一种用于牙垢标本的牙龈卟啉菌培养基的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种用于牙垢标本的牙龈卟啉菌培养基及其制备方法。其特征在于，配制1000ml培养基的配方中含有：麦芽浸粉；鸡蛋蛋白液；氯化血红素溶液；维生素K1乙醇溶液；枸橼酸镁；琼脂；共杀素；泰利霉素；利奈唑胺；天门冬素；蒸馏水加至1000ml。最佳优化配方制备方法为：取麦芽浸粉、鸡蛋蛋白液、氯化血红素、琼脂、枸橼酸镁、四水柠檬酸钙、共杀素、大蒜榨出汁、L-半胱氨酸溶于黄精水煮液中，混匀，定容，灭菌后分装。本发明与现有技术相比较，具有检出可靠、牙龈卟啉菌分离率高的特点。
【专利说明】一种用于牙垢标本的牙龈卟啉菌培养基
【技术领域】
[0001]本发明涉及检验微生物培养领域，具体涉及一种用于牙垢标本的牙龈卟啉菌培养基。
【背景技术】
[0002]牙周炎是口腔中的常见病和多发病，属于细菌感染性疾病。流行病学研究表明，牙銀口卜啉菌(Porphyromonas gingivalis,P.gingivalis)与牙周炎的发生、发展显著相关,是牙周炎的优势致病菌。牙周炎发病后期引起的牙龈萎缩、牙槽骨丧失一般难以再生，因此，牙周炎的早期诊断、P.gingivalis的早期检出至关重要。目前的P.gingivalis检验手段主要是銀下菌斑采样进行聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR),该种方法需要对样本进行DNA提取和PCR引物设计，且需要配备PCR相关仪器设备，成本昂贵，操作复杂。微生物培养是一种用人工方法使微生物生长繁殖的技术，而选择性培养基是用来促进或抑制一定类型的生物体(如细胞或细菌等)而设计的培养基，利用这种培养基可以将所需要的微生物从混杂的微生物中分离出来。人类口腔中寄居着500多种细菌，其中定植在龈下的就有300多种，正是由于这种复杂的样本环境，使得牙垢标本P.gingivalis的培养分离率低，口腔主流菌群中的链球菌、表皮葡萄球菌、奈瑟氏菌、乳杆菌、螺旋体、假丝酵母在目前的培养基中比牙龈卟啉菌生长更快，很快覆盖了培养基，牙龈卟啉菌无法生长。
【发明内容】
[0003]本发明的技术任务是针对以上现有技术的不足，提供一种能够用于牙垢标本的，对牙龈卟啉菌分离率高的培养基。
[0004]本发明解决其技术问题的技术方案是:一种用于牙垢标本的牙龈卟啉菌培养基，其特征在，配制1000ml培养基的配方中含有:麦芽浸粉15~30g ;鸡蛋蛋白液150~200ml ;浓度为5mg/ml的氯化血红`素溶液2.5ml ;浓度为10mg/ml的维生素Kl乙醇溶液
0.5ml ;枸橼酸镁0.1~0.4g ;琼脂15~20g ;共杀素15~20mg ;泰利霉素8~12mg ;利奈唑胺5~IOmg ;天门冬素3.6g ;四水柠檬酸钙0.01~0.2g ;蒸懼水加至1000ml。
[0005]优化方案中，每1000ml培养基还含有大蒜榨出汁0.05~0.5g。
[0006]优化方案中，每1000ml培养基还含有L-半胱氨酸0.01~0.lg。
[0007]优化方案中，每1000ml培养基还含有浓度200g/L的黄精水煮液200~300ml。
[0008]最优化方案中，每1000ml培养基还含有大蒜榨出汁0.05~0.5g ;L_半胱氨酸
0.01~0.1g ;浓度200g/L的黄精水煮液200~300ml。
[0009]一种用于牙垢标本的牙龈卟啉菌培养基的制备方法，其特征在于包括以下步骤:
[0010](I)取黄精加水煮沸I小时，过滤，取滤液，调整体积到浓度为200g/L，得黄精水煮液；
[0011](2)取去皮新鲜大蒜洗净后，粉碎机榨汁并过滤，得大蒜榨出汁；
[0012](3)取麦芽浸粉；鸡蛋蛋白液；氯化血红素溶液；维生素Kl乙醇溶液；枸橼酸镁；琼脂；共杀素；泰利霉素；利奈唑胺；天门冬素；四水柠檬酸钙；L-半胱氨酸及大蒜榨出汁溶于步骤I所得黄精水煮液中，混匀过滤后，蒸馏水定容，850C间歇灭菌2次，每次45min，灭菌后分装。
[0013]其中所述的麦芽浸粉提供碳氮源和能量；枸橼酸镁和四水柠檬酸钙为缓冲剂，并可以抑制杂菌生长；氯化血红素和维生素Kl为营养剂；琼脂是培养基的凝固剂；共杀素可以抑制革兰氏阳性菌蛋白质的合成，对于广泛耐药的革兰氏阳性菌也有效；泰利霉素对于奈瑟氏菌、乳杆菌、假丝酵母具有一定的抑菌作用；利奈唑胺对耐药性金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、酿脓链球菌、溶血性链球菌、肺炎链球菌、无乳链球菌和肠球菌属等均具有良好活性；天门冬素、L-半胱氨酸属氨基酸类，为营养剂；鸡蛋蛋白液含有各种多肽、脂肪、生长因子、激素等，这些物质对促进牙龈卟啉菌的繁殖和生长都是很重要的因素，此外鸡蛋蛋白液还具有维持培养基PH值恒定的作用。大蒜榨出汁所含的蒜酶、过氧化酶、磷酸酯酶及水解酶等，有氧化和水解作用，可以致使牙垢标本中的核梭杆菌、脆弱类杆菌胞壁消失或变薄，核糖体聚集成团块，最终导致细菌变形及破裂，达到抑制核梭杆菌、脆弱类杆菌的作用。黄精为百合科植物黄精、多花黄精和滇黄精的根茎，含有蔗糖、葡萄糖、叶酸、多种氨基酸等成分，可以提供能量代谢、细胞发育、新陈代谢因子，且水煮液对堇色毛癣菌、红色表皮癣菌、石膏样毛癣菌、考夫曼-沃尔夫氏表皮癣菌、螺旋体、疱疹病毒均有抑制作用。
[0014]本发明与现有技术相比较，具有检出可靠、牙龈卟啉菌分离率高的特点。
【具体实施方式】
[0015]以下结合实际情况，对本发明的【具体实施方式】作详细说明。
[0016]实施例1，配制 1000ml培养基的配方中含有:麦芽浸粉15g ;鸡蛋蛋白液150ml ;浓度为5mg/ml的氯化血红素溶液2.5ml ;浓度为10mg/ml的维生素Kl乙醇溶液0.5ml ;枸橼酸镁0.1g ;琼脂15g ;共杀素15mg ;泰利霉素8mg ;利奈唑胺IOmg ;天门冬素3.6g ;四水朽1檬酸钙0.2g ;蒸懼水加至1000ml。制备方法:取麦芽浸粉；鸡蛋蛋白液；氯化血红素溶液；维生素Kl乙醇溶液；枸橼酸镁；琼脂；共杀素；泰利霉素；利奈唑胺；天门冬素；四水柠檬酸钙溶于蒸馏水中，混匀，蒸馏水定容至1000ml，85°C间歇灭菌2次，每次45min，灭菌后分装。
[0017]实施例2，配制1000ml培养基的配方中含有:麦芽浸粉30g ;鸡蛋蛋白液200ml ;浓度为5mg/ml的氯化血红素溶液2.5ml ;浓度为10mg/ml的维生素Kl乙醇溶液0.5ml ;枸橼酸镁0.4g ;琼脂2(^ ;共杀素20mg ;泰利霉素12mg ;利奈唑胺5mg ;天门冬素3.6g ;四水朽1檬酸钙0.01g ;蒸懼水加至1000ml。制备方法:取麦芽浸粉；鸡蛋蛋白液；氯化血红素溶液；维生素Kl乙醇溶液；枸橼酸镁；琼脂；共杀素；泰利霉素；利奈唑胺；天门冬素；四水柠檬酸钙溶于蒸馏水中，混匀，蒸馏水定容至1000ml，85°C间歇灭菌2次，每次45min，灭菌后分装。
[0018]实施例3，配制1000ml培养基的配方中含有:麦芽浸粉15g ;鸡蛋蛋白液150ml ;浓度为5mg/ml的氯化血红素溶液2.5ml ;浓度为10mg/ml的维生素Kl乙醇溶液0.5ml ;枸橼酸镁0.1g ;琼脂15g ;共杀素15mg ;泰利霉素8mg ;利奈唑胺IOmg ;天门冬素3.6g ;四水朽1檬酸钙0.2g ;大蒜榨出汁0.05g，L-半胱氨酸0.1g ;蒸馏水加至1000ml。制备方法:取去皮新鲜大蒜洗净后，粉碎机榨汁并过滤，得大蒜榨出汁；取麦芽浸粉；鸡蛋蛋白液；氯化血红素溶液；维生素Kl乙醇溶液；枸橼酸镁；琼脂；共杀素；泰利霉素；利奈唑胺；天门冬素；四水柠檬酸钙；L-半胱氨酸；大蒜榨出汁溶于蒸馏水中，混匀，蒸馏水定容至1000ml，85°C间歇灭菌2次，每次45min，灭菌后分装。
[0019]实施例4，配制1000ml培养基的配方中含有:麦芽浸粉30g ;鸡蛋蛋白液200ml ;浓度为5mg/ml的氯化血红素溶液2.5ml ;浓度为10mg/ml的维生素Kl乙醇溶液0.5ml ;枸橼酸镁0.4g ;琼脂2(^ ;共杀素20mg ;泰利霉素12mg ;利奈唑胺5mg ;天门冬素3.6g ;四水朽1檬酸钙0.01g,大蒜榨出汁0.5g, L-半胱氨酸0.01g ;蒸懼水加至1000ml。制备方法:取去皮新鲜大蒜洗净后，粉碎机榨汁并过滤，得大蒜榨出汁；取麦芽浸粉；鸡蛋蛋白液；氯化血红素溶液；维生素Kl乙醇溶液；枸橼酸镁；琼脂；共杀素；泰利霉素；利奈唑胺；天门冬素；四水柠檬酸钙；L-半胱氨酸；大蒜榨出汁溶于蒸馏水中，混匀，蒸馏水定容至1000ml，85°C间歇灭菌2次，每次45min，灭菌后分装。
[0020]实施例5，配制1000ml培养基的配方中含有:麦芽浸粉25g ;鸡蛋蛋白液170ml ;浓度为5mg/ml的氯化血红素溶液2.5ml ;浓度为10mg/ml的维生素Kl乙醇溶液0.5ml ;枸橼酸镁0.3g ;琼脂18g ;共杀素18mg ;泰利霉素IOmg ;利奈唑胺8mg ;天门冬素3.6g ;四水朽1檬酸钙0.1g,大蒜榨出汁0.3g, L-半胱氨酸0.05g ;蒸懼水加至1000ml。制备方法:取去皮新鲜大蒜洗净后，粉碎机榨汁并过滤，得大蒜榨出汁；取麦芽浸粉；鸡蛋蛋白液；氯化血红素溶液；维生素Kl乙醇溶液；枸橼酸镁；琼脂；共杀素；泰利霉素；利奈唑胺；天门冬素；四水柠檬酸钙；L-半胱氨酸；大蒜榨出汁溶于蒸馏水中，混匀，蒸馏水定容至1000ml，85°C间歇灭菌2次，每次45min，灭菌后分装。
[0021]实施例6，配制1000ml培养基的配方中含有:麦芽浸粉15g ;鸡蛋蛋白液150ml ;浓度为5mg/ml的氯化血红素溶液2.5ml ;浓度为10mg/ml的维生素Kl乙醇溶液0.5ml ;枸橼酸镁0.1g ;琼脂15g ;共杀素15mg ;泰利霉素8mg ;利奈唑胺IOmg ;天门冬素3.6g ;四水朽1檬酸钙0.2g，大蒜榨出汁0.05g，L-半胱氨酸0.lg，浓度200g/L的黄精水煮液200ml ;蒸馏水加至1000ml。制备方法:
[0022](I)取黄精加水煮沸I小时，过滤，取滤液，调整体积到浓度为200g/L，得黄精水煮液；
[0023](2)取去皮新鲜大蒜洗净后，粉碎机榨汁并过滤，得大蒜榨出汁；
[0024](3)取麦芽浸粉；鸡蛋蛋白液；氯化血红素溶液；维生素Kl乙醇溶液；枸橼酸镁；琼脂；共杀素；泰利霉素；利奈唑胺；天门冬素；四水柠檬酸钙；L-半胱氨酸及大蒜榨出汁溶于步骤I所得黄精水煮液中，混匀过滤后，蒸馏水定容，85 0C间歇灭菌2次，每次45min，灭菌后分装。
[0025]实施例7，配制1000ml培养基的配方中含有:麦芽浸粉30g ;鸡蛋蛋白液200ml ;浓度为5mg/ml的氯化血红素溶液2.5ml ;浓度为10mg/ml的维生素Kl乙醇溶液0.5ml ;枸橼酸镁0.4g ;琼脂2(^ ;共杀素20mg ;泰利霉素12mg ;利奈唑胺5mg ;天门冬素3.6g ;四水朽1檬酸钙0.01g，大蒜榨出汁0.5g，L-半胱氨酸0.01g，浓度200g/L的黄精水煮液300ml ;蒸馏水加至1000ml。制备方法:
[0026](I)取黄精加水煮沸I小时，过滤，取滤液，调整体积到浓度为200g/L，得黄精水煮液；
[0027](2)取去皮新鲜大蒜洗净后，粉碎机榨汁并过滤，得大蒜榨出汁；
[0028](3)取麦芽浸粉；鸡蛋蛋白 液；氯化血红素溶液；维生素Kl乙醇溶液；枸橼酸镁；琼脂；共杀素；泰利霉素；利奈 唑胺；天门冬素；四水柠檬酸钙；L-半胱氨酸及大蒜榨出汁溶于步骤I所得黄精水煮液中，混匀过滤后，蒸馏水定容，85 0C间歇灭菌2次，每次45min，灭菌后分装。
[0029]实施例8，配制1000ml培养基的配方中含有:麦芽浸粉25g ;鸡蛋蛋白液170ml ;浓度为5mg/ml的氯化血红素溶液2.5ml ;浓度为10mg/ml的维生素Kl乙醇溶液0.5ml ;枸橼酸镁0.3g ;琼脂18g ;共杀素18mg ;泰利霉素IOmg ;利奈唑胺8mg ;天门冬素3.6g ;四水朽1檬酸钙0.lg，大蒜榨出汁0.3g，L-半胱氨酸0.05g，浓度200g/L的黄精水煮液250ml ;蒸馏水加至1000ml。制备方法:
[0030](I)取黄精加水煮沸I小时，过滤，取滤液，调整体积到浓度为200g/L，得黄精水煮液；
[0031](2)取去皮新鲜大蒜洗净后，粉碎机榨汁并过滤，得大蒜榨出汁；
[0032](3)取麦芽浸粉；鸡蛋蛋白液；氯化血红素溶液；维生素Kl乙醇溶液；枸橼酸镁；琼脂；共杀素；泰利霉素；利奈唑胺；天门冬素；四水柠檬酸钙；L-半胱氨酸及大蒜榨出汁溶于步骤I所得黄精水煮液中，混匀过滤后，蒸馏水定容，850C间歇灭菌2次，每次45min，灭菌后分装。
[0033]所述的黄精水煮液浓度为200g/L，指的是每升黄精水煮液中含有生药200g。
[0034]本发明所得牙龈卟啉菌培养基用于牙垢标本具有检出可靠、牙龈卟啉菌分离率高的特点，为临床资料充分证 明，有关资料如下。
[0035]I对象与方法
[0036]1.1培养基制备:共设4组，分别为实施例8方案组、实施例5方案组、实施例2方案组和对照组,对照组为巧克力琼脂培养基。
[0037]1.2龈下菌斑采集培养方法:隔湿唾液，龈上刮治器去除龈上牙石，碘酊消毒后，用无菌Gracey刮治器采集2颗下颌中切牙唇侧近中至远中的龈下菌斑。将采集的菌斑悬浮于Iml生理盐水，用接种环分区划线接种，厌氧环境下37°C培养24h，挑取细小菌落进行菌属鉴定。
[0038]1.3统计学分析用SPSS 13.0进行统计分析，P < 0.05表示有显著性意义。
[0039]2结果:在84份经由PCR确定牙龈卟啉菌阳性的牙垢标本，细菌培养分离并鉴定为牙龈卟啉菌的，实施例8方案组为79例，实施例5方案组为78例，实施例2方案组为74例，对照组巧克力琼脂培养基为24例，经统计学处理，本发明各实施例组与对照组比较具有明显差异(P <0.001)。结果表明，本发明实施例牙龈卟啉菌分离率明显高现有的培养基。
【权利要求】
1.一种用于牙垢标本的牙龈卟啉菌培养基，其特征在，配制1000ml培养基的配方中含有: 麦芽浸粉15~30g ； 鸡蛋蛋白液150~200ml ； 浓度为5mg/ml的氯化血红素溶液2.5ml ； 浓度为10mg/ml的维生素Kl乙醇溶液0.5ml ； 共杀素15~20mg ； 泰利霉素8~12mg ； 利奈唑胺5~IOmg ; 天门冬素3.6g ； 四水柠檬酸钙0.01~0.2g ; 蒸馏水加至1000ml。
2.根据权利要求1所述的一种用于牙垢标本的牙龈卟啉菌培养基，其特征在于每1000ml培养基还含有大蒜榨出汁0.05~0.5g。
3.根据权利要求1所述的一种用于牙垢标本的牙龈卟啉菌培养基，其特征在于每1000ml培养基还含有L-半胱氨酸0.01~0.lg。
4.根据权利要求1所述的一种用于牙垢标本的牙龈卟啉菌培养基，其特征在于每1000ml培养基还含有浓度200g/L的黄精水煮液200~300ml。
5.根据权利要求1所述的一种用于牙垢标本的牙龈卟啉菌培养基，其特征在于每1000ml培养基还含有大蒜榨出汁0.05~0.5g ；L-半胱氨酸0.01~0.1g ;浓度200g/L的黄精水煮液200~300ml。
【文档编号】C12Q1/04GK103789390SQ201210595171
【公开日】2014年5月14日 申请日期:2012年12月24日 优先权日:2012年12月24日
【发明者】武改莲 申请人:武改莲