生产番茄红素的改良方法,获得的番茄红素的制剂和应用的制作方法

专利名称：生产番茄红素的改良方法,获得的番茄红素的制剂和应用的制作方法
技术领域：
使用本发明所述选择的三孢布拉霉(Blakeslea trispora)菌株的发酵方法可以实现高于当前所述那些的番茄红素生产水平。分离，纯化和配制的方法可适用于任何天然来源的番茄红素，特别是布拉霉属(Blakeslea)，笄霉属(Choanephora)，须霉属(Phycomyces)或毛霉属(Mucor)的毛霉真菌的浸没培养物。相对于先前所述方法，该提取方法提供回收过程的简化和产品纯度的提高。因为它们可以获得直接应用于食物和药品领域的稳定的番茄红素制剂，配制方法提供了高的附加值。
背景技术：
类葫萝卜素广泛分别于自然界中，其将它们的特征颜色，从黄色到暗红色赋予许多天然物质，如胡萝卜，胡椒，番茄，花或某些微生物，包括一些细菌，真菌和光合成生物。类胡萝卜素可以分成两类(i)称为胡萝卜素的纯烃类，包括化合物如β-胡萝卜素，α-胡萝卜素，γ-胡萝卜素或番茄红素，和(ii)称为叶黄素的分子，其含有各种形式的氧(羟基，环氧基等)，包括虾青素，玉米黄质，辣椒红，鸡油菌素(cantaxanthin)，黄体素等。两组化合物在它们的物化性质和在有机溶剂中的溶解度方面显示不同性质。所有这些化合物在人的饮食中起重要作用，已经深入研究它们作为抗氧化剂用于预防癌症和其它人类疾病以及作为维生素A前体的性质。最近已经在大鼠中证明番茄红素抑制次氮基乙酸铁对DNA的有害影响，并且防止肝脏坏死[Matos H.R.等，(2001)Arch.Biochem.Biophys.396卷]。另外，由于它们从黄色到红色的颜色，类胡萝卜素作为着色剂和食品添加剂具有重要商业价值，因为它们对健康的有益效果和它们有吸引力的颜色[Ninet L.和Renaut J.(1979)在Peppler HJ.，Perlman D.(编辑)Microbial Technology，第二版，卷1，Academic Press，NY，529-544页]。
番茄红素(C40H56)是β-胡萝卜素和叶黄素生物合成途径中的中间体。它具有536.85的分子量和下列分子式 番茄红素番茄红素除了作为抗氧化剂，番茄红素还防止心血管病和某些类型的癌症，并在生长控制中起作用[Giovannucci等(1995)J.Nat.Cancer Inst.871767-1776；Stahl W.和Sies，H.(1996)Arch.Biochem.Biophys.3361-9；Clinton，SK.(1998)Nutr.Rev.5635-51]。这已经导致消费者方面增大的需求。作为高纯度化合物的番茄红素的生产在过去已经联系到化学合成[US5208381；US 5166445；US 4105855；US 2842599]。然而，现在存在备选的途径，其基于天然来源的番茄红素的来源和特殊的提取方法。
通过微生物生物合成的类胡萝卜素的生产是化学和生物方法之间竞争的经典实例。生物来源的番茄红素制剂是从番茄获得[PCT WO 97/48287，EP 608027]或通过须霉属，布拉霉属和笄霉属的毛霉真菌的发酵获得[GB1008469，US 3097146，US 3369974，JP 73016189，JP 73016190，RU2102416，WO 00/77234]。为了用三孢布拉霉获得最大产率的类胡萝卜素，必须一起发酵(+)和(-)菌株[Ciegler，A.(1965)Advances in AppliedMicrobiology 71-34；Plempel，M.(1965)Planta 65225-231；Sutter，RP.和Rafelson，ME.(1968)J.Bacteriology 95426-432]。在混合培养物中类胡萝卜素产率的增加与一类称为β因子或三孢酸的酸化合物的生产相关[WO00/77234，Caglioti L.等(1966)Tetrahedron Supplement 7175-187]。对于三孢酸的生物合成，由(+)和(-)菌株生产的β-胡萝卜素被两者代谢成视黄醛和随后代谢成4-二氢三孢醇。(+)菌株利用4-二氢三孢醇作为底物形成二氢三孢酸和它的甲酯(4-二氢三孢酸甲酯)。对于它的部分，(-)菌株将4-二氢三孢醇代谢成三孢醇。最后，(-)菌株将4-二氢三孢酸甲酯转化成三孢酸，(+)菌株将三孢醇转化成三孢酸。三孢酸生物合成的这种描述是一种简化，因为在该过程中产生许多共代谢物(co-metabolites)，其中一些对于(+)和(-)菌株两者是共同的，但其它对于它们之一是特异性的。这些共代谢物的相对数量根据菌株而变化。
已经在与三孢布拉霉种系发生相关的真菌如布拉克须霉(Phycomycesblakesleeanus)和卷枝毛霉(Mucor circinelloides)中描述β-胡萝卜素的生物合成途径(参见流程1)[Arrach N.等，(2001)Proceedings of the NationalAcademy of Sciences USA 981687-1692；Velayos A.等(2000)EuropeanJournal of Biochemistry 2675509-5519]。所述生物合成需要至少三种酶(i)八氢番茄红素合成酶，其将两分子的香叶基香叶基焦磷酸(geranylgeranyl pyrophosphate)结合形成八氢番茄红素，(ii)八氢番茄红素脱氢酶，其将四个双键引入八氢番茄红素分子而合成番茄红素，和(iii)番茄红素环化酶，其使用番茄红素作为底物，形成位于β-胡萝卜素分子的两个末端的环。基于三孢布拉霉突变株的分析得出结论，在该真菌中的β-胡萝卜素的生物合成途径类似于关于布拉克须霉的描述[Metha B.J.和Cerdá-Olmedo E.(1995)Applied Microbiology and Biotechnology 42836-838]。在布拉克须霉的情形中，通过突变可以改变它菌丝体的黄色，产生菌丝体为红色，白色或各种梯度黄色的菌株。红色突变株累积番茄红素，而白色突变株缺乏类胡罗卜素的生产或累积八氢番茄红素。为了生产番茄红素，需要拥有缺少番茄红素环化酶活性的三孢布拉霉菌株，或备选地必须将抑制所述酶促活性的化学品加入发酵培养基。
流程1专利GB 1008469，US 3097146，US 3369974，JP 73016189，JP73016190，RU 2102416和WO 00/77234描述通过发酵如须霉属(Phycomyces)，布拉霉属和笄霉属(Choanephora)的毛霉真菌生产番茄红素。专利GB 1008469和US 3097146描述基于将pH控制在7.0和9.5的值之间的三孢布拉霉的发酵方法，在发酵7天后获得99.7mg/l番茄红素的产率。专利JP 73016189和JP 73016190描述基于加入叔胺用毛霉真菌生产番茄红素的方法。专利RU 2102416描述加入氨甲基吡啶和烟草残渣以诱导番茄红素累积。除了在所述专利中描述的物质以外，已经公开了使用其它氮化的杂环碱用于在番茄红素水平上阻断类胡萝卜素的合成尼古丁[JP09313167]，咪唑，吡啶，吗啉，喹啉和一些取代的衍生物[US 3369974；Ninet L.，Renaut J.(1979)在Peppler HJ，Perlman D(编辑).MicrobialTechnology，第二版，卷1，Academic Press，NY，529-544页]。此外，已经描述无需加入叔胺而累积番茄红素的三孢布拉霉突变株[Mehta B.J.和Cerdá-Olmedo E.(1995)Appl.Microbiol.Biotechnol.42836-838]。
除了上述毛霉真菌以外，已经描述使用藻类生产番茄红素[JP 09313167和JP 2000152778]，通过发酵冠霉素链霉菌rubescens变种(Streptomyceschrestomyceticus var.rubescens)[US 3467579]，和通过修饰黄杆菌属物种(Flavobacterium sp.)R1534的类胡萝卜素的生物合成途径[US 6124113]来生产番茄红素。
可以从植物产品如番茄，胡萝卜，胡椒，植物油等获得番茄红素。因此，WO 97/48287描述从番茄制备富含番茄红素的含油树脂的方法，其通过压榨番茄直至获得果肉，用有机溶剂从果肉中提取番茄红素和随后通过蒸发去除溶剂，产生番茄红素含量为2-10％的含油树脂。从植物和油中获得富含一般类胡萝卜素和尤其是番茄红素的含油树脂的类似方法在各种专利中描述，如在US 5245095和EP 580745中，通过用钙盐沉淀，在US 5019668中，使用用油的反式酯化和接着蒸馏的方法，在WO 95/16363中，描述将番茄分级分离成包括富含类胡萝卜素的含油树脂的各种级分，在PCT WO 90/08584中，描述通过使用超临界状态的流体提取番茄红素，尽管获得的提取物是各种类胡萝卜素的混合物并且由于它们的低溶解度提取率极低。
在所有这些情形中，由于番茄红素在这些天然产物中的低浓度和该化合物在某些细胞器如叶绿体或有色体中的胞内定位，获得的产物的提取率和纯度低，获得富含番茄红素或脱氢的粗制产物的含油树脂以及变化量的其它类胡萝卜素或非类胡萝卜素化合物。在大多数情形中，所述提取方法要求通过研磨或压榨制备果实，以易于溶剂的提取和因此释放富含番茄红素的胞内内含物。最后，大多数在这些专利中的所述方法要求使用有机溶剂，其在获得的含油树脂中以痕量存在。另外，专利IL 107999描述从番茄果肉中制备极富含番茄红素的含油树脂，尽管如上所述，获得的产物不是由高纯度的番茄红素晶体组成，而是由富含番茄红素的类脂浓缩物组成。
在另一方面，专利WO 97/15554描述从胡萝卜和番茄中提取植物来源的类胡萝卜素，包括番茄红素，其是通过分离叶绿体和有色体，接着用蛋白质水解酶如果胶和/或蛋白酶消化所述细胞器，可以释放与各种结构蛋白质结合的番茄红素。通过随后碱处理和用低分子量的醇混合物提取，可以获得丰度和纯度大于含油树脂的番茄红素提取物，尽管没有获得番茄红素的纯化晶体，但是获得富含番茄红素的粗提取物。类似地，在专利EP608027 A2中通过分离其中番茄红素以晶形存在的番茄有色体，获得番茄红素的浓缩提取物。这些来自富含番茄红素的番茄有色体的提取物直接用作着色剂而没有随后提取番茄红素晶体，避免在提取过程中番茄红素的颜色变化，使无需使用有机溶剂。按照该专利所述方法，不能获得适用于食物或药物组合物的纯的晶形番茄红素，而只能获得脱水的，冷冻干燥或冷冻形式的食品着色剂。
某些富含类胡萝卜素的杜氏藻类(Dunaliella)微藻是番茄红素的另一重要来源。存在各种从这些生物中提取类胡萝卜素和特别是番茄红素的方法，如在专利US 5378369，US 4713398和US 4680314中所反映的，其通过用有机溶剂(含氯烃，烃等)或食用油(DE 4342798)提取。在PCTWO98/08584中描述一种不同的方法，其中使用超临界状态的CO2获得番茄红素提取物，尽管如此获得的提取物番茄红素的纯度低。
还可以通过在液体培养基中发酵从某些毛霉真菌如布拉霉属，笄霉属，须霉属或毛霉属中获得番茄红素，其提供作为对从植物产物或藻类中生产番茄红素的一个优势的该化合物增加的浓度，在一些情形中高于相对于干生物量数量的5重量％，该浓度高于从最好的植物品种所获得的那些，并且可以通过传统的诱变技术或通过应用允许遗传操作这些微生物的新的分子生物学技术，用生物技术可开发这些微生物的过量生产的菌株，增加番茄红素的浓度和产率，消除其它结构相关的类胡萝卜素的生产。
如已经提及的，从天然来源制备高纯度的晶体番茄红素通常要求用有机溶剂或超临界状态的流体提取的步骤和然后各种附加的纯化步骤如层析，吸收和洗脱的过程和沉淀或结晶的步骤，如例如在专利US 3369974，EB 818255和EP 242148中所述。在其中不使用这些随后的纯化步骤和通过蒸发溶剂直至克服溶解度来直接从提取物进行结晶的大多数情形中，获得的产物的纯度极低，随后需要进行获得的番茄红素的再结晶过程，具有增加的困难即产物的低溶解度意味着必须使用大量的溶剂以完成再结晶步骤，其又导致低产率(NL 6411184，US 4439629)。
专利申请WO 96/13178描述制备稳定的晶体番茄红素的浓缩物，其在番茄红素不溶解的食品相容的液体介质如乙二醇，乙醇或甘油中，其是通过研磨悬浮在液体介质中的小晶体(1-3微米)番茄红素而获得。此外，专利申请WO 98/43620描述从含油树脂中分离番茄红素晶体的方法，其是通过在高温下皂化各种甘油三酯和膦酸酯和然后用水稀释，获得纯度为75％-95％的番茄红素晶体。尽管还未描述它在获得高纯度的番茄红素晶体中的应用，最近在PCT WO 98/03480中描述了类似的方法用于制备高纯度的β-胡萝卜素晶体，其是通过用水，低分子量醇或丙酮洗涤进行。
晶形类胡萝卜素的不稳定性是众所周知的，稳定它们的一种方法是制备油分散体。此外，认为分散在油中的类胡萝卜素更容易被身体所吸收。稳定不稳定化合物的备选方法是它们在淀粉基体中的微囊包封。因此，专利US 2876160，US 2827452，US 4276312和US 5976575描述通过将它们包裹在淀粉基体中，包括类胡萝卜素的各种化合物的稳定性显著增加。
在着色剂领域中使用类胡萝卜素的主要困难之一是它们在水中的零溶解度，因为它们的许多应用发生在水性介质中。这个溶解度问题在文献US 3998753中提及，并通过制备类胡萝卜素在挥发性有机溶剂如卤代烃中的溶液，和用十二烷基硫酸钠水溶液将它们乳化来解决。
专利US 5364563描述制备类胡萝卜素粉末形式的制剂的方法，其包括在具有高沸点的油中形成类胡萝卜素的混悬液。用蒸汽将混悬液过热30秒的最长时期，以便形成类胡萝卜素的油溶液。接下来，用胶体水溶液乳化该溶液，然后将乳剂喷雾干燥。
发明详述本发明描述一系列使用真菌三孢布拉霉获得高产率的番茄红素的方法，以及它的回收和配制的方法。本发明由以下各项组成(i)设计用于获得和选择三孢布拉霉突变株的方法，所述突变株是番茄红素的过量生产者。(ii)开发改善的发酵条件，(iii)建立从菌丝体中回收番茄红素的方法和(iv)克服现有技术中存在的、在各种介质中的稳定性和溶解性问题的制剂的完成。三孢布拉霉是对于生物技术生产番茄红素有重要工业意义的真菌。实际上，所述方法证明与目前工业使用的合成方法存在竞争性。
为了获得番茄红素过量生产者的菌株，首先开发针对三孢布拉霉的(+)和(-)菌株的诱变方法，其使用诱变剂甲磺酸乙酯(EMS)和N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(NTG)。用于突变的孢子混悬液获自YpSs培养基的斜面。通过加入10ml 0.1％Triton X-100溶液于各个斜面将孢子再悬浮。通过过滤通过孔径为20μm的尼龙滤器去除菌丝体残渣。将孢子在混悬液中的浓度调整为106个孢子/ml。使用EMS的突变方法包括将3％EMS溶液中的106个孢子/ml在0.1M磷酸钠缓冲液pH 7.0中在室温下温育60分钟，获得约99％的死亡率。用0.1％Triton X-100洗涤突变的孢子三次并在3000rpm下在15℃下离心2分钟。用NTG的突变方法包括将在包含250μg/ml NTG和0.1M柠檬酸钠缓冲液pH 5.0的溶液中的106个孢子/ml在室温下温育30分钟，获得约95％的死亡率。用0.1％Triton X-100洗涤突变的孢子三次并在3000rpm下在15℃下离心2分钟。用突变的孢子接种含有补充有0.1％Triton X-100的Sutter IV固体培养基的平皿，并在25℃下温育4天以获得分离的菌落。
如下是选择过量生产番茄红素的三孢布拉霉(-)菌株的所用策略(i)使用三孢酸和(ii)菌落的颜色强度。通过加入三孢酸选择生产番茄红素的突变株由将浸渍三孢酸的滤器放置在由突变的孢子获得的菌落上组成。从三孢布拉霉的(+)和(-)菌株的混合培养物获得三孢酸。将菌落加上滤器在25℃下温育，观察到生产番茄红素的突变株要求深红色，与橙色的β-胡萝卜素的生产者形成对比。将该方法应用于CMA3(-)菌株，选择LMA1(-)菌株(流程2)。以下列方法进行作为菌落颜色强度函数的生产番茄红素的突变株的选择将CMA1(-)菌株(β-胡萝卜素的生产者；参见流程2)突变，突变的孢子在YEPDA固体培养基上生长。接下来，选择具有比CMA1(-)亲株更深的黄色-橙色的那些菌落。这样分离2个具有深黄色-橙色的菌落(命名为CMB1(-)和CMB2(-))。
流程2使用突变和选择的方法从三孢布拉霉VKPM F-208(-)获得三孢布拉霉的(-)菌株的种系发生。UV紫外线；SN自然选择；NTGN-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍；EMS甲磺酸乙酯。
通过在含有补充有0.1％咪唑的Sutter IV固体培养基的平皿中培养突变的孢子进行三孢布拉霉(+)过量生产番茄红素的突变株的选择。接下来，将每个菌落的一部分转移至其中已经预先接种三孢布拉霉(-)的PDA平皿。在(+)菌株和(-)菌株的菌落的交叉区域，作为显色强度的函数测定固体培养基中番茄红素生产的水平。这样选择三孢布拉霉CPA1(+)菌株(流程3)，其在与一系列(-)菌株的混合固体培养物中产生更高产率的番茄红素。然后在液体培养基的混合培养物中分析三孢布拉霉CPA1(+)菌株的生产水平。
用于命名选择菌株的符号系统如下CM胡萝卜素负型(-)LM番茄红素负型(-)CP胡萝卜素正型(+)LP番茄红素正型(+)亲代之间的关系依照字母顺序A是B的亲代，B是C的亲代，等等。字母后的数字对应于突变株的号码。例如，名称CMA1(-)表示它是生产胡萝卜素的菌株(C)，负型(M)，CMB的亲代和突变株号1。类似地，CMA1(-)，CMA2(-)，CMA3(-)和CMA4(-)对应于相同代的突变株1，2，3和4。

流程3使用突变和选择的方法从三孢布拉霉VKPM F-117(+)获得三孢布拉霉的(+)菌株的种系发生。UV紫外线；SN自然选择；NTGN-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍；EMS甲磺酸乙酯。
为了测定在液体培养基和混合培养物中番茄红素的生产水平，在摇瓶中发酵在固体培养基中选择的三孢布拉霉的(+)和(-)菌株。为此，用菌株三孢布拉霉CPA1(+)和三孢布拉霉CMB2(-)接种分开的摇瓶接种物，然后在摇瓶中进行两种菌株的混合发酵。在发酵开始(0-50小时)，为了在番茄红素水平上阻断生物合成途径，加入酶番茄红素环化酶的抑制剂(例如浓度为0.7-0.8g/l的咪唑)。在发酵结束时(约6天)，通过涡旋搅拌裂解三孢布拉霉的菌丝体，用有机溶剂(例如丙酮)提取番茄红素，通过HPLC测定它的浓度和纯度。获得的产率为3.0g/l。除了在这种情形中不需要加入酶番茄红素环化酶的抑制剂以外，用菌株三孢布拉霉CPA1(+)和三孢布拉霉LMA1(-)进行相同类型的发酵。在混合培养物中使用这些菌株获得的产率为1.2g/l。
为了测定番茄红素产率，在半工业化的发酵罐中培养CPA1(+)和CMB2(-)菌株。为此，分别在摇瓶中培养它们，分别转移至中间培养罐和最后将它们一起发酵。在发酵25和35小时之间，加入咪唑作为酶番茄红素环化酶的抑制剂。将发酵温育100-140小时。在CPA1(+)和CMB2(-)菌株的一系列不同发酵中获得的番茄红素产率的平均值为3.4g/l。
为了测定在不加入酶番茄红素环化酶抑制剂的情形下的番茄红素产率，在半工业化的发酵罐中培养CPA1(+)和LMA1(-)菌株。如前所述对于CPA1(+)和CMB2(-)菌株进行发酵，但是不加入咪唑。在CPA1(+)和LMA1(-)菌株的一系列不同发酵中获得的番茄红素产率的平均值为1.6g/l。
通过控制三孢布拉霉菌株生长的营养期的龄期，获得在该发酵阶段中更高的产率。因此，对于(+)和(-)两种菌株，用作接种物的培养物具有30-60小时，优选48小时的龄期，但改变接种的孢子数分别为800-1000个孢子/ml和40000-60000个孢子/ml。在约25℃下进行温育，在初级培养期接种每个接种物的0.1％v/v。所述初级培养物的龄期在30-60小时的范围改变，优选36-48小时，温度为26-28℃。然后以比率1/10v/v混合(+)/(-)初期培养物并用所述时期的混合物接种发酵罐10-20％v/v。
考虑到在发酵中生物合成的类胡萝卜素成分的胞内特性，从如常规方法所称而制备的培养基中回收的方法，包括第一步从培养基中分离生物量。该分离可以如下进行通过建立过滤的方法，使用滤器的常规技术，无论是带式滤器(belt filter)，旋转滤机，压滤机等，其中由滤布组成的阻挡层分离生物量和允许液相而无生物量通过，或离心，其中通过利用培养基和生物量(通常密度更高)之间的密度差异，使用机器如离心分离器，滗析器等，其中重相变得浓缩并以最小可能的生物量的量从液相分离。该阶段的一个目的是减少损失和优化各相的性质，以最少量的活性物质获得最大量的生物量和最高含量的干燥残渣，消除大多数发酵培养基。
产生的湿菌丝体包含在发酵中生产的大于95％的类胡萝卜素，优选大于97％和更优选大于99％。因此在水相中的类胡萝卜素的含量小于5％，优选小于3％，更优选小于1％。使用该湿菌丝体，通过随后步骤可以分离番茄红素。然而，已经发现关于发酵，该菌丝体仍具有相对高百分比的15％-20％(脂肪酸和油)的亲油成分，其导致在随后步骤中的纯化问题，因此需要在该点引入纯化生物量的步骤。纯化步骤包括再悬浮生物量于醇甲醇，乙醇，丙醇，异丙醇，或其中番茄红素溶解度极低的其它任何醇中至足够的程度，以实现类脂成分的最大纯化。因此，以1ml/g至10ml/g湿菌丝体的醇的量再悬浮湿菌丝体。再悬浮的温度在0℃和醇的沸点之间，优选10-50℃之间变化。接触时间为5分钟至24小时。将如此制备的醇再混悬液过滤或离心，以使滤液或澄清液中的固体含量几乎为零。得到的湿菌丝体将包含不同比例的醇和水，包含在发酵中生产的大于93％的类胡萝卜素，优选大于95％和更优选大于97％。
在包含培养基和醇的残渣的上清液或滤液中，类胡萝卜素的含量相对于初始的培养基小于2％，优选小于1％。使用醇的这种处理使可以以根据所用培养基的特性改变的量去除许多醇溶性亲油物质，进行预纯化，其将使可以获得高纯度的晶体终产物。另外，通过从初始的湿菌丝体中去除不同比例的水，极大地促进随后的干燥步骤。通过将培养基与醇直接混合和保持最小的接触时间，获得相当于先前所述的纯化效果，结果通过消除一步固-液分离的操作来简化过程。培养基/醇比率可以为1/0.5至1/5，优选为1/1-1/3。混合物的温度在室温和混合物的沸点之间，优选在室温和60℃之间变化。
干燥脱水/纯化的菌丝体。可以通过常规的分批或连续方法进行干燥。干燥温度在室温至150℃之间变化，优选它不应超过60℃，更优选它应当低于50℃。干燥时间取决于所用温度，在1小时至72小时之间变化。由于通过空气中的氧的氧化导致这些类胡萝卜素的可能分解，最好在不存在氧的情形下，在氮气气氛下或至少在真空下进行该干燥操作。类胡萝卜素产物在胞内的事实意味着需要通过干燥加上研磨，干燥加上分解或将生物量分解来调节纯化的生物量，其促进与溶剂的混合和促进溶剂提取。为了溶剂可以很好地接触待提取的类胡萝卜素，需要破裂菌丝体的预先操作以最大化接触面积。干燥的破裂的菌丝体的最佳颗粒大小必须小于3mm，优选小于1mm，更优选小于0.5mm。
可以借助具有转动或固定部件锤，筛网等的机械系统，通过彼此挤压的旋转柱体(压实或挤出)，对干燥产物进行研磨。还可以通过在喷磨机中的快速(瞬时)干燥系统在单一步骤中进行干燥和研磨，其中将湿产物供应给高温循环气流，以停留时间最小这样的方式来汽化液体成分的内容物，随着密度变化将产物运送至回收它的旋风分离器。在干燥期间和在干燥途径中，当颗粒撞击在壁上时还存在均化效果。
可以将各种有机溶剂用于从以所述方式调节的菌丝体中提取番茄红素。本发明将是指使用被认为天然的食品级的溶剂，如酰基酯，优选乙酸乙酯，乙酸丙酯，乙酸异丙酯，乙酸丁酯或乙酸异丁酯，其合理地结合了类胡萝卜素成分的高溶解度和它们作为包括在ICH的III类组中的溶剂的相容性。这些溶剂在国家和社团水平上，在药物和食品领域都是允许的(RDL12/04/90和RDL16/10/96)。如在ICH中所要求的，基于在所有情况下的液体混合物的干燥物质，残余溶剂含量必须低于5000ppm，优选低于1000ppm，更优选低于100ppm。提取温度在室温和溶剂的沸点之间改变，优选50℃-80℃。提取时间将最少需要1秒至1小时，优选1分钟至15分钟以完成溶解。所用溶剂的量取决于温度和菌丝体的类胡萝卜素的含量，其在5ml/g和30ml/g生物量之间改变。提取的数量为1-3。提取的类胡萝卜素的量大于85％，优选大于90％，更优选大于95％。
一旦获得，必须将富含类胡萝卜素的提取物浓缩至确定量。在浓缩后溶剂中类胡萝卜素的终浓度优选为10-50g/l。浓缩的温度必须低于80℃，优选低于70℃和更优选低于50℃。一旦已经将提取物浓缩至所需量，需要加入类胡萝卜素的不溶粘料，明确地醇，更明确地甲醇，乙醇，丙醇，异丙醇和其中番茄红素的溶解度极低的其它任何醇，因此晶体番茄红素的产率显著提高。醇的加入还有纯化作用。结晶时间在15分钟至24小时之间改变，优选1小时至12小时，更优选3至8小时。结晶温度必须低于25℃，优选低于5℃。
通过过滤或离心，通过用与不溶解使用的相同的醇洗涤置换其中浸没晶体的结晶液，可以实现从结晶液分离晶体。在室温下在真空下干燥获得的晶体至少1小时，直至获得满足前述法规设定的规范和在番茄红素情形中规定小于0.5％的干燥失重的残留溶剂含量。
获得的晶体的纯度相当于大于95％的滴度，其是由分光光度测定法通过读取在正己烷中的晶体溶液在472nm下的吸光度(E1％1cm＝3450)来测定的，其它类胡萝卜素的含量低于3％。顺式番茄红素的含量低于3％。
本发明的方法特别适于从微生物来源中回收晶体番茄红素，所述微生物来源优选藻类，真菌或酵母，更优选来自Mucorales目的真菌，更优选三孢布拉霉。通过本发明方法和使用被认为是天然方式的溶剂获得的晶体的异常纯度，意味着这些晶体可以用于食品，药物或化妆品工业。
通过本发明所述方法获得的晶体产物可以在无氧下(惰性气氛或真空)以防止氧化和在0-5℃的温度下，包装在防止产物光降解的不透明的容器中。可以“照现在的样子(asis)”搬运和销售适当包装的产品。然而，明智的是通过随后的配制或精加工(finishing)步骤，包括加入抗氧化剂增加它的稳定性，使得当适当的包装时可以获得贮存期限大于6个月的最终产品。
本发明另一基本目的是制备番茄红素的方法，其包括它随使用番茄红素的应用特征而变化的各种形式的制剂。第一种应用，称为植物油中番茄红素的微晶混悬液，由上述晶体番茄红素和不定量的植物油的预混合组成。植物油的类型可以极其多样，最常见但不是仅有的类型是向日葵油，橄榄油，玉米油，大豆油，棉籽油等。番茄红素的剂量将是最终所需强度的函数，最常见的值为番茄红素含量是5-60％，优选10-30％的混悬液。为了提高混合物的稳定性，加入常用的脂溶性的抗氧化剂，如天然生育酚，优选D，L-α-生育酚。相对于番茄红素重量该化合物的比例在0.2-15％之间变化，优选0.5-5％。对于包含番茄红素而具有令人满意的生理活性的制剂，需要减小番茄红素晶体的大小。这是使用适于液体混合物的常用研磨系统实现的。本发明的特殊目的是球磨，使用直径为0.5-0.75mm的微球粒，其允许将晶体的大小减小到低于10微米，优选低于5微米，更优选低于2微米。然而，在各种情形下使用适当的球粒和研磨条件，晶体大小可以随混悬液的具体应用的要求而变化。该晶体大小还将决定混合物的流变性质，特别是它的粘度，其也可以随需要的要求而调整。这些番茄红素在油中的微晶混悬液适合于番茄红素在亲油环境人造黄油，奶油，乳膏等中的应用。
第二种应用，称为冷水可分散的(CWD)番茄红素制剂，是基于将番茄红素溶解在有机溶剂中和随后它在改性淀粉中微囊化。因为该分子显示高溶解性，最适于进行该溶解的溶剂是氯仿，苯，甲苯等。二氯甲烷特别适合。然而，由于后者的卤化特性，可以使用被认为天然的食品级的溶剂，如酰基酯，优选乙酸乙酯，乙酸丙酯，乙酸异丙酯，乙酸丁酯，乙酸异丁酯和其它乙酸酯，其结合了对于类胡萝卜素成分的相当高的溶解度和它们作为包括在ICH的III类组中的溶剂的相容性。番茄红素在有机溶剂中的浓度可以在1-50g/l，优选10-30g/l之间改变。溶解温度可以在室温和溶剂的沸点之间改变，优选20-130℃。顺式番茄红素的百分比是番茄红素溶解在有机溶剂中的操作中的温度/时间的比率的函数的事实，意味着如果我们想要获得具有低含量的该异构体的产品，使用低溶解温度，否则使用极短的溶解时间。因此，为了获得低水平的顺式番茄红素，如果使用的溶剂是二氯甲烷，可以在20-35℃下溶解1-15分钟。如果另一方面，溶剂是乙酸异丁酯，优选在70-130℃下进行溶解数秒钟。然而，如果顺式异构体的水平不相关，可以无限制地进行溶解，它的条件是除了达到番茄红素在所用溶剂中在分子水平上的总溶解度以外。为了提高最终制剂的稳定性，将一种或数种抗氧化剂的混合物与番茄红素一起溶解在有机溶剂中；优选这些抗氧化剂是诸如生育酚，棕榈酸抗坏血酸酯等的那些，它们各自比例为相对于番茄红素重量的1-30％，优选10-20％。为了促进番茄红素溶解和赋予制剂另外的稳定性，还可以将植物油向日葵油，橄榄油，玉米油，豆油，棉籽油等结合到混合物中。番茄红素/油的比率可以在10/1至1/10之间改变。
将如此获得的番茄红素溶液与水溶液混合和乳化，所述水溶液包含乳化剂，例如改性淀粉，更具体地衍生于淀粉的酯类，优选衍生于各种分子量的淀粉的琥珀酸辛烯酯，特别是但不是排它地，来自National Starch的Purity Gum 2000或来自Roquette的Cleargum CO 01，和微囊化剂，其例如由改性淀粉组成，所述改性淀粉更具体地为衍生于淀粉的酯类，优选衍生于各种分子量的淀粉的琥珀酸辛烯酯，特别是但不是排它地，来自National Starch的HiCap 100或Capsul。乳化剂和微囊化剂的混合比例可以为5/95至95/5，优选25/75至75/25，更优选40/60至60/40。乳化剂和微囊化剂混合物的各种成分的含水量可以变化，可以为1-30％，优选5-20％，更优选10％。将水相和有机相的混合物乳化并将获得的乳剂均化，其如常规使用，采用Mantón Gaulin或Microfluidizer类型的压差均化系统，优选通过切向摩擦均化，例如使用Ultraturrax类型的乳化器，乳化时间随设备提供的能量和待乳化的混合物的体积而变化，以便获得小于10微米，优选小于2微米和更优选0.1-1微米的平均胶束大小。
一旦乳剂已经形成，优选在低于50℃下通过真空蒸馏进行有机溶剂的蒸发。随着溶剂蒸发进行，在淀粉基质中发生番茄红素的微结晶。一旦溶剂已经蒸发，蒸发继续，连续加入水直至获得符合由法规制定的关于最大浓度的规范的残余溶剂含量，和适合于施用于该液体混合物的干燥类型的干残渣。在微囊化番茄红素的混悬液中的干物质的适当的值是1-30％，优选10-20％。
依照本发明，发现通过高温粉碎(雾化(atomization))干燥的方法和流化床粉碎(成粒)的方法都适合于干燥获得的番茄红素的水性混悬液。另一种备选是冷冻干燥。如通过雾化干燥的方法中所要求，干燥空气的适当入口温度为100-200℃，而出口温度为60-120℃。雾化的产品具有10-100微米的颗粒大小。为了增大颗粒大小和减小有效面积，和因此增加产品的抗氧化性，通过在所述雾化产品的流化床中粉碎配制所用的改性淀粉之一的溶液，或微囊化番茄红素其本身的混悬液，可以附聚雾化的产品，使得可以获得50-500微米，优选200-300微米的颗粒大小。
粒化方法包括使用流化床成粒机，其中放置种子物质(seed material)，其可以是典型的惰性物质，如糖颗粒，或在前面成粒过程中或在喷雾干燥过程中获得的待干燥的实际物质的细粉。借助空气保持颗粒运动，床的温度保持在30-90℃，优选50-80℃。在流化床中借助预热至20-140℃的空气，以保证待涂布的颗粒不变得太湿且不成块的速率喷雾微囊化的番茄红素的混悬液。粒状产品具有100-2000微米，优选100-800微米和更优选100-300微米的颗粒大小。一旦已经完成通过一种或其它方法的粉碎，可以涂布颗粒。可以用约0.5-10％干重的各种糖或甚至一种淀粉或淀粉混合物的水溶液进行该涂布，所述淀粉组成本发明目的的制剂。
依照布达佩斯条约的微生物保藏按照布达佩斯条约的条款，三孢布拉霉菌株已经保藏在俄罗斯国立工业微生物保藏中心(VKPM)，GNII Genetika，Dorozhny Proezd 1，莫斯科113545(俄罗斯)，号码和日期如下1979年12月21日VKPM F-117，1979年12月20日VKPM F-208，1992年11月19日VKPM F-551，1992年11月19日VKPM F-674，1997年1月21日VKPM F-726，1997年1月21日VKPM F-727，1997年10月7日VKPM F-736，1998年1月28日VKPM F-741，1998年1月28日VKPM F-744和2000年12月13日VKPM F-816。
下列实施例详细地和不限制性地描述本发明。
实施例1三孢布拉霉(+)和(-)菌株的突变策略首先针对三孢布拉霉(+)和(-)菌株开发诱变方法，为此分析下列各项(i)各种类型的诱变剂，(ii)诱变剂的浓度，(iii)孢子的浓度，(iv)温育pH，和(v)处理时间。这样，选择甲磺酸乙酯(EMS)和N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(NTG)作为诱变剂。
从YpSs培养基的斜面获得待突变的孢子的混悬液，其具有下列组成酵母提取物4g/l，可溶性淀粉15g/l，K2HPO41g/l，MgSO4·7H2O 0.5g/l和琼脂15g/l，最终pH为5.8。通过将10ml 0.1％Triton X-100溶液加入每个斜面再悬浮孢子。通过过滤通过孔径为20μm的尼龙滤器去除菌丝体残渣。混悬液中孢子的浓度约为106个孢子/ml。
使用EMS的突变方法包括将3％EMS溶液中的106个孢子/ml在0.1M磷酸钠缓冲液pH7.0中在室温下温育60分钟，获得约99％的死亡率。用0.1％Triton X-100洗涤突变的孢子三次并在3000rpm下在15℃下离心2分钟。
用NTG的突变方法包括将在包含250μg/ml NTG和0.1M柠檬酸钠缓冲液pH 5.0的溶液中的106个孢子/ml在室温下温育30分钟，获得约95％的死亡率。用0.1％Triton X-100洗涤突变的孢子三次并在3000rpm下在15℃下离心2分钟。
用突变的孢子接种含有补充有0.1％Triton X-100的Sutter IV固体培养基的平皿。每升Sutter IV培养基的组成如下40g葡萄糖，4g L-天冬酰胺，10g KH2PO4，40ml 50x痕量元素的溶液，和30g琼脂。50x痕量元素溶液由下列各项组成25g/l MgSO4·7H2O，1.82g/l CaCl2·2H2O，0.05g/l维生素B1，0.1g/l柠檬酸，0.075g/l Fe(NO3)3·9H2O，0.05g/l ZnSO4·7H2O，0.17g/l MnSO4·H2O，0.025g/l CuSO4·5H2O和0.025g/l NaMoO4·2H2O。将接种的平皿在25℃下温育4天以获得分离的菌实施例2选择番茄红素过量生产者的三孢布拉霉(-)突变株的策略本实施例描述用于选择番茄红素过量生产者的三孢布拉霉(-)菌株的策略，其是基于(i)三孢酸的使用和(ii)菌落的颜色强度。

图1显示用于本发明的三孢布拉霉(-)菌株的种系发生。
通过将浸渍三孢酸的直径约0.6mm的无菌滤器放置在由突变的孢子获得的菌落上进行通过加入三孢酸选择生产番茄红素的突变株。在将样品酸化到pH 2以后通过用一体积的氯仿从三孢布拉霉(+)和(-)菌株的混合培养物中提取上清液获得三孢酸。用一体积4％的碳酸氢钠溶液提取有机级分，收集水相，其被酸化并再次用氯仿提取。接下来，将氯仿蒸发干，将富含三孢酸的残渣溶解在乙醇中。通过测量在325nm下的吸光度和假定70ml x mg-1x cm-1的吸光系数定量三孢酸(Sutter R.P.，Capage D.A.，Harrison T.L.，Keen W.A.1973.J.Bacteriology1141074-1082)。
将无菌滤器温育在1.2mg/ml三孢酸乙醇溶液中和然后在无菌条件下在室温下放置至干燥。接下来，将滤器放置在预先在25℃下生长4天的突变株菌落上。将平皿在25℃下温育另外3天，观察到生产番茄红素的突变株变深红色，与橙色的β-胡萝卜素生产者形成对比。
将该方法应用于CMA3(-)菌株，获得突变株LMA1(-)(图1)，其可能在编码酶番茄红素环化酶的caRP基因中具有突变，因此在类胡萝卜素发酵过程期间不生产β-胡萝卜素而应该累积中间体番茄红素。因此LMA1菌株能够生产番茄红素而无需加入番茄红素环化酶活性的特异性抑制剂(实施例5)。
如下进行根据菌落颜色强度选择生产番茄红素的突变株如实施例1所述突变CMA1菌株(β-胡萝卜素生产者；参见图1)。将突变的孢子接种在YEPDA固体培养基(细菌用蛋白胨20g/l，酵母提取物10g/l，葡萄糖20g/l和琼脂20g/l，最终pH为6.0)的平皿上，在25℃下温育24小时和然后在20℃下温育48-72小时。最后，选择具有比CMA1(-)亲代菌株较深黄色-橙色的那些菌落。这样，分离2个深黄色-橙色的菌落(命名为CMB1(-)和CMB2(-))。CMB1和CMB2菌株可能是在加入番茄红素环化酶特异性抑制剂(例如咪唑；实施例4)的混合发酵中番茄红素的过量生产者。
实施例3番茄红素过量生产者的三孢布拉霉(+)突变株的选择策略使用在实施例1所述方法中的突变孢子进行番茄红素过量生产者的三孢布拉霉(+)突变株的选择。将这些孢子接种在包含补充有0.1％咪唑的Sutter IV固体培养基的平皿上，并在25℃下温育7天以获得分离的菌落。接下来，将每个菌落的一部分转移至其上已经预先接种三孢布拉霉(-)的PDA平皿。(+)和(-)菌株的接种点之间的距离必须约为2cm。从(+)菌株和(-)菌株的菌落的交叉区域中的颜色强度评估固体培养基中番茄红素的生产水平。这样选择三孢布拉霉菌株CPA1(+)，这在与一系列(-)菌株的混合固体培养物中产生更高产率的番茄红素。然后如实施例4和5所述在液体培养基的混合培养物中分析三孢布拉霉菌株CPA1(+)的生产水平。流程3显示本发明所用三孢布拉霉(+)菌株的种系发生。
实施例4通过加入酶番茄红素环化酶抑制剂混合培养三孢布拉霉(+)和(-)菌株在摇瓶中生产番茄红素的方法为了测定在液体培养基和混合培养物中番茄红素的生产水平，在摇瓶中发酵如实施例1，2和3所述选择的三孢布拉霉(+)和(-)菌株。为此，以下列每升组成制备接种培养基23g大豆粉，47g玉米粉，0.5gKH2PO4，0.002g盐酸硫胺素，并将pH调整至6.3。以每ml 103个孢子的比率将三孢布拉霉CPA1(+)菌株接种到包含67ml培养基的500ml摇瓶中。以每ml 104个孢子的比率将三孢布拉霉CMB2(-)菌株接种到包含100ml培养基的500ml摇瓶中。将两种接种物在25℃和250rpm下温育44小时。
完成温育后，以1/10(v/v)的比率混合(+)和(-)菌株的接种物，以每个摇瓶4ml菌株混合物的比率将该混合物用于接种包含20m1发酵培养基的250ml摇瓶中。将这些摇瓶在25℃和250rpm下温育5-6天。所用发酵培养基每升具有下列组成44g大豆粉，19玉米粉，55g KH2PO4，0.002g盐酸硫胺素，100ml植物油，并将pH调整至7.5。将培养基分配在250ml摇瓶中，用20％三孢布拉霉(+)和(-)菌株的混合物接种摇瓶。在发酵的第0和第36小时之间，为了在番茄红素水平上阻断生物合成途径，加入酶番茄红素环化酶的抑制剂(例如0.75mg/ml咪唑)。将摇瓶在25℃和250rpm下温育6天。在发酵结束时，制备发酵培养基，玻璃珠和二氯甲烷/甲醇(1/1)的混合物。通过涡旋搅拌裂解三孢布拉霉的菌丝体，释放胞内番茄红素。将用二氯甲烷/甲醇混合物(比率1∶1)提取的番茄红素稀释在丙酮中。使用反向HPLC测定番茄红素的浓度和纯度。
在咪唑存在下，在菌株三孢布拉霉CPA1(+)和三孢布拉霉CMB2(-)菌株的混合发酵中获得的产率为3g/l番茄红素(图1)。
实施例5在未加入酶番茄红素环化酶抑制剂的情形下通过混合培养三孢布拉霉CPA1(+)和三孢布拉霉LMA1(-)菌株在摇瓶中生产番茄红素的方法为了测定在液体培养基和混合培养物中番茄红素的生产水平，在摇瓶中发酵如实施例1，2和3所述选择的三孢布拉霉LMA1(-)和CPA1(+)菌株。为此，从(+)和(-)菌株制备接种物，如实施例4所述在摇瓶中进行发酵。差异是在该情形下未加入番茄红素环化酶活性的化学抑制剂。在发酵结束时，如实施例4所述评估番茄红素的生产。
在缺少咪唑的情形中，通过混合发酵菌株三孢布拉霉CPA1(+)和三孢布拉霉LMA1(-)而获得的产率为1.2g/l(图2)。
实施例6在加入酶番茄红素环化酶抑制剂的情形下通过混合培养三孢布拉霉(+)和(-)菌株在半工业化发酵罐中生产番茄红素的方法为了测定番茄红素的产率，在半工业化发酵罐中培养如实施例2和3所述选择的三孢布拉霉的CPA1(+)和CMB2(-)菌株。为此，以下列的每升组成制备接种物23g大豆粉，47g玉米粉，0.5g KH2PO4，0.002g盐酸硫胺素，并将它的pH调整至6.3。将(+)和(-)菌株分别接种在包含500ml培养基的2000ml摇瓶中，并在25℃和250rpm下温育44-48小时。
将每种菌株转移至包含每升具有下列组成的培养基的中间培养罐中29g Pharmamedia，47g玉米粉，0.5g KH2PO4，0.002g盐酸硫胺素和1g防泡剂，并将它的pH调整至6.0。在温育36-48小时后，以1/10的比率混合(+)和(-)菌株，将20％的混合物用于接种发酵基本培养基，其每升具有下列组成44g大豆粉，19.25g玉米粉，0.55g KH2PO4，3.36gNa2HPO4，0.184g NaH2PO4，0.0022g盐酸硫胺素，100g植物油和0.175g防泡剂，并将它的初始pH调整至7.5。发酵在25-28℃的温度下以150-250rpm的搅拌和1-1.5 v/v/m的通气下温育100-140小时。在发酵的第25和第35小时之间，将无菌咪唑加至0.75g/l的终浓度。
如实施例4所述进行在发酵结束时番茄红素的浓度和纯度的评估。在CPA1(+)和CMB2(-)菌株的一系列不同发酵中获得的番茄红素产率的平均值为3.4g/l(图2)。
实施例7在未加入酶番茄红素环化酶抑制剂的情形下通过混合培养菌株三孢布拉霉CPA1(+)和三孢布拉霉LMA1(-)在半工业化发酵罐中生产番茄红素的方法为了在未加入酶番茄红素环化酶抑制剂的情形下测定番茄红素的生产水平，在半工业化发酵罐中培养如实施例2和3所述方法选择的三孢布拉霉的CPA1(+)和LMA1(-)菌株。为此，以下列的每升组成制备接种培养基23g大豆粉，47g玉米粉，0.5g KH2PO4，0.002g盐酸硫胺素，并将它的pH调整至6.3。将(+)和(-)菌株分别接种在包含500ml培养基的2000ml摇瓶中，并在25℃和250rpm下温育44-48小时。
将每种菌株转移至包含每升具有下列组成的培养基的中间培养罐中29g Pharmamedia，47g玉米粉，0.5g KH2PO4，0.002g盐酸硫胺素和1g防泡剂，并将它的pH调整至6.0。在温育36-48小时后，以1/10的比率混合(+)和(-)菌株，将20％的混合物用于接种发酵基本培养基，其每升具有下列组成44g大豆粉，19.25g玉米粉，0.55g KH2PO4，3.36gNa2HPO4，0.184g NaH2PO4，0.0022g盐酸硫胺素，100g植物油和0.175g防泡剂，并将它的初始pH调整至7.5。发酵在25-28℃的温度下以150-250rpm的搅拌和1-1.5 v/v/m的通气下温育100-140小时。
如实施例4所述进行在发酵结束时番茄红素的浓度和纯度的评估。在CPA1(+)和LMA1(-)菌株的一系列不同发酵中在未加入咪唑的情形下获得的番茄红素产率的平均值为1.6g/l(图2)。
实施例8通过再悬浮生物量于醇中回收番茄红素的方法按照其中生物合成途径在番茄红素水平上中断的生物合成方法，收获三升发酵培养基。培养基的滴定度为3g番茄红素/升。通过用瓷漏斗(陶瓷过滤器漏斗，其支持作为滤板的纸盘或卡片)过滤回收该培养基的生物量，获得750g湿生物量。将湿生物量再悬浮在5.21共沸异丙醇85/15中，并在45±5℃下搅拌30分钟。重复使用瓷漏斗回收纯化的生物量。将该生物量在真空下在低于45±5℃的温度下在炉中干燥18小时，直至残留溶剂/水的含量小于8％。获得150g干燥的纯化的生物量，番茄红素含量等于5.5％的分析值。将干燥生物量在球磨和1mm的筛网中研磨，获得具有相同百分比含量的固体，将其调整以允许溶剂提取。
通过在70±5℃下混合150g磨碎的生物量和2500ml乙酸异丁酯，继续搅拌5分钟来进行提取。通过在滤板上过滤从富含番茄红素的溶剂中分离废弃(spent)的生物量。在相同的滤器上用300ml热的乙酸异丁酯洗涤废弃的生物量，将洗涤溶剂与滤液混合。在真空下浓缩所有富含番茄红素的乙酸异丁酯，保持温度低于45±5℃，直至体积减小到300ml，因此一些番茄红素结晶。为了完成结晶和获得更纯的番茄红素，加入900ml异丙醇。在氮气下和在0-5℃下继续搅拌混合物3小时。在瓷漏斗中过滤，在瓷漏斗上用25ml异丙醇洗涤晶体。收集晶体，然后在真空下干燥，获得6.5g番茄红素晶体，分光光度法的纯度为95％。HPLC未检测到其它类胡萝卜素和顺式番茄红素的存在。
实施例9在油状混悬液中配制番茄红素的方法用下列各项，以下列顺序充满来自Netzsch的Minizeta 003型的实验室球磨直径为0.5-0.75mm的微球粒，23.5g向日葵油(Koipe)，0.065gD，L-α-生育酚(Merck)和6.5g如实施例8所述获得的晶体番茄红素。在3000rpm下研磨混合物5分钟，获得25g带深红色-紫色的粘性液体。油状混悬液的分光光度分析显示21％的番茄红素含量。HPLC未检测到其它类胡萝卜素和番茄红素顺式异构体的存在。晶体小于10微米。
实施例10通过用醇直接处理发酵培养基回收番茄红素的方法将1500升番茄红素发酵培养基(番茄红素强度2.3g/l)直接与4500升85/15异丙醇/水共沸混合物混合。在45±5℃下搅拌30分钟以后，使用离心滗析器从液体中分离生物量。收集约250kg湿的，纯化的生物量。
在真空下在转筒式干燥机中干燥用水和异丙醇浸渍的这种生物量，直至残留的溶剂/水的含量低于8％。干燥温度为45±5℃，在干燥机中的平均停留时间为14小时。获得85kg干燥的生物量，番茄红素含量相当于3.75％的比浓度。
在来自BEPEX的Hutt-Compacktor压实机中挤压干燥的生物量，获得具有相同比浓度的固体，调节其以允许溶剂提取。
通过混合85kg磨碎的固体和1650升乙酸异丁酯进行提取。在60±5℃下有成直线地加热混合物，平均接触时间约为2分钟，使用离心滗析器从富含番茄红素的溶剂中分离废弃的生物量。在真空下浓缩全部的富含番茄红素的乙酸异丁酯，保持温度低于45±5℃，直至体积减小到100升，因此一部分番茄红素结晶。为了完成番茄红素的结晶，加入300ml异丙醇。在0-5℃下搅拌混合物3小时。在瓷漏斗上过滤，收集番茄红素的晶体，其在真空下在室温下干燥。获得2kg产品，分光光度法的纯度为96％。HPLC未检测到其它类胡萝卜素和顺式异构体的存在。
实施例11使用乙酸异丁酯作为溶剂配制水可分散的番茄红素的方法将3.5g如实施例10所述获得的番茄红素重悬浮在410ml乙酸异丁酯中并加入0.35g D，L-α-生育酚(Merck)。将混合物加热至沸腾(114℃)5分钟，保证番茄红素的完全溶解。同时，将12g Hi-Cap 100(National Starch)和12g Purity Gum 2000(National Starch)溶解在325ml软化水中。使用来自IKA的Ultraturrax乳化器在水相上在一步内乳化热的有机相5分钟，获得1.2微米的平均胶束大小，其用Coulter LS230分析器测量。将乳剂转移至真空蒸馏系统，加入600ml水，以便用约700ml水蒸发410ml乙酸异丁酯。获得203g液体制剂(12.75％干物质)，番茄红素含量为1.25％(基于干物质9.8％)。使用HPLC，检测到23.3％的顺式番茄红素的含量，但未检测到其它类胡萝卜素。使用在入口190℃和出口90℃的气体温度，将该液体制剂在Büchi 190实验室雾化器中雾化，获得深红色粉末，番茄红素含量为8.4％，含水量为6.5％。使用HPLC，检测到23％的顺式番茄红素的含量，但未检测到其它类胡萝卜素。
实施例12使用乙酸异丁酯作为溶剂配制水可分散的番茄红素的方法将3.5g如实施例10所述获得的番茄红素再悬浮在410ml乙酸异丁酯中，加入0.35g D，L-α-生育酚(Merck)，0.7g棕榈酸抗坏血酸酯(Merck)和3.5g向日葵油(Koipe)。将混合物加热至沸腾(114℃)5分钟，保证番茄红素的完全溶解。同时，将10g Hi-Cap 100(National Starch)和10g PurityGum 2000(National Starch)溶解在325ml软化水中。使用来自IKA的Ultraturrax乳化器在水相上在一步内乳化热的有机相5分钟，获得1.4微米的平均胶束大小，其用Coulter LS230分析器测量。将乳剂转移至真空蒸馏系统，加入600ml水，以便用约700ml水蒸发410ml乙酸异丁酯。获得195g液体制剂(13.25％干物质)，番茄红素含量为1.3％(基于干物质9.8％)。使用HPLC，检测到25％的顺式番茄红素的含量，但未检测到其它类胡萝卜素。使用在入口190℃和出口90℃的气体温度，将该液体制剂在Büchi 190实验室雾化器中雾化，获得深红色粉末，番茄红素含量为8.5％，含水量为6.0％。使用HPLC，检测到24.5％的顺式番茄红素的含量，但未检测到其它类胡萝卜素。
实施例13使用二氯甲烷作为溶剂配制水可分散的番茄红素的方法将7.5g如实施例10所述获得的晶体番茄红素再悬浮在500ml二氯甲烷中，加入0.75g D，L-α-生育酚(Merck)，在35℃下加热混合物5分钟。同时，将27g Hi-Cap 100(National Starch)和27g Purity Gum 2000(National Starch)溶解在400ml软化水中。使用来自IKA的Ultraturrax乳化器在水相上在一步内乳化有机相15分钟，获得0.4微米的平均胶束大小，其用Coulter LS230分析器测量。将乳剂转移至真空蒸馏系统，加入600ml水，以便用约600ml水蒸发500ml二氯甲烷。获得400g液体制剂(13.1％干物质)，番茄红素含量为1.5％(基于干物质11.5％)。使用HPLC，检测到6.5％的顺式番茄红素的含量，但未检测到其它类胡萝卜素。使用在入口190℃和出口90℃的气体温度，将该液体制剂在Büchi 190实验室雾化器中雾化，获得深红色粉末，番茄红素含量为10.6％，含水量为5.3％。使用HPLC，检测到6.4％的顺式番茄红素的含量，但未检测到其它类胡萝卜素。
实施例14使用二氯甲烷作为溶剂配制水可分散的番茄红素的方法将7.5g如实施例10所述获得的晶体番茄红素再悬浮在500ml二氯甲烷中，加入0.75g D，L-a-生育酚(Merck)，在35℃下加热混合物5分钟。同时，将27g Hi-Cap 100(National Starch)和27g Purity Gum 2000(National Starch)溶解在400ml软化水中。使用来自IKA的Ultraturrax乳化器在水相上在一步内乳化有机相60分钟，获得0.23微米的平均胶束大小，其用Coulter LS230分析器测量。将乳剂转移至真空蒸馏系统，加入600ml水，以便用约600ml水蒸发500ml二氯甲烷。获得350g液体制剂(14.4％干物质)，番茄红素含量为1.6％(基于干物质11.4％)。使用HPLC，检测到20％的顺式番茄红素的含量，但未检测到其它类胡萝卜素。在实验室装置中将该液体制剂冷冻干燥24小时，获得松软的深红色粉末，番茄红素含量为10.7％，含水量为7.4％。使用HPLC，检测到15％的顺式番茄红素的含量，但未检测到其它类胡萝卜素。
附图详述图1.通过在摇瓶中混合发酵三孢布拉霉CPA1(+)菌株和三孢布拉霉(-)的下列菌株中的每一种生产番茄红素L25，CMA1，CMA2，CMA3，CMA4，CMB1，CMB2和LMA1。除了在CPA1(+)/LMA1(-)混合发酵中以外，加入咪唑作为酶番茄红素环化酶的抑制剂。纵坐标用对照菌株L25(-)(VKPM F-744)的生产％。
图2.通过在发酵罐中混合发酵三孢布拉霉CPA1(+)菌株和三孢布拉霉(-)的下列菌株中的每一种生产番茄红素L25，CMA1，CMA2，CMA3，CMB1，CMB2和LMA1。除了在CPA1(+)/LMA1(-)混合发酵中以外，加入咪唑作为酶番茄红素环化酶的抑制剂。纵坐标用对照菌株L25(-)(VKPM F-744)的生产％。
权利要求
1.一种从生物合成来源生产番茄红素的方法，其特征在于它包含下列连续步骤a.任选地，在适于生产番茄红素的条件下混合发酵三孢布拉霉(Blakeslea trispora)的(+)和(-)菌株，b.用醇直接处理天然生物合成来源，特别是发酵培养基，和分离湿的纯化的生物量，c.通过干燥和分解或破裂调节所述湿的纯化的生物量，d.用有机溶剂固-液提取包含在所述纯化的生物量中的番茄红素，e.浓缩所述富含番茄红素的提取物，f.通过加入醇从所述浓缩的提取物中沉淀/结晶番茄红素，g.过滤和干燥，h.配制。
2.如权利要求1所要求的生产番茄红素的方法，其特征在于所述天然生物合成来源不是发酵培养基，而是包含番茄红素的植物组织，其一旦均化后直接进行步骤b。
3.如权利要求1和2任一所要求的方法，其特征在于获得结晶产品，通过在472nm下在正己烷中晶体的分光光度计的吸光度(E1％ 1cm＝3450)测定，其番茄红素含量大于95％，其它类胡萝卜素的含量小于3％，并且顺式番茄红素的含量也小于3％。
4.如权利要求1所要求的方法，其特征在于在所述任选步骤a中，与(+)菌株一起，使用三孢布拉霉(-)菌株，衍生于它们的生产番茄红素的突变株或转化体，优选在流程2中所述的那些。
5.如权利要求1所要求的方法，其特征在于在所述任选步骤a中，与(-)菌株一起，使用三孢布拉霉(+)菌株，衍生于它们的生产番茄红素的突变株或转化体，优选在流程3中所述的那些。
6.如权利要求1所要求的方法，其特征在于所述任选步骤a在缺少番茄红素环化酶活性的抑制剂化合物的情形下，使用三孢布拉霉(-)和(+)菌株或衍生于它们的生产番茄红素的突变株或转化体的混合培养物。
7.如权利要求1所要求的方法，其特征在于所述任选步骤a在番茄红素环化酶活性的抑制剂的化合物的存在下，使用三孢布拉霉(-)和(+)菌株或衍生于它们的生产番茄红素的突变株或转化体的混合培养物。
8.如权利要求7所要求的方法，其特征在于在所述发酵过程期间加入咪唑作为番茄红素环化酶活性的抑制剂。
9.如权利要求8所要求的方法，其特征在于在发酵的第0和第50小时之间，优选在第25小时和第35小时之间加入咪唑。
10.如权利要求8和9所要求的方法，其特征在于咪唑的浓度保持在0.7-0.8g/l，优选为0.75g/l。
11.如权利要求7至10所要求的方法，其特征在于在半工业化或中试发酵罐中在5-6天生产至少3.4g/l番茄红素。
12.如权利要求6所要求的方法，其特征在于在半工业化或中试发酵罐中在5-6天生产至少1.6g/l番茄红素。
13.如权利要求4至12任一项所要求的方法，其特征在于控制三孢布拉霉菌株生长营养阶段的龄期。
14.如权利要求13所要求的方法，其特征在于用作接种物的培养物的龄期为30-60小时，优选48小时。
15.如权利要求13所要求的方法，其特征在于初级营养培养物的龄期为30-60小时，优选为36-48小时。
16.如权利要求13至15中任何一项所要求的方法，其特征在于i)将三孢布拉霉(+)菌株的接种物以800-1000个孢子/ml接种，ii)将三孢布拉霉(-)菌株的接种物以10 000-60 000个孢子/ml接种，iii)在25℃下培养三孢布拉霉(+)和(-)菌株的接种物至少48小时，iv)用至少0.1％(v/v)接种期接种三孢布拉霉(+)菌株的各期初级培养物，v)用至少0.1％(v/v)接种期接种三孢布拉霉(-)菌株的各期初级培养物，vi)在26℃下培养初期三孢布拉霉(+)菌株36-48小时，vii)在28℃下培养初期三孢布拉霉(-)菌株36-48小时，viii)以1(+)/10(-)(v/v)的比例混合初期三孢布拉霉(+)和(-)菌株，ix)用10-20％(v/v)的在段落viii中描述的三孢布拉霉(+)和(-)菌株的混合物接种每个发酵罐，x)将混合培养物在26℃下温育5-6天。
17.如权利要求16所要求的方法，其特征在于在5-6天生产至少3.6g/l番茄红素。
18.如权利要求17所要求的方法，其特征在于在5-6天每克干重的菌丝体生产至少30mg番茄红素。
19.如权利要求1至18中任何一项所要求的方法，其特征在于通过以约为1ml/g至10ml/g的醇/生物量比率再悬浮生物量于醇中来在步骤b中进行纯化。
20.如权利要求1至19中任何一项所要求的方法，其特征在于在步骤b中，在0℃和对应于它的沸点之间的温度，优选10℃至50℃下使用醇。
21.如权利要求1和4至18中要求的方法，其特征在于在步骤b中直接通过混合发酵培养基和醇进行纯化，所述发酵培养基/醇比率为1/0.5至1/5，优选1/1至1/3，温度为室温和所述混合物的沸点之间，优选在室温和60℃之间。
22.如权利要求1至21中任何一项所要求的方法，其特征在于在固体-液体提取的步骤d中使用酯类型的溶剂，优选乙酸乙酯，乙酸丙酯，乙酸异丙酯，乙酸正丁酯或乙酸异丁酯。
23.如权利要求22所要求的方法，其特征在于每克生物量使用约5-30ml的量的溶剂。
24.如权利要求22和23所要求的方法，其特征在于所述溶剂在接近它的沸点范围下，优选在50-80℃下使用。
25.如权利要求22和23所要求的方法，其特征在于以与所述番茄红素接触的时间小于15分钟这样的方式使用所述溶剂。
26.如权利要求1至25中任何一项所要求的方法，其特征在于在步骤f中，通过加入其中番茄红素具有低溶解度的溶剂进行提取后浓缩产品的沉淀，所述溶剂如甲醇，乙醇，丙醇或异丙醇，其确保伴随番茄红素的亲油特性的物质保持溶解。
27.如权利要求1至26中任何一项所要求的方法，如所要求的其中获得的产品是稳定的并可以“照现在的样子”以晶体形式搬运和销售。
28.如权利要求1至27中任何一项所要求的方法，其中所述配制阶段h由通过以适当比例预混合番茄红素，抗氧化剂和油来配制番茄红素的微晶混悬液，接着研磨组成。
29.如权利要求28所要求的方法，其中所用的油是来源于植物，优选来自向日葵，橄榄，玉米，棉籽或大豆。
30.如权利要求28和29所要求的方法，其特征在于研磨是在球磨中进行的。
31.如权利要求28至30所要求的方法，其特征在于使用脂溶性的抗氧化剂，优选天然生育酚，比例为相对于所述混合物中番茄红素重量的0.2-15％，优选0.5-5％。
32.如权利要求28至31中任何一项所要求的方法，其特征在于获得番茄红素在油中的微晶混悬液，晶体大小小于10微米，优选小于5微米，更优选小于2微米。
33.如权利要求1至27中任何一项所要求的方法，其中配制步骤h包含通过包含下列步骤的方法制备冷水可分散的(CWD)番茄红素I.将伴有抗氧化剂化合物的晶体番茄红素溶解在有机溶剂中，II.在改性淀粉的水溶液中乳化或微囊化上述有机相，III.通过蒸发消除所述溶剂和一些水，获得液体制剂，IV.干燥和修整。
34.如权利要求33所要求的方法，其特征在于在步骤I中将二氯甲烷用作溶解番茄红素的溶剂。
35.如权利要求33所要求的方法，其特征在于在溶解番茄红素的步骤I中将酰基酯用作溶剂，所述酰基酯特别是乙酸乙酯，乙酸丙酯，乙酸异丙酯，乙酸正丁酯或乙酸异丁酯。
36.如权利要求33至35所要求的方法，其特征在于在溶解番茄红素的步骤I中使用一种抗氧化剂或抗氧化剂的混合物，优选生育酚或棕榈酸抗坏血酸酯类型的抗氧化剂，比例为相对于所述番茄红素重量的1-30％，优选10-20％。
37.如权利要求33至36所要求的方法，其特征在于在溶解番茄红素于有机溶剂的步骤I中另外使用植物油。
38.如权利要求33至37所要求的方法，其特征在于在步骤II中将改性淀粉，优选酯类的形式和更优选琥珀酸辛烯酯，用作乳化剂或微囊化剂。
39.如权利要求33至38所要求的方法，其特征在于获得乳剂，其平均胶束大小小于10微米，优选小于2微米和更优选0.1-1微米。
40.如权利要求33至39所要求的方法，其特征在于通过选自以下各项的方法进行干燥液体制剂的步骤IV高温粉碎(雾化)，在相对低的温度下在流化床上粉碎(粒化)，或冷冻干燥。
41.如权利要求33至40所要求的方法，其特征在于在步骤IV中，修整由以0.5-10％的比例用糖或改性淀粉的水溶液涂布颗粒组成。
42.如在权利要求33至41中任何一项的方法所要求可以获得的制剂，其特征在于它由番茄红素在油中的微晶混悬液组成，晶体小于10微米，优选小于5微米和更优选小于2微米。
43.如在权利要求33至41中任何一项的方法所要求可以获得的制剂，其特征在于它由番茄红素微晶的颗粒组成，平均颗粒大小为100-2000微米，优选100-800微米和更优选100-300微米。
44.如在权利要求33至41中任何一项的方法所要求可以获得的制剂，其特征在于它由雾化的番茄红素微晶组成，平均颗粒大小为10-100微米。
45.如在权利要求33至41中任何一项的方法所要求可以获得的制剂，其特征在于它由雾化的番茄红素微晶的附聚物组成，平均颗粒大小为50-500微米，优选200-300微米。
46.如权利要求43至45中任何一项要求的制剂，其特征在于它用0.5-10％干重的糖或改性淀粉的水溶液涂布。
47.权利要求42的制剂作为着色剂的应用，特别是在食品，药物和化妆品领域中。
48.权利要求42的制剂作为食品添加剂的应用。
49.权利要求43至46的制剂的任何一种作为着色剂的应用，特别是在食品，药物和化妆品领域中。
50.权利要求43至46制剂的任何一种作为食品添加剂的应用。
全文摘要
使用选择的本发明所述三孢布拉霉菌株的发酵方法可以实现高于当前所述那些的番茄红素产率。分离，纯化和配制的方法可适用于任何天然来源的番茄红素，特别是布拉霉属，笄霉属，须霉属或毛霉属的毛霉真菌的浸没培养物。相对于先前所述方法，该提取方法可以简化回收步骤和提高产品的纯度。因为它们可以获得直接应用于食物和药物领域的稳定的番茄红素制剂，该配制方法提供了高的附加值。
文档编号A23L1/275GK1617934SQ02826536
公开日2005年5月18日 申请日期2002年12月20日 优先权日2001年12月31日
发明者安娜特雷莎·马科斯罗德里格斯, 安东尼奥·埃斯特雷利亚德卡斯特罗, 哈维尔·科斯塔佩雷斯, 曼努埃尔安东尼奥·奥利弗鲁伊斯, 涅韦斯·弗赖莱耶科拉, 胡安路易斯·德拉富恩特莫雷诺, 马尔塔·罗德里格斯赛斯, 布鲁诺·迭斯加西亚, 恩里克·佩罗塞松, 安赫尔·穆尼奥斯鲁伊斯, 瓦尔特·卡布里, 胡安弗朗西斯科·洛佩斯奥尔蒂斯, 何塞路易斯·巴雷多富恩特 申请人:维塔特内有限公司