专利名称：快速检测牙龈卟啉单胞菌致病岛基因型的多重pcr方法
技术领域：
本发明属于分子生物学技术领域，涉及一种常见的口腔病原菌牙龈卟啉单胞菌致病岛Rag基因4种基因型检测的多重PCR方法。
背景技术：
牙銀卟啉单胞菌(P. gingivalis, Pg)是革兰氏阴性专性厌氧菌,能分泌大量毒力因子导致牙周组织破坏，与慢性牙周炎、侵袭性牙周炎、牙周脓肿和牙髓感染以及伴发性全身性系统疾病密切相关。自1999年Curtis等发现Pg致病岛(pathogenicity islands)以来，人们对Pg的致病性有了进一步的认识，致病岛存在于强毒株中，一般弱毒株或无毒株中缺失。目前，rag基因座被确定是P. gingivalis的致病岛。实验证实，rag位点的失活会降低牙龈卟啉菌的致病性，减少其对牙周组织的破坏，rag位点在临床菌株中有4种不同的基因型，分别命名为rag-1、rag-2、rag-3和rag-4,不同基因型的致病能力亦不同,rag-1 型Pg对牙周软组织的破坏性最强，为高毒力基因型；为尽快确定临床菌株中Pg的致病岛基因型，有必要建立快速、敏感的检测方法同时检测临床标本中的rag基因型，以确定其对牙周组织的破坏能力，研究牙周病的发病机制、监测牙周病的病情变化、确定治疗方案。目前已有文献报道用PCR技术分别检测牙龈卟啉单胞菌及致病岛基因的研究报道，但每个反应只检测一种rag基因型，不能满足临床需要，而建立同时扩增四种rag基因型的多重PCR通过一次反应就可以鉴别出Pg的四种基因型的致病岛基因。
发明内容
本发明的目的是针对上述技术问题，提供一种多重PCR技术同时检测牙龈卟啉单胞菌四种rag基因型，仅通过一次PCR扩增就可鉴别出四种不同rag基因型，提高检测效率降低检测成本。多重PCR技术包括设计扩增Pg的4种rag基因型的特异引物，如下
mm賴(51 -3·)产窗长.度(bp；
rag-1 _I628-
5; 餘TCACAT組GAACGCT
I5’ hXTTTOTGCTTGTGACTTGC^
r-ag-2 I_____—__I9T9
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rag-3 I-................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................423
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I 5!儒GGTAMCCTCAOCAMTTIi
牙龈卟啉单胞菌的4种rag基因型特异基因的多重PCR快速检测方法，包括如下步骤I)扩增所用的DNA模板是用加热裂解法提取将标本离心，弃上清，于沉淀中加入裂解缓冲液，100°C水浴10 min，再离心，取上清作为模板，于-20°C保存；
所述裂解缓冲液为1.0mmol/L EDTA, 1.0% Triton X-100, 10mmol/LTris-HCl,pH8. 0。2)将未经稀释的4对引物的原始液混合后按I对引物稀释的量进行稀释，稀释后的弓I物作为应用液，计作Pm，将4种rag基因型的引物混合稀释后的弓I物计作pn ；
3)电泳检测鉴定。前面所述的多重PCR快速检测方法，优选的方案在于，步骤I)将标本离心时控制参数为12 000 r/min, 2 min,最大离心半径为6 cm。
前面所述的多重PCR快速检测方法，优选的方案在于，步骤2)反应体系
10XTransStart Taq Buffer2.5ul,
引物混合物(pn)2. Oul,
TransStart Taq DNA Polymerase O.5ul,dNTPsO.5ul,
模板 DNA5. Oul,
无菌双蒸水14. 5ul,
总体积为25μ1
前面所述的多重PCR快速检测方法，优选的方案在于，步骤2) PCR反应循环参数为94 0C 5min ；94°C 30sec,55°C 30sec,72°C 30sec，33 个循环；最后 72 °C 延伸 lOmin，取10μ1多重PCR反应产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测特异基因。所述多重PCR扩增口腔中的牙龈卟啉单胞菌不同rag基因型的特异基因，包括如下步骤
扩增所用的DNA模板是用加热裂解法提取，具体步骤如下
将收集的标本离心(12 000 r/min, 2 min,最大离心半径为6 cm),弃上清,于沉淀中加入裂解缓冲液，100°C水浴10 min，再离心(12 000 r/min，2min)，取上清作为模板，于_20°C保存备用。以上操作方法和实验试剂如无特别说明，均为本领域常规操作和市售试剂。
图I为通过本发明的检测技术得到的检测结果 其中，I) Marker 标记；2) rag-1 型；3) rag-1 型；4) rag-2 型；5) rag-1 型 +rag-4型；6) rag-3 型；7) rag-4 型。
具体实施例方式以下通过实例对本发明作进一步的描述。实施例
本发明涉及快速检测牙龈卟啉单胞菌4种rag基因型的多重PCR，该方法利用多重聚合酶链式反应(PCR)同步检测牙銀P卜啉单胞菌的4种rag基因型,步骤如下
(I)牙周袋及龈沟标本的采集采用无菌纸尖法从患者牙周袋或龈沟内分别采集标本，具体采集方法如下常规清水漱口后，生理盐水冲洗去除食物残渣，棉球隔湿，吹干，将无菌纸尖插入牙周袋内或龈沟内，当有阻力时停止插入，停留30s后取出，放入Iml PBS的EP管内，_20°C保存待测。(2)模板DNA的制备将标本离心(12 000 r/min, 2 min,最大离心半径为6 cm),弃上清，于沉淀中加入裂解缓冲液，100°c水浴10 min，再离心(12 000 r/min，2min)，取上清作为模板，于_20°C保存。(3)多重 PCR 反应
吸取14. 5μ1无菌去离子水加至微离心管中，再加入IOXTransStart Taq Buffer2. 5M-1, dNTPs O. 5M-1, TransStart Taq DNA Polymerase O. 5 μ1,引物混合液2· Ομ ,模板DNA
5.Ομ ，低速离心机离心混匀，放入PCR仪中，按照如下参数进行PCR扩增反应94°C 5min ；94°C 30sec,55°C 30sec,72°C 30sec，33 个循环；72°C延伸 IOmin ；
所用引物如下
序列(5S -3-,)I 严物长麼(bp)
rag—.1 __628
:5'僅OXTCACATAMCMCGCT-3,
rag-2 _—__979
5' -<tAOXTCACrCTTCAOTT
'...................................................................................................I..................................................................................................................................
rag-3 __423
_III—Li_
5，^XCGATC^AGTGATGMCAGA-cf
rag-4 _=__7395s nXCGCTAMCCTCAGCMATT'y
将未经稀释的4对引物的原始液混合后按I对引物稀释的量进行稀释，稀释后的引物作为应用液，计作Pm，将4种rag基因型的引物混合稀释后的引物计作pn。(4) PCR产物电泳检测
以TAE缓冲液配制2%琼脂糖凝胶溶液，加热溶解，待冷却至60°C左右时，加入溴化乙锭，使其终浓度为lKg/ml，充分混匀，倒入胶膜中，放好梳子，待胶凝固后，移去梳子，将凝胶放入电泳槽中，加入TAE缓冲液，使液面高出凝胶表面l_2mm ;再将PCR后的样品与上样缓冲液混合，用微量移液器将样品依次加入加样孔内，盖上电泳槽并通电，90V恒压电泳，使DNA向阳极方向移动，电泳约30min后，切断电源，取出凝胶，在紫外光下观察，图谱分析根据有无牙龈卟啉单胞菌及其4种rag基因型的多重PCR产物预期扩增片段来判断是否含有上述基因型。牙龈卟啉单胞菌4种rag基因型的多重PCR产物预期扩增片段长度分别为628bp、979bp、423bp 和 739bp。图I为通过本发明的检测技术得到的检测结果图，由此图可以看出，从Lane2到Lane7分别为6份临床标本的检测结果，其中，Lane2和3，扩增条带大小为628bp，都为rag-1 型；Lane4,为 rag-2, DNA 大小为 979bp ；Lane5,为 rag-1 与 rag-4 混合型，包括 628bp和739bp两条大小不等的条带；Lane6,为rag-3型,DNA大小为423bp ;Lane7,为rag-4型，DNA大小为739bp 。
权利要求
1.快速检测牙龈n卜啉单胞菌致病岛基因型的多重PCR方法，其特征在于，采用多重PCR同时检测牙銀fl卜啉单胞菌的四种致病岛基因型rag-l, rag-2, rag-3和rag-4。
2.根据权利要求I所述的多重PCR方法，其特征在于，按如下步骤 1)用加热裂解法提取扩增所用的DNA模板将标本离心，弃上清，于沉淀中加入裂解缓冲液，100°C水浴10 min，再离心，取上清作为模板，于-20°C保存； 2)所用引物如下:■_丨._ (.y O_'mm aP.)_ I S'-CGCQAeCCCGAAGGAAAMJHy rag-1I- 628i D^cAcacxrfrACmAAGAACGCT-J' ,I S^CTn-GCOSCTrGTGAOTGG- '， 38! 5^CCACCGTCA€CGTTCAD7TP3J _ I Si-CcggaacmiaaggccamSaaaga-J' fag ”3.I423j y-ACGCCA^TCaCCAAA^C^ 1 I 5、⑦m稱3MG1WGAACAGAJ rag-4I- 139 j S^CGCGCTAAACCT^G^Air^]4 将未经稀释的4对引物的原始液混合后按I对引物稀释的量进行稀释，稀释后的引物作为应用液，计作Pm，将4种rag基因型的引物混合稀释后的引物计作pn ； 3)电泳检测鉴定。
3.如权利要求2所述的的多重PCR方法，其特征在于，扩增所用的DNA模板是用加热裂解法提取，具体步骤如下将收集的标本离心(12 000 r/min，2 min，最大离心半径为6cm)，弃上清，于沉淀中加入裂解缓冲液，100°C水浴10 min，再离心(12 000 r/min,2min),取上清作为模板，于-20°C保存备用。
4.如权利要求2所述的多重PCR方法，其特征在于，按如下反应体系 IOXTransStart Taq Buffer2. 51^1, 引物混合液pn2. Ort,TransStart Taq DNA Polymerase 0. 5M-1,dNTPs0. 5m, 模板 DNA5. 0m, 无菌双蒸水14. 5W ；总体积为25耵。
5.如权利要求2所述的多重PCR方法，其特征在于，按以下反应参数94°C5min ；94°C30sec、55°C 30sec、72°C 30sec，33 个循环；最后 72°C延伸 lOmin，取 IOW 多重 PCR 反应产物进行1%琼脂糖凝胶电泳。
全文摘要
本发明涉及一种口腔常见病原菌牙龈卟啉单胞菌的4种rag基因型的多重PCR快速检测方法，属于分子生物学技术领域。利用多重PCR扩增口腔中牙龈卟啉单胞菌的4种rag基因型的特异基因，并利用电泳检测特异基因。本发明通过牙龈卟啉单胞菌的4种rag基因型的引物设计，使得多重PCR快速检测中反应条件一致，方法敏感、特异性强，能同时对临床标本中的四种rag基因型进行检测鉴定，准确的判断出不同Rag基因型的分布，大大提高了检测的速度和效率。
文档编号C12Q1/02GK102758020SQ20121027590
公开日2012年10月31日 申请日期2012年8月6日 优先权日2012年8月6日
发明者刘毅, 张玉杰, 王兆强, 肖水清 申请人:肖水清