位素标记肽段，尽管也获得了单个目的蛋白的较高的标记效率，但生长缓慢，也没有对标记过程进行有效监测，难于应用于定量蛋白质组学研究。由于缺乏有效的标记方法，至今还没有大肠杆菌高效SILAC培养基的问世和大规模定量蛋白质组学研究论文的发表，阻碍了大肠杆菌定量蛋白质组学研究的进展及其在发酵产业、基础医学研究中作用的发挥。
发明内容本发明的一个目的是提供一种SILAC标记大肠杆菌专用培养基。本发明提供的专用培养基，包括无机盐、组氨酸盐酸盐、异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、丝氨酸、重稳定性同位素标记赖氨酸、精氨酸、苏氨酸、酪氨酸、蛋氨酸、腺嘌呤硫酸盐、尿嘧啶、盐酸噻胺和葡萄糖；所述无机盐为Na2HPO412H20、KH2PO4,NaCUMgSO4,NH4Cl和CaCl2。上述培养基中，所述组氨酸盐酸盐为L-组氨酸盐酸盐；所述异亮氨酸为L-异亮氨酸；所述缬氨酸为L-缬氨酸；所述亮氨酸为L-亮氨酸；所述苯丙氨酸为L-苯丙氨酸；所述色氨酸为L-色氨酸；所述丝氨酸为L-丝氨酸；所述重稳定性同位素标记赖氨酸为重稳定性同位素标记L-赖氨酸；所述精氨酸为L-精氨酸；所述苏氨酸为L-苏氨酸；所述酪氨酸为L-酪氨酸；所述蛋氨酸为L-蛋氨酸。上述培养基中，所述Na2HPO412H20、所述KH2P04、所述NaCl、所述MgS04、所述NH4C1、所述CaCl2、所述盐酸噻胺、所述葡萄糖、所述L-组氨酸盐酸盐、所述L-异亮氨酸、所述L-缬氨酸、所述L-亮氨酸、所述L-苯丙氨酸、所述L-色氨酸、所述L-丝氨酸、所述重稳定性同位素标记L-赖氨酸、所述L-精氨酸、所述L-苏氨酸、所述L-酪氨酸、所述L-蛋氨酸、所述腺嘌呤硫酸盐和所述尿嘧啶的质量比为17100:3000:580:120:100011110000:203015030:50:20:400:30:100:200:30:20:20:20。上述培养基还包括水；所述培养基由所述Na2HPO412H20、所述KH2PO4、所述NaCl、所述MgSO4、所述NH4C1、所述CaCl2、所述盐酸噻胺、所述葡萄糖、所述L-组氨酸盐酸盐、所述L-异亮氨酸、所述L-缬氨酸、所述L-亮氨酸、所述L-苯丙氨酸、所述L-色氨酸、所述L-丝氨酸、所述重稳定性同位素标记L-赖氨酸、所述L-精氨酸、所述L-苏氨酸、所述L-酪氨酸、所述L-蛋氨酸、所述腺嘌呤硫酸盐、所述尿喃唳和水组成。上述培养基中，所述Na2HPO412H20在所述培养基中的终浓度为17100mg/L；所述KH2PO4在所述培养基中的终浓度为3000mg/L；所述NaCl在所述培养基中的终浓度为580mg/L；所述MgSO4在所述培养基中的终浓度为120mg/L；所述NH4Cl在所述培养基中的终浓度为1000mg/L；所述CaCl2在所述培养基中的终浓度为Ilmg/L；所述葡萄糖在所述培养基中的终浓度为10000mg/L;所述盐酸噻胺在所述培养基中的终浓度为lmg/L；所述L-组氨酸盐酸盐在所述培养基中的终浓度为20mg/L；所述L-异亮氨酸在所述培养基中的终浓度为30mg/L；所述L-缬氨酸在所述培养基中的终浓度为150mg/L；所述L-亮氨酸在所述培养基中的终浓度为30mg/L；所述L-苯丙氨酸在所述培养基中的终浓度为50mg/L；所述L-色氨酸在所述培养基中的终浓度为20mg/L；所述L-丝氨酸在所述培养基中的终浓度为400mg/L；所述重稳定性同位素标记L-赖氨酸在所述培养基中的终浓度为30mg/L；所述L-精氨酸在所述培养基中的终浓度为100mg/L；所述L-苏氨酸在所述培养基中的终浓度为200mg/L；所述L-酪氨酸在所述培养基中的终浓度为30mg/L；所述L-蛋氨酸在所述培养基中的终浓度为20mg/L；所述腺嘌呤硫酸盐在所述培养基中的终浓度为20mg/L；所述尿嘧啶在所述培养基中的终浓度为20mg/L。上述培养基中，所述重稳定性同位素标记L-赖氨酸为L-Iysine-13C6或L-Iysine-13C615N20本发明的另一个目的是提供一种制备上述的专用培养基的方法，包括如下步骤按照所述终浓度将所述Na2HPO412H20、所述KH2PO4、所述NaCl、所述MgSO4、所述NH4Cl、所述CaCl2、所述L-组氨酸盐酸盐、所述L-异亮氨酸、所述L-缬氨酸、所述L-亮氨酸、所述L-苯丙氨酸、所述L-色氨酸、所述L-丝氨酸、所述重稳定性同位素标记L-赖氨酸、所述L-精氨酸、所述L-苏氨酸、所述L-酪氨酸、所述L-蛋氨酸、所述腺嘌呤硫酸盐、所述尿嘧啶、所述盐酸噻胺、所述葡萄糖和水混合，得到培养基。上述的培养基在SILAC标记大肠杆菌蛋白质组中的应用也是本发明保护的范围。本发明的第三个目的是提供一种SILAC标记大肠杆菌蛋白质组的方法。本发明提供的方法，为将大肠杆菌在上述的培养基中培养，实现SILAC标记大肠杆菌蛋白质组。上述方法中，所述培养的方式为37°C培养7-12代。本发明的实验证明，本发明开发的一种SILAC标记大肠杆菌专用培养基，可以专门用于SILAC标记大肠杆菌蛋白质组，不仅省却了营养缺陷型构筑的繁琐步骤和遗传条件限制，而且可以实现快速、闻效地标记，为定量内标的制备和闻效精确地定量蛋白质组研究创造了条件。图I为SILAC标记的大肠杆菌蛋白的色谱-质谱联用结果2为SILAC标记的大肠杆菌蛋白的标记效率测试结果图具体实施方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。本发明可以通过以下实例更容易地理解，但本发明并不仅限于这些实例。实施例I、SILAC标记大肠杆菌专用培养基表I为SILAC标记大肠杆菌专用培养基组分权利要求1.一种SILAC标记大肠杆菌专用培养基，包括无机盐、组氨酸盐酸盐、异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、丝氨酸、重稳定性同位素标记赖氨酸、精氨酸、苏氨酸、酪氨酸、蛋氨酸、腺嘌呤硫酸盐、尿嘧啶、盐酸噻胺和葡萄糖；所述无机盐为Na2HPO412H20、KH2PO4,NaCUMgSO4,NH4Cl和CaCl2。2.根据权利要求I所述的培养基，其特征在于所述组氨酸盐酸盐为L-组氨酸盐酸盐；所述异亮氨酸为L-异亮氨酸；所述缬氨酸为L-缬氨酸；所述亮氨酸为L-亮氨酸；所述苯丙氨酸为L-苯丙氨酸；所述色氨酸为L-色氨酸；所述丝氨酸为L-丝氨酸；所述重稳定性同位素标记赖氨酸为重稳定性同位素标记L-赖氨酸；所述精氨酸为L-精氨酸；所述苏氨酸为L-苏氨酸；所述酪氨酸为L-酪氨酸；所述蛋氨酸为L-蛋氨酸。3.根据权利要求2所述的培养基，其特征在于所述Na2HPO412H20、所述KH2PO4、所述NaCl、所述MgSO4、所述NH4C1、所述CaCl2、所述盐酸噻胺、所述葡萄糖、所述L-组氨酸盐酸盐、所述L-异亮氨酸、所述L-缬氨酸、所述L-亮氨酸、所述L-苯丙氨酸、所述L-色氨酸、所述L-丝氨酸、所述重稳定性同位素标记L-赖氨酸、所述L-精氨酸、所述L-苏氨酸、所述L-酪氨酸、所述L-蛋氨酸、所述腺嘌呤硫酸盐和所述尿嘧啶的质量比为17100:3000:580:120:1000111:10000:20:30:150:30:502040030100200:30:20:20:20。4.根据权利要求2或3所述的培养基，其特征在于所述培养基还包括水；所述培养基由所述Na2HPO412H20、所述KH2PO4、所述NaCl、所述MgSO4、所述NH4C1、所述CaCl2、所述盐酸噻胺、所述葡萄糖、所述L-组氨酸盐酸盐、所述L-异亮氨酸、所述L-缬氨酸、所述L-亮氨酸、所述L-苯丙氨酸、所述L-色氨酸、所述L-丝氨酸、所述重稳定性同位素标记L-赖氨酸、所述L-精氨酸、所述L-苏氨酸、所述L-酪氨酸、所述L-蛋氨酸、所述腺嘌呤硫酸盐、所述尿嘧啶和水组成。5.根据权利要求2-4中任一所述的培养基,其特征在于所述Na2HPO412H20在所述培养基中的终浓度为17100mg/L；所述KH2PO4在所述培养基中的终浓度为3000mg/L；所述NaCl在所述培养基中的终浓度为580mg/L；所述MgSO4在所述培养基中的终浓度为120mg/L；所述NH4Cl在所述培养基中的终浓度为1000mg/L；所述CaCl2在所述培养基中的终浓度为llmg/L；所述葡萄糖在所述培养基中的终浓度为10000mg/L；所述盐酸噻胺在所述培养基中的终浓度为lmg/L；所述L-组氨酸盐酸盐在所述培养基中的终浓度为20mg/L；所述L-异亮氨酸在所述培养基中的终浓度为30mg/L；所述L-缬氨酸在所述培养基中的终浓度为150mg/L；所述L-亮氨酸在所述培养基中的终浓度为30mg/L；所述L-苯丙氨酸在所述培养基中的终浓度为50mg/L；所述L-色氨酸在所述培养基中的终浓度为20mg/L；所述L-丝氨酸在所述培养基中的终浓度为400mg/L；所述重稳定性同位素标记L-赖氨酸在所述培养基中的终浓度为30mg/L；所述L-精氨酸在所述培养基中的终浓度为100mg/L；所述L-苏氨酸在所述培养基中的终浓度为200mg/L；所述L-酪氨酸在所述培养基中的终浓度为30mg/L；所述L-蛋氨酸在所述培养基中的终浓度为20mg/L；所述腺嘌呤硫酸盐在所述培养基中的终浓度为20mg/L；所述尿嘧啶在所述培养基中的终浓度为20mg/L。6.根据权利要求1-5中任一所述的培养基,其特征在于所述重稳定性同位素标记L-赖氨酸为L-Iysine-13C6或L_lysine-13C615N2。7.一种制备权利要求2-6中任一所述的专用培养基的方法，包括如下步骤按照所述终浓度将所述Na2HPO412H20、所述KH2PO4、所述NaCl、所述MgSO4、所述NH4C1、所述CaCl2、所述L-组氨酸盐酸盐、所述L-异亮氨酸、所述L-缬氨酸、所述L-亮氨酸、所述L-苯丙氨酸、所述L-色氨酸、所述L-丝氨酸、所述重稳定性同位素标记L-赖氨酸、所述L-精氨酸、所述L-苏氨酸、所述L-酪氨酸、所述L-蛋氨酸、所述腺嘌呤硫酸盐、所述尿嘧啶、所述盐酸噻胺、所述葡萄糖和水混合，得到培养基。8.权利要求1-6所述的专用培养基在SILAC标记大肠杆菌蛋白质组中的应用。9.一种SILAC标记大肠杆菌蛋白质组的方法，为将大肠杆菌在权利要求1-6所述的专用培养基中培养，实现SILAC标记大肠杆菌蛋白质组。10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于所述培养的方式为37°C培养7-12代。全文摘要本发明公开了一种利用SILAC标记大肠杆菌蛋白质组的方法及其专用培养基。本发明提供一种SILAC标记大肠杆菌专用培养基，包括无机盐、组氨酸盐酸盐、异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、丝氨酸、重稳定性同位素标记赖氨酸、精氨酸、苏氨酸、酪氨酸、蛋氨酸、腺嘌呤硫酸盐、尿嘧啶、盐酸噻胺和葡萄糖；所述无机盐为Na2HPO4·12H2O、KH2PO4、NaCl、MgSO4、NH4Cl和CaCl2。本发明的实验证明，本发明开发的一种SILAC标记大肠杆菌专用培养基，为标记大肠杆菌蛋白质组、定量内标的制备和高精度地定量蛋白质组研究创造了条件。文档编号C12N1/20GK102796682SQ201210276080公开日2012年11月28日申请日期2012年8月3日优先权日2012年8月3日发明者徐平,平灵艳,杨大福,常蕾申请人:中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所