一种改良藻类性状的方法

一种改良藻类性状的方法
【专利摘要】本发明涉及一种改良藻类性状的方法，首次揭示一种以提高藻类光能利用效率为目的的改良藻类的新方法，所述方法通过在藻类中表达光能吸收和传递蛋白(Light?EnergyAbsorption?and?Transduction?protein，LEAT蛋白)，拓展对太阳光能利用的光谱范围，提高藻类光利用效率。
【专利说明】一种改良藻类性状 的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物【技术领域】；更具体地，本发明涉及一种改良藻类性状的方法。
【背景技术】
[0002]光合作用是地球上最重要的化学反应，光合生物通过光合作用将光转化为可为人类直接利用的稳定的化学能形式，并提供了人类生存所需的氧气和食物。在当今全球人口增加、粮食危机、能源危机的背景下，发现提高光合生物的光利用效率的新途径具有重要的意义。
[0003]多年来，人们尝试各种手段提高光合生物光合作用效率，主要的策略包括降低光呼吸损失，增加Rubisco羧化与氧化反应比值，改造C3植物成为C4植物等等。这些策略都是集中于改良影响光合效率的某个方面。目前尚无一种途径被完全证实可以有效提高光能利用效率。鉴于光合机构运转模式在各种植物间非常保守，一旦一种提高光能利用效率的途径得到充分验证，其有巨大潜力可以在不同光合生物中得到应用。
[0004]微藻类能够利用太阳能将水和二氧化碳转化为生物质能，许多微藻富含油脂，并且可以通过目前现有的技术转化为生物柴油。某些微藻的含油量可超过其干重的80%，与微藻形成对照，油料作物如大豆和棕榈等的产油率在5%以下，此外，食用油需要和石油混合才能作为生物柴油使用，所以不能完全代替石油。大约有300种藻类，被认为是适合生物柴油生产，意味着油脂生产生物柴油的来源不必再靠陆地植物栽培。因此，微藻油将是一种完全可以替代石油的生物柴油，具有广阔的应用前景和具有巨大的经济和社会效益
[0005]然而，目前来自微藻的生物质能远远不能满足现实能源的需求，主要问题是生物质的生产效率仍然很低，原因是光合作用效率低。虽然在一般条件下阳光与光合作用所需要的原料水和二氧化碳并不缺乏，可是由于种种内外原因，光合生物利用太阳能的效率很低，据估计温带地区光合生物光合作用的转化率按全年平均计算约为太阳全部辐射能的0.5%-2.5%，整个生物圈的平均转化率可达3%-5%。在提供理想的环境与条件下，光合作用的最高效率可达8~15%。因此，如何提高光能利用率是未来进一步提高能源植物产量的重大突破口。
[0006]因此，本领域迫切需要研究和开发提高光合生物特别是藻类的光利用效率的新方法，以培育出光能利用效率高的光合生物。

【发明内容】

[0007]本发明的目的在于提供一种改良藻类性状的方法。
[0008]在本发明的第一方面，提供一种改良藻类性状的方法，包括以下步骤:1)将一种或多种编码光能吸收和传递蛋白(LEAT蛋白)的多核苷酸转化进入藻类；2)从转化后的藻类中选择出相较对照藻类而言性状获得改良的藻类；上述光能吸收和传递蛋白是能够利用光能催化水的裂解和2，3，5-三甲基-1，4-对苯醌的还原的蛋白。
[0009]在一个优选例中，所述的编码光能吸收和传递蛋白的多核苷酸选自下组:(a)编码荧光蛋白或其经一个或多个(如1-30个；较佳地1-20个；更佳地1-10个；更佳地1-5个)氨基酸位点突变后荧光强弱或荧光发射光谱发生变化的，但依然能够利用光能催化水的裂解和2，3，5-三甲基-1，4-对苯醌的还原的突变体蛋白的多核苷酸；或(b)编码非荧光生色蛋白(non-fluorescent chromoprotein)或其经一个或多个(如1-30个；较佳地1-20个；更佳地1-10个；更佳地1-5个)氨基酸位点突变后但依然能够利用光能催化水的裂解和2，3，5-三甲基-1，4-对苯醌的还原的突变体蛋白的多核苷酸。
[0010]在另一优选例中，所述的编码荧光蛋白或其经一个或多个(如1-30个；较佳地1-20个；更佳地1-10个；更佳地1-5个)氨基酸位点突变后荧光强弱或荧光发射光谱发生变化的，但依然能够利用光能催化水的裂解和2，3，5-三甲基-1，4-对苯醌的还原的突变体蛋白的多核苷酸选自下组:
[0011](a)编码SEQ ID N0:4所示氨基酸序列的蛋白的多核苷酸；
[0012](b)编码SEQ ID NO: 10所示氨基酸序列的蛋白的多核苷酸；
[0013](c)编码SEQ ID NO:36所示氨基酸序列的蛋白(efasCFP)的多核苷酸；
[0014](d)编码SEQ ID N0:6所示氨基酸序列的蛋白的多核苷酸；
[0015](e)编码SEQ ID NO:28所示氨基酸序列的蛋白的多核苷酸；
[0016](f)编码SEQ ID NO:40所示氨基酸序列的蛋白(scubGFP)的多核苷酸；
[0017](g)编码SEQ ID N O:44所示氨基酸序列的蛋白(rmueGFP)的多核苷酸；
[0018](h)编码SEQ ID NO:52所示氨基酸序列的蛋白(cpGFP)的多核苷酸；
[0019](i)编码SEQ ID NO:8所示氨基酸序列的蛋白(YFP)的多核苷酸；
[0020](j)编码SEQ ID NO: 12所示氨基酸序列的蛋白(YFPmu2)的多核苷酸；
[0021](k)编码SEQ ID NO: 14所示氨基酸序列的蛋白(YFPmu4)的多核苷酸；
[0022](I)编码SEQ ID NO: 16所示氨基酸序列的蛋白(YFPmu7)的多核苷酸；
[0023](m)编码SEQ ID NO: 18所示氨基酸序列的蛋白(YFPl232h)的多核苷酸；
[0024](η)编码SEQ ID NO:20所示氨基酸序列的蛋白(YFPl232q)的多核苷酸；
[0025](ο)编码SEQ ID NO:50所示氨基酸序列的蛋白(phiYFP)的多核苷酸；
[0026](P)编码SEQ ID N0:2所示氨基酸序列的蛋白(mCherry)的多核苷酸；
[0027](q)编码SEQ ID NO:22所示氨基酸序列的蛋白(mCherrymu3)的多核苷酸；
[0028](r)编码SEQ ID NO:24所示氨基酸序列的蛋白(mCherrymu4)的多核苷酸；
[0029](s)编码SEQ ID NO:26所示氨基酸序列的蛋白(mCherrymu5)的多核苷酸；
[0030](t)编码SEQ ID NO:30所示氨基酸序列的蛋白(eqFP611)的多核苷酸；
[0031](u)编码SEQ ID NO:34所示氨基酸序列的蛋白(eforCP/RFP)的多核苷酸；
[0032](V)编码SEQ ID NO:42所示氨基酸序列的蛋白(rf1RFP)的多核苷酸；
[0033](w)编码SEQ ID N0:46所示氨基酸序列的蛋白(ceriantRFP)的多核苷酸；
[0034](x)编码SEQ ID NO:32所示氨基酸序列的蛋白(hcriCP)的多核苷酸；
[0035](y)编码SEQ ID N0:48所示氨基酸序列的蛋白(anm2CP)的多核苷酸；
[0036](z)编码SEQ ID NO:56所示氨基酸序列的蛋白(YFP1^1)的多核苷酸；
[0037](aa)编码SEQ ID NO:58所示氨基酸序列的蛋白(GFP1.)的多核苷酸；
[0038](ab)编码(a)至(aa)任一所示氨基酸序列经过一个或多个(如1_30个；较佳地1-20个；更佳地1-10个；更佳地1-5个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且能够利用光能催化水的裂解和2，3，5-三甲基-1，4-对苯醌的还原的蛋白的多核苷酸；
[0039](ac)编码与(a)至(aa)任一氨基酸序列的蛋白的序列同源性高于70% (更佳地高于80% ;更佳地高于90% ;更佳地高于95% ;更佳地高于98% ;更佳地高于99%)，且能够利用光能催化水的裂解和2，3，5-三甲基-1，4-对苯醌的还原的蛋白的多核苷酸；或
[0040](ad)与上述(a)-(ac)任一所述多核苷酸互补的多核苷酸。
[0041]在另一优选例中，所述的编码荧光蛋白或其经一个或多个(如1-30个；较佳地1-20个；更佳地1-10个；更佳地1-5个)氨基酸位点突变后荧光强弱或荧光发射光谱发生变化的，但依然能够利用光能催化水的裂解和2，3，5-三甲基-1，4-对苯醌的还原的突变体蛋白的多核苷酸选自下组:
[0042](a)如SEQ ID NO:3所示核苷酸序列的多核苷酸；
[0043](b)如SEQ ID N0:9所不核苷酸序列的多核苷酸；
[0044](c)如SEQ ID NO:35所示核苷酸序列的多核苷酸；
[0045](d)如SEQ ID NO:5所不核苷酸序列的多核苷酸；
[0046](e)如SEQ ID NO:27所示核苷酸序列的多核苷酸；
[0047](f)如SEQ ID NO:39所示核苷酸序列的多核苷酸；
[0048](g)如SEQ ID NO:43所示核苷酸序列的多核苷酸；
[0049](h)如SEQ ID NO:51所不核苷酸序列的多核苷酸；
[0050](i)如SEQ ID NO:7所示核苷酸序列的多核苷酸；
[0051](j)如SEQ ID NO: 11所示核苷酸序列的多核苷酸；
[0052](k)如SEQ ID NO: 13所示核苷酸序列的多核苷酸；
[0053](I)如SEQ ID NO: 15所不核苷酸序列的多核苷酸；
[0054](m)如SEQ ID NO: 17所示核苷酸序列的多核苷酸；
[0055](η)如SEQ ID NO: 19所示核苷酸序列的多核苷酸；
[0056](ο)如SEQ ID NO:49所不核苷酸序列的多核苷酸；
[0057](P)如SEQ ID NO:1所不核苷酸序列的多核苷酸；
[0058](q)如SEQ ID NO:21所示核苷酸序列的多核苷酸；
[0059](r)如SEQ ID NO:23所示核苷酸序列的多核苷酸；
[0060](s)如SEQ ID NO:25所不核苷酸序列的多核苷酸；
[0061](t)如SEQ ID NO:29所示核苷酸序列的多核苷酸；
[0062](u)如SEQ ID NO:33所示核苷酸序列的多核苷酸；
[0063](V)如SEQ ID NO:41所不核苷酸序列的多核苷酸；
[0064](w)如SEQ ID NO:45所不核苷酸序列的多核苷酸；
[0065](χ)如SEQ ID NO:31所示核苷酸序列的多核苷酸；
[0066](y)如SEQ ID N0:47所不核苷酸序列的多核苷酸；
[0067](z)如SEQ ID NO:55所不核苷酸序列的多核苷酸；
[0068](aa)如SEQ ID NO:57所不核苷酸 序列的多核苷酸；或
[0069](ab)与(a)-(aa)任一所述的多核苷酸互补的多核苷酸。
[0070]在另一优选例中，所述的编码非荧光生色蛋白或其经一个或多个(如1-30个；较佳地1-20个；更佳地1-10个；更佳地1-5个)氨基酸位点突变后依然能够利用光能催化水的裂解和2，3，5-三甲基-1，4-对苯醌的还原的突变体蛋白的多核苷酸选择下组:
[0071](a) SEQ ID NO:38所示氨基酸序列的蛋白(spisCP)；
[0072](b)将(a)所示氨基酸序列经过一个或多个(如1-30个；较佳地1_20个；更佳地1-10个；更佳地1-5个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且能够利用光能催化水的裂解和2，3，5-三甲基-1，4-对苯醌的还原的蛋白；
[0073](c)与(a)所示氨基酸序列的蛋白的序列同源性高于70%(更佳地高于80% ;更佳地高于90% ;更佳地高于95% ;更佳地高于98% ;更佳地高于99%)，且能够利用光能催化水的裂解和2，3，5-三甲基-1，4-对苯醌的还原的蛋白；或
[0074](d)与(a)-(c)任一所述多核苷酸互补的多核苷酸。
[0075]在另一优选例中，所述的编码非荧光生色蛋白或其经一个或多个(如1-30个；较佳地1-20个；更佳地1-10个；更佳地1-5个)氨基酸位点突变后依然能够利用光能催化水的裂解和2，3，5-三甲基-1，4-对苯醌的还原的突变体蛋白的多核苷酸选自下组:
[0076](a)如SEQ ID NO:37所示核苷酸序列的多核苷酸；或
[0077](b)与(a)所述的多核苷酸互补的多核苷酸。 [0078]在另一优选例中，所述的编码光能吸收和传递蛋白的多核苷酸还选自:编码选自下列 GenBank 登录号的蛋白的多核苷酸:AF168421、AY646070、AY646072、AY646071、AF168424、AF168420、AY182022、AY182023、DQ206381、DQ206392、DQ206382、AY181556、AY679113、EU498721、AY182017、AY646069、AY646066、AY151052、EU498722、AY647156、AY508123、AY508124、AY508125、AF435432、AY646067、AY485334、AY485335、AY646068、AF545827、AF545830、AY037776、AB180726、DQ206383、DQ206395、DQ206396、DQ206385、EU498723、AB193294、AY182020、AY182021、AB107915、DQ206389、P42212、AY268073、AY181553、AY181554、AY181555、DQ206393、AY155344、AY037766、AY679112、AF401282、EU498724、AY268076、AY268074、AY268075、AY268071、AY268072、DQ206391、AY015995、AY182014、AF372525、EU498725、DQ206390、AF168422、AY646073、AY296063、AF272711、AB128820、DQ206379、DQ206380、AF168419、AY059642、EF186664、AF420591、DQ206387、AY182019、AY765217、AB085641、AY181552、DQ206386、AY182013、AY646064、AY485333、AF168423、AY646077、AY646076、AY646075、EF587182、AF363775、AF383155、DQ206394、DQ206376、AF38315、AF363776、AY461714、AB209967、DQ206377、DQ206378 ;或上述蛋白经一个或多个氨基酸位点突变后荧光强弱或荧光发射光谱发生变化的，但依然能够利用光能催化水的裂解和2，3，5-三甲基-1，4-对苯醌的还原的突变体蛋白。
[0079]在另一优选例中，所述将多核苷酸转化入藻类方法包括:将含有编码光能吸收和传递蛋白的多核苷酸的表达盒转入藻类中，从而在藻类中表达上述多核苷酸。较佳地，所述的表达盒包括:至少一种(可以是一种或多种)编码光能吸收和传递蛋白的多核苷酸；所述的编码光能吸收和传递蛋白的多核苷酸与表达调控元件可操作性相连。
[0080]在另一优选例中，所述的光能吸收和传递蛋白的多核苷酸通过同源重组的方式转化进入藻类；更佳地，使得光能吸收和传递蛋白的多核苷酸整合到植物类囊体膜上。
[0081]在另一优选例中，所述的改良藻类性状选自下列一种或几种:提高藻类的生物量；促进藻类生长；提高藻类的光利用效率；增加藻类PSI或PSII的光化学效率；增加藻类光合电子传递效率；提高藻类对CO2的同化能力；提高藻类的净光合效率；提高藻类的光合器官的光保护能力；提高藻类中光合辅助色素(包括类胡萝卜素)的含量；或提高藻类的光合放氧速率。
[0082]在另一优选例中，所述的藻类是真核藻类或原核藻类。
[0083]所述的藻类含有光合机构或含有叶绿素。
[0084]在另一优选例中，所述的藻类是微藻；更佳地，所述的微藻选自:蓝藻门、绿藻门、金藻门、红藻门、裸藻门、甲藻门、隐藻门、金黄藻门、褐藻门或轮藻门。
[0085]在本发明的另一方面，提供光能吸收和传递蛋白或编码光能吸收和传递蛋白的多核苷酸的用途，用于改良藻类性状。
[0086]在一个优选例中，所述的光能吸收和传递蛋白选自:荧光蛋白或非荧光生色蛋白。
[0087]在本发明的另一方面，提供一种改良的藻类，其基因组中包括光能吸收和传递蛋白的表达盒。较佳地，所述的改良的藻类是转基因藻类，其通过前述任一种方法制备获得。
[0088]在本发明的另一方面，提供一种藻类，所述藻类的细胞中含有外源的一种或多种编码光能吸收和传递蛋白的多核苷酸。
[0089]在另一优选例中，所述的藻类为非植物的藻类。
[0090]本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
【专利附图】

【附图说明】
[0091]图1、光照对YFP还原NAD+或NADP+的影响。图中所示为开光前后NADH和NADPH在340nm处吸收值的变化。
[0092]图2、YFP，CFP，BFP和GFP光下催化2，3，5_三甲基-1, 4_对苯醌(TMBQ)的还原活力的比较。50mM的磷酸缓冲液(pH6.5)，了1^0，40(^11，荧光蛋白浓度为251^。还原速率在1-2μηιο1 IrTiV1各自激发光下测定。
[0093]图3、TMBQ存在条件下YFP和GFP催化水裂解放氧的光强响应曲线。TMBQ:2，3，5-三甲基-1，4-对苯醌；反应速率以每个蛋白分子每分钟转换的分子数表示。反应体系为:50mM 的磷酸缓冲液(pH6.5)，YFP，10nM(终浓度，下同);GFP，I μ M ;TMBQ，400 μ M，;光强:0.6-1 μ mo I m 2S、
[0094]图4、TMBQ存在条件下mCherry和GFP光下催化水裂解放氧活力的光强响应曲线。TMBQ:2，3，5-三甲基-1,4-对苯醌；反应体系为:50mM的磷酸缓冲液(ρΗ6.5)，mCherry,10nM;GFP，lyM;TMBQ，400yM;光强:0.6-1 μ mo I nT2s'
[0095]图5、荧光蛋白GFP，YFP，CFP和BFP放氧活力的TMBQ浓度响应曲线。50mM的磷酸缓冲液(pH6.5)，GFP，I μ M ;其他荧光蛋白，10nM，TMBQ，400 μ M ;光强:0.6-1 μ mo I nT2s'
[0096]图6、不同醌存在条件下YFP⑷和mCherry⑶的光下催化水裂解放氧活力的比较。BQ: 1,4-对苯醌;MBQ:甲基-1,4-对苯酉昆；DMBQ1:2，5-二甲基-1，4-对苯醌；DMBQ2:2，6-二甲基-1,4-对苯醌；TMBQ:2, 3，5-三甲基-1，4-对苯醌；DQ:杜醌或四甲基_1，4-对苯醌；UQ:2, 3-甲氧基-5-甲基-1，4-对苯醌。反应体系为:50mM磷酸缓冲液，pH6.5 ；YFP,IOnM ；mCherry, 5nM ;光强:0.6-1 μ mo I m 2s、
[0097]图7、YFP(A, B)和mCherry (E，F)及其突变体的吸收光谱，(B)为A图中YFPmu4和YFPmu7部分的放大；(F)为E图中mCherrymu4和mCherrymu7部分的放大。YFP(C)和mCherry (G)及其突变体的荧光光谱；YFP (D)和mCherry (H)与其突变体的在光下裂解水放氧活力。(A，B，C，E，F，G):光吸收和荧光强度在相同蛋白浓度下进行比较，以突变前的YFP或mCherry的吸收峰值的强度为1，荧光发射峰值的强度为100。
[0098]图8、GFP系列不同荧光蛋白序列比较。
[0099]图9、(A)YFP蛋白232位氨基酸点突变及231位后末端去除的突变蛋白光下放氧活力的比较。(B)GFP蛋白与其231位后末端去除的点突变光下放氧活力的比较。YFP的L232H和GFP蛋白浓度为I μ M，其他蛋白浓度为10nM，TMBQ浓度为400 μ M，在1_2μπιο1HT2s-1激发光下测定。
[0100]图10、(A)细胞色素f (Cytf)和质蓝色(PC)浓度依赖的、质醌类似物2，3，5_三甲基(PQ)介导的YFP对Cytf和PC的光下还原。在没有添加PQ的条件下，YFP在光下不能催化无论是细胞色素f还是质蓝素的还原；(B)YFP光下催化PQ介导的细胞色素f和质蓝素还原的光响应曲线。
[0101]图11、CFP、GFP、mCherry、YFP及YFP点突变体光下催化PQ介导的细胞色素f(A和B)和质蓝素(C和D)还原活性的比较。
[0102]图12、110种刺胞动物(Cnidarian)和节足动物(Arthropoda)来源突光蛋白和非荧光生色蛋白进化树(摘自Alieva et al.，2008)。图中黑点表示在本发明中所选用的荧光蛋白。这些荧光蛋白在进化树上分别属于A，B, C，D等不同的分枝。
[0103]图13、(A)本发明所用的所有LEAT蛋白的系统进化树。(B)本发明所用的所有LEAT蛋白的序列同源性比较，其中I对应eqFP611、2对应hcriCP，依次类推。
[0104]图14、(A)PsbC-荧光蛋白融合基因蓝藻转化质粒构建示意图。将YFP片段插入PsbC基因的C末端，构建了用于转化蓝藻的PPsbC-YFP质粒。箭头所示为克隆是使用的酶切位点。Sp (Streptomycin)表示链霉素抗性标记。(B)PsbC-YFP融合基因整合情况。利用自然转化方法将PPsbC-YFP质粒对蓝藻细胞进行转化，然后在含有相应的抗生素的琼脂平板上画线，放在蓝藻的培养箱中培养，获得转化的克隆后，进行PCR鉴定，在含有100μ g/ml链霉素的培养基中进行多于三代的培养，以便将野生型的背景清除，最后将细胞转入含有20μ g/ml链霉素中培养。图为PsbC-YFP转基因蓝藻的PCR鉴定。上方箭头所示的2.7kb片段为插入的目的基因(psbC-YFP)加上抗性基因的片段，下方箭头所示的1.0kb片段为PsbC基因。
[0105]图15、转基因蓝藻PsbC-YFP类囊体膜时间依赖的绿光诱导的远红光关闭后的细胞色素f和质蓝素的氧化还原动力学变化。黑色线为野生型；红色线为PsbC-YFP。(A)绿光诱导的远红光关闭后的细胞色素f的氧化还原动力学变化(以554.5nm光吸收变化为指标)，即554.5nm光吸收增加表示细胞色素的还原；(B)绿光诱导的远红光关闭后的质蓝素的氧化还原动力学变化(以598nm光吸收变化为指标)，598nm光吸收的减少为质蓝素的还原。由于原核光合生物蓝藻的光合电子传递链和呼吸电子传递链共用质醌，这两条途径是相互依存相互制约的关系。在 正常条件下，由于来自呼吸基质的电子对质醌库的还原，细胞色素f和质蓝素等电子递体处于还原状态，必须使用远红光激发光系统I将质醌库氧化，排空电子后，才能观察到光诱导的电子递体的氧化还原动力学的变化。与野生型相比，YFP的转基因蓝藻的细胞色素f呈现先被氧化后被还原的变化，而质蓝素则呈现先被还原后被氧化的变化，这是由于远红光关闭后，积累在质醌库的电子继续向这两个电子递体传递的结果，另外，质蓝素是移动的电子递体，它氧化细胞色素f的反应是迅速的，使得这两个电子递体呈现相反的氧化还原趋势。这些氧化还原动力学的变化均被其激发光——520nm的绿光所促进，说明了 YFP能够光还原质醌，进而向细胞色素f和质蓝素等电子递体提供电子。
[0106]图16、绿光诱导转基因蓝藻活体细胞的光合放氧。由于在原核光合生物蓝藻中，光合电子传递链和呼吸电子传递链共用质醌，它们是相互依存相互制约的关系。在暗中，来自呼吸底物NAD (P) H的电子经由质醌还原氧分子，表现出吸氧反应，而在光下，积累在质醌库的电子就会传递给光系统I，引起光系统II的放氧反应。在没有添加抑制剂的条件下，野生型及转基因蓝藻细胞PsbC-YFP都显示暗中吸氧呼吸作用，当给细胞照射520nm的绿光后，PsbC-YFP的吸氧被抑制，但野生型细胞的吸氧没有受到影响；在呼吸电子传递链NDH的抑制剂氯化汞的存在下，呼吸作用的吸氧被抑制，PsbC-YFP表现出绿光诱导的放氧反应，而野生型没有绿光诱导的放氧活性。这进一步证明了 YFP可以作为一种类似叶绿素a的天线色素和反应中心色素，将其吸收的绿光能量转化为化学能，参与光合作用。
[0107]图17、转基因蓝藻的光合能力比较。(A)激发能分配即状态转换的变化程度；(B)光合蛋白含量变化的免疫印迹分析；(C)蓝藻捕光天线色素蛋白藻蓝素(phycoerythrin)和藻红素(phycocyanin)的含量；⑶光系统I和光系统II的量子效率(OPSI，ΦΡΞ II)，以及质醌库的氧化还原状态参数(1-1-qL) ; (E)NADPH的光合成速率；(F)光合磷酸化速率；(G)光合碳同化关键酶Rubisco的羧化活性。
[0108]图18、蓝藻生长光 质。黑色线为荧光灯光谱，红色线为白炽灯光谱。
[0109]图19、(A)PsbC-YFP转基因蓝藻在缺少蓝绿光的荧光灯和富含绿光的白炽灯下的生长表型及生长速率比较。PsbC-YFP转基因蓝藻在前两种光质下的生长都比野生型快，尤其是在白炽灯下比野生型的生长优势更明显。(B)PsbC-YFP转基因蓝藻与野生型净光合放氧速率的比较。左图为荧光灯下，右图为白炽灯下。(C) PsbC-YFP转基因蓝藻与野生型蓝藻呼吸速率的比较。左图为荧光灯下；右图为白炽灯下。
【具体实施方式】
[0110]本发明人经过深入的研究，开发了一种以提高藻类的光能利用效率为目的的改良藻类的新方法，所述方法通过在藻类中类囊体膜系统II外周蛋白PsbC上融合表达了外源的光能吸收和传递蛋白(Light Energy Absorption and Transduction protein, LEAT 蛋白)，在光下催化水的裂解，同时将裂解长生的电子和质子传递给与藻类类囊体膜上质体醌(plastoquinone)等，并释放氧气，这一过程在光下为光合电子传递链额外提供持续的电子来源，改变了藻类体内电子传递速率和氧还还原状态，引起藻类体内光合相关基因表达的改变，从而提高藻类光能利用效率。
[0111]术语
[0112]如本文所用，所述的“改良性状”指改良的藻类的特性，包括但不仅限于:提高藻类的光吸收效率、促进藻类生长、提高的CO2利用率、增强的光转化效率、增强的光合同化效率、增强的光保护机制，增加生物量和/或产量等等特征。本发明的一个重要方面，改良性状是促进藻类生长或提高藻类生物量，包括在无环境胁迫压力条件下的提高和在环境压力条件下的提高。环境胁迫压力条件可以包括，如日照不足、高光强、高紫外辐射条件、高温、高生物密度。“产量”能被很多特征所影响，包括生物对光吸收效率、光转化效率、光合碳同化效率，生物量的累积等特征的影响。
[0113]如本文所用，“藻类性状的改良”、“改良的性状” “改良的藻类性状”、“性状改良”、
“藻类性状改良”等可以等同替代，是指与未改良前藻类(如野生型藻类)相比，经本发明改良的藻类光吸收效率提高、光转化效率增强、光合碳同化效率增强、光保护机制增强，器官的数目或大小向有利的方向变化、构造向有利的方向变化、提闻经济广量、生物量提闻和/或广量提闻等。
[0114]如本文所用，术语“产量”可以涉及藻类的营养生物量，涉及繁殖器官和/或涉及繁殖体。
[0115]“产量相关性状”包括但不限于生物量、产量等。
[0116]如本文所用，术语“提高”、“改良”或“增强”是相互可以交换的并且在应用含义上应当意指与本文中定义的对照藻类相比较，至少2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%或10%、优选的至少15%或20%、更优选25%、30%、35%或40%更多的生长量等性状。
[0117]如本文所用，生物体内广泛存在各种类型的甲基醌的衍生物，有些甲基醌是代谢过程中的中间产物，有些则本身参与生物体内各种基础代谢和次生代谢的调控。其中“质体醌”(plastoquinone，PQ)就是一种甲基苯醌的衍生物。醌环上联2个甲基，有一侧链联着不同数目的异戊二烯单位。光合生物体中有几种PQ，它们的区别是异戊二烯单位数目不同。PQ广泛存在于叶绿体和胞质中，如粗面内质网等。叶绿体中最多的是PQ9。在光合链中，既可传递电子，又可传递质子，其氧化还原反应:氧化还原电位约为±0.1伏。氧化型的PQ从类囊体膜的靠外一侧接受电子，并与膜外质子结合，尔后向内扩散，在膜内侧被细胞色素f氧化，交出电子，同时把质子释放到膜内腔。即伴随PQ氧化和还原作用，使质子从膜外横渡膜进入膜内腔。这种质子的移动导致的膜内外质子梯度与光合磷酸化有关。
[0118]本文中所述的“光”，除了指波长范围从400_760nm的可见光范围内的电磁波外，还包括波长范围是300-400nm的紫外线和760nm-1000nm的近红外线的电磁波。所述“光能”，指上述范围，即300-1000nm，的电磁波的能量。
[0119]如本文所用，所述的“光能吸收和传递蛋白(LEAT蛋白)”是一类由其自身组成蛋白质序列的氨基酸残基构成的生色基团吸收300-1000nm的电磁波，并将其吸收的电磁波的能量(如上述用法所述，以下简称为“光能”)转化为化学能的蛋白。所述转化为化学能的过程为，在吸收光能后，通过催化水的裂解将裂解产生的电子和质子传递给相关的甲基醌及其衍生物，还原甲基醌及其衍生物的蛋白。所述甲基醌及其衍生物包括，TMBQ(2，3，5-三甲基-1，4-对苯醌)、DMBQ2 (2, 6- 二甲基_1，4-对苯醌)、MBQ(甲基_1，4-对苯醌)和DMBQl (2，5- 二甲基-1, 4-对苯醌)，较佳的是TMBQ (2，3，5-三甲基-1, 4-对苯醌)。
[0120]LEAT所吸收的电磁波的波长下限是300nm,较佳的，320nm、340nm,350nm、360nm更佳的，370nm、380nm、390nm、400nm、410nm 或 420nm ;上限是 1000nm,较佳的，950nm、900nm,850nm、800nm,更佳的，750nm、700nm、680nm、660nm、650nm、640nm、630nm 或 620nm。
[0121]所述LEAT蛋白优选自:
[0122] 荧光蛋白或其经一个或多个(如1-30个；较佳地1-20个；更佳地1_10个；更佳地1-5个)氨基酸位点突变后荧光强弱或荧光发射光谱发生变化的，但依然能够利用光能催化水裂解同时完成甲基醌衍生物(例如2，3，5-三甲基-1，4-对苯醌或质体醌)的还原或其类似物的突变体蛋白；或[0123]非荧光生色蛋白其经一个或多个(如1-30个；较佳地1-20个；更佳地1_10个；更佳地1-5个)氨基酸位点突变后依然能够利用光能催化水裂解的同时催化甲基醌衍生物(例如2，3，5-三甲基-1，4-对苯醌或质体醌)的还原或其类似物的突变体蛋白。
[0124]所述荧光蛋白是指天然存在的或合成的蛋白，无需外加辅助因子，可受一定波长光的激发并发射荧光。
[0125]所述非荧光生色蛋白是指天然存在的或合成的蛋白，无需外加辅助因子，可吸收一定波长的光，并且具有吸收光能后不发射荧光的蛋白。带有任何辅基或辅助因子或通过任何辅基或辅助因子吸收光能的生色蛋白，如:血红蛋白、黄素蛋白、细胞色素蛋白等，均不在本发明所述的非荧光生色蛋白范围内。
[0126]上述荧光蛋白和非荧光生色蛋白都具有相似的三维圆柱形结构，其多肽骨架大部分折叠成11条氢键链接的β-片层，中央为包含生色基团的α螺旋，其均都可依靠其自身的氨基酸序列就能够形成生色团结构来吸收及发射光能。
[0127]本发明中所述的荧光蛋白优选自:蓝色荧光蛋白、青色荧光蛋白、绿色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、红色荧光蛋白、远红光荧光蛋白、近红外荧光蛋白。
[0128]所述的“蓝色突光蛋白”(Blue Fluorescent Protein, BFP)是发射峰位于440-470nm的荧光蛋白；如SEQ ID N0:4所示的蓝色荧光蛋白。
[0129]所述的“青色突光蛋白”(Cyan Fluorescent Protein, CFP)是发射峰位于470-500nm的荧光蛋白；如SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO:36所示的青色荧光蛋白。
[0130]所述的“绿色突光蛋白”(Green Fluorescent Protein, GFP)是发射峰位于500-525nm 的荧光蛋白；如 SEQ ID N0:6、SEQ ID NO:28,SEQ ID N0:40 或 SEQ ID N0:44 所示的绿色荧光蛋白。
[0131]所述的“黄色突光蛋白”(Yellow Fluorescent Protein, YFP)是发射峰位于525-570nm的荧光蛋白；如SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:50所示的黄色荧光蛋白。
[0132]所述的“红色突光蛋白”(Red Fluorescent Protein, RFP)是发射峰位于570-630nm的荧光蛋白；如SEQ ID NO:2所示的红色荧光蛋白；如SEQ ID NO:2, SEQ IDNO:30, SEQ ID NO:34, SEQ ID N0:42 或 SEQ ID N0:46 所示的红色荧光蛋白。
[0133]所述的“远红光突光蛋白”(Far-red Fluorescent Protein)是发射峰位于630-760nm的荧光蛋白。
[0134]所述的“近红外突光蛋白”(Near Infra-red Fluorescent Protein)是发射峰位于760-900nm的荧光蛋白；如SEQ ID N0:32或SEQ ID N0:48所示的近红外荧光蛋白。
[0135]所述的“非突光生色蛋白”(non-fluorescent chromoprotein)如 SEQ ID NO: 38所示的非荧光生色蛋白。
[0136]如本文所用，“表达”是指多核苷酸(一个或多个)或含有多核苷酸的表达盒至mRNA的转录，有或无后者至蛋白质的随后翻译。该过程包括DNA的转录和所获得的mRNA产物的加工。
[0137]如本文所用，术语“引入”或“转化”包括将外源多核苷酸转移进宿主细胞，不考虑转移所用的方法。
[0138]外来基因转移进入宿主基因组中称为转化。生物物种的转化目前是一种相当常规的技术。有利地，可以使用若干转化方法的任一种向适当的宿主细胞引入目的基因。可以利用公开的转化方法以及由生物组织或器官再生的方法来进行瞬时或稳定转化。转化方法包括应用脂质体、电穿孔、增加游离DNA摄取的化学物质、直接向藻类注射DNA、基因枪/粒子枪轰击、用病毒或花粉转化和微粒轰击。方法可以选自用于原生质体的钙 / 聚乙二醇方法(Krens, F.A.等，(1882)Nature296, 72-74 ;Negrutiu 1.等，(1987)Plant Mol.Biol.8:363-378);原生质体的电穿孔法(Shillito R.D.等，(1985)Rio/Technol3, 1099-1102)；植物材料的显微注射(Crossway A.等，(1986)Mol.GenGenet202:179-185) ;DNA 或 RNA 包被的粒子轰击(Klein T.Μ.等，(1987) Nature327:70)；用(非整合型)病毒感染，等等。
[0139]关于“对照藻类”，选择合适的对照藻类是实验设计的例行部分，可以包括对应的野生型藻类或无目的基因的相应转基因藻类。对照藻类一般是相同的藻类物种或甚至是与待评估藻类相同的品种。对照藻类也可以是因分离而丢失转基因藻类的个体。如本文所用的对照藻类不仅指完整藻类，也指藻类部分。
[0140]本文所用的术语“增加的表达” “过表达”或“异位表达”是指相对于原有的野生表达水平外额外的任何形式的表达。
[0141]如本文所用，“表达盒”在这里是指重组DNA分子，它包含预期的核酸编码序列，这个序列编码光能吸收和传递蛋白；这个DNA分子还包含转录在体外或体内可操作的连接编码序列所必需的或预期的适合的调控元件。“调控元件”在这里指的是可控制核酸序列表达的核苷酸序列。可作为典范的调控元件包括启动子，转录终止序列或上游调节区，这些调控元件有助于核酸的复制、转录、转录后修饰等。此外，调控元件还可以包括:增强子，内核糖体进入位点(IRES)，复制起点，多腺苷酸化信号等。 [0142]如本文所用，所述的“操作性相连”或“可操作地连于”指这样一种状况，即线性DNA序列的某些部分能够调节或控制同一线性DNA序列其它部分的活性。例如，如果启动子控制序列的转录，那么它就是可操作地连于编码序列。
[0143]如本文所用，“外源的”或“异源的”基因或蛋白是指并非天然包含在原生物体基因组中的基因或蛋白。所述的“外源蛋白的编码基因”也称为“异源DNA”，指在所给定的宿主细胞中原本不存在的一种DNA分子，或一个DNA分子群；或指异于特定宿主细胞的DNA分子。
[0144]如本文所用，所述的“含有”，“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由……构成”、“基本上由……构成”、和“由……构成”;“主要由……构成”、“基本上由……构成”和“由……构成”属于“含有”、“具有”或“包括”的下位概念。
[0145]LEAT 蛋白
[0146]本发明人意外地发现，一系列光能吸收和传递蛋白(LEAT蛋白)，能够在光下催化水的裂解和质体醌类似物(如对2，3，5三甲基-1，4-对苯醌)的还原，同时放出氧气。因此LEAT蛋白在藻类类囊体膜上整合表达后，其在光下催化裂解水反应可持续地产生的电子用于还原光合电子传递链下游的质体醌，还原型的质体醌可提供额外的电子来源参与光合电子传递，调控藻体内的各种氧化还原状态，调控相关基因的表达，促进藻类的生长，改良藻类的性状。
[0147]多种光能吸收和传递蛋白(LEAT)蛋白可应用于本发明，只要其是吸收光子的能量超过裂解水所需能量的蛋白，或能够吸收300-1000nm波长的蛋白。本领域公知，在标准条件下，1分子 水分解成氧和2个电子和2个质子需要1.23电子伏特光能，因此LEAT蛋白吸收光子的能量只要超过裂解水所需的能量，也就是1.23电子伏特就能驱动这一反应，放出的电子和质子通过这类醌化合物的介导，还原体内的氧化物质。因此，本发明涉及一系列具有光能吸收和传递功能的蛋白，包括吸收光波辐射的发射和不发射荧光的蛋白基因，如绿色、黄色、红色荧光蛋白及其突变体，它们能够用于提高藻类的光能利用率，极显著地提高生物量。
[0148]作为本发明的优选方式，所述的LEAT蛋白包括:蓝色荧光蛋白，青色荧光蛋白，绿色荧光蛋白，黄色荧光蛋白，红色荧光蛋白或远红光荧光蛋白或非荧光生色蛋白。
[0149]荧光蛋白是一类在适当条件下能发光的蛋白，其生色基团是由组成其蛋白序列的氨基酸残基构成。在现有技术中其主要被用于标记细胞结构和监测胞内过程，它还用于细胞群体的体内示踪，如肿瘤细胞。最早出现的绿色荧光蛋白(GFP)是于1962年在一种学名Aequorea victoria的水母中发现，之后又在海洋珊瑚虫中分离得到了 GFP。随后的研究又在腔肠动物门中的珊瑚虫纲(Actinozoa)中，如珊瑚和海葵中发现了一系列不同光谱特性的荧光蛋白。所有的荧光蛋白都具有相似的三维圆柱形结构，其多肽骨架大部分折叠成11条氢键链接的β_片层，中央为包含生色基团的α螺旋。迄今为止，荧光蛋白经过基因工程手段的改造已发展出一系列的衍生物，它们的发射光谱基本已覆盖了整个的可见光区(400-760nm)和近红外线区(760_900nm)。因此，较佳地，荧光蛋白是三级结构为11股β_折叠组成的β_桶状结构环绕着包含生色基团的α-螺旋。
[0150]所述荧光蛋白是指天然存在的或合成的蛋白，无需外加辅助因子，其本身氨基酸构成的生色基团即可受一定波长范围的电磁波激发并发射出可见光。另一方面，所述荧光蛋白可以是从腔肠动物，如水母，珊瑚虫或海葵，中分离的荧光蛋白及其衍生物；另一方面，所述荧光蛋白是来自Aequorea的绿色荧光蛋白(Swiss-Prot:Ρ42212)及其衍生物，如SEQID Ν0:4所不的BFP ;或所述突光蛋白也可来自Discosoma sp.的红色突光蛋白(DsRed)(Swiss-Prot: Q9U6Y8)或其衍生物，如 mCherry。
[0151]本发明中所述的非荧光生色蛋白与上述荧光蛋白具有类似的结构，能够吸收一定波长的光能，但其野生型蛋白发射荧光的能力极弱。
[0152]目前，GFP, RFP, BFP等被广泛用于生物影像研究，报道蛋白在组织和细胞中的定位(Shaner NC, Patterson GH, Davidson WL 2007Advances in fluorescentproteintechnology.J Cell Sc1.15;120(Pt24):4247-4260 ；mCherry Shaner NC,CampbellRE, Steinbach PA, Giepmans BN, Palmer AE, Tsien RY.(2004)Improved monomericred, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp.redf luorescentprotein.Nat Biotechnol.22 (12): 1567-72)。但是，目前还没有技术人员将这些荧光蛋白或非荧光生色蛋白用于制备转基因藻类以提高藻类的光合作用效率。
[0153]作为本发明的优选方式，所述的LEAT蛋白是:蓝色荧光蛋白(BlueFluorescentProtein, BFP),青色突光蛋白(Cyan Fluorescent Protein, CFP),绿色突光蛋白(GreenFluorescent Protein, GFP),黄色突光蛋白，红色突光蛋白(Red FluorescentProtein, RFP),或远红色荧光蛋白或非荧光生色蛋白。上述荧光蛋白的变异体也可应用于本发明中。上述荧光蛋白的变异体尽管荧光强度发生较大的改变，但仍然能够在甲基醌或其衍生物存在的条件下利用光能催化水的裂解反应，释放氧气，持续的产生还原能并储存在醌中，因此它们也能够应用于本发明。
[0154]作为本发明的另一优选方式，所述的荧光蛋白选自但不限于:黄色荧光蛋白(Yellow Fluorescent Protein),红色突光蛋白(Red Fluorescent Protein, RFP),或远红光突光蛋白(Far-red Fluorescent Protein)。应理解，本发明的方法通过利用突光蛋白来转换吸收光的波长或光谱能量来实现技术效果，所以任何可被495-620nm的光激发且发射峰位于550-700nm间的荧光蛋白都具有与RFP类似的光学特性，可将藻类利用率低的光转化为光系统利用效率高的光，从而可应用于本发明，例如:mHoneydew(激发峰为487/504nm,发射峰为537/562nm), mBanana(激发峰为540nm,发射峰为553nm),mOrange (激发峰为548nm,发射峰为562nm), dTomato (激发峰为554nm,发射峰为581nm),tdTomato (激发峰为554nm,发射峰为581nm), mStrawberry (激发峰为574nm,发射峰为596nm), mCherry (激发峰为587nm,发射峰为610nm), mPlum(激发峰为590nm,发射峰为649nm), mRFPl (激发峰为584nm,发射峰为607nm), mTangerine (激发峰为568nm,发射峰为585nm)。[0155]所述的“绿色荧光蛋白”、“青色荧光蛋白”、“蓝色荧光蛋白”还包括“增效的绿色荧光蛋白”、“增效的青色荧光蛋白”、“增效的蓝色荧光蛋白”。
[0156]所述的“青色荧光蛋白”例如可以具有GenBank登录号AAQ96626所示的氨基酸序列或与其基本上相同；或将该氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有该序列的蛋白相同功能的蛋白；或与GenBank登录号AAQ96626所示氨基酸序列的蛋白的序列同源性高于70%，且具有改良藻类性状功能的蛋白。
[0157]所述的“黄色荧光蛋白”例如可以具有GenBank登录号ADR00308所示的氨基酸序列或与其基本上相同；或将该氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有该序列的蛋白相同功能的蛋白；或与GenBank登录号ADR00308所示氨基酸序列的蛋白的序列同源性高于70%，且具有改良藻类性状功能的蛋白。
[0158]所述的“远红光荧光蛋白”例如可以具有GenBank登录号ACH06541所示的氨基酸序列或与其基本上相同；或将该氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有该序列的蛋白相同功能的蛋白；或与GenBank登录号ACH06541所示氨基酸序列的蛋白的序列同源性高于70%，且具有该序列的蛋白相同功能的蛋白。
[0159]所述的“非荧光生色蛋白”例如可以具有GenBank登录号DQ206394 (gfasCP)，AF363776 (hcriCP)，AY485336 (anm2CP)等。
[0160]在本发明中，所用的LEAT蛋白可以是天然存在的，比如其可被分离或纯化自低等生物，如腔肠动物门。此外，所述的LEAT蛋白也可以是人工制备的，比如可以根据常规的基因工程重组技术来生产的LEAT蛋白。优选的，本发明可采用重组的LEAT蛋白。任何适合的LEAT蛋白均可用于本发明。所述的LEAT蛋白包括全长的LEAT蛋白或其生物活性片段。将野生型LEAT蛋白的氨基酸序列经过一个或多个(如1-30个；较佳地1-20个；更佳地1_10个；更佳地1-5个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有该序列的蛋白相同功能的蛋白；或与野生型氨基酸序列的蛋白的序列同源性高于70%，且具有野生型蛋白相同功能的蛋白。LEAT蛋白或其生物活性片段包括一部分保守氨基酸的替代序列，所述经氨基酸替换的序列并不影响其光能吸收和传递特性。适当替换氨基酸是本领域公知的技术，所述技术可以很容易地被实施并且确保不改变所得分子的生物活性。这些技术使本领域人员认识到，一般来说，在一种多肽的非必要区域改变单个氨基酸基本上不会改变生物活性；见Watson 等 Molecular Biology of The Gene,第四版，1987, The Benjamin/Cummings Pub.C0.P224。任何一种LEAT蛋白的生物活性片段都可以应用到本发明中。在这里，LEAT蛋白的生物活性片段的含义是指作为一种多肽，其仍然能保持全长的LEAT蛋白的全部或部分功能。通常情况下，所述的生物活性片段至少保持50%的全长LEAT蛋白的活性。在更优选的条件下，所述活性片段能够保持全长LEAT蛋白的60%、70%、80%、90%、95%、99%、或100%的活性。本发明也可采用经修饰或改良的LEAT蛋白，比如，可采用为了促进其半衰期、有效性、代谢、和/或蛋白的效力而加以修饰或改良的LEAT蛋白。也就是说，任何不影响LEAT蛋白的光能吸收和传递的变化形式都可用于本发明中。
[0161]本发明所述的荧光蛋白还能够用于改良藻类多方面性能，包括:提高藻类的光能利用效率；增加藻类PSI或PSII的光化学效率；增加藻类光合电子传递效率；提高藻类对CO2的同化能力；提高藻类的净光合效率；提高藻类的光合器官的光保护机制；促进藻类生长；提高藻类的生物量；增加藻类的总蛋白量；提高藻类产量。上述藻类性状变化对于藻类品种的改良是非常有益的。
[0162]改良藻类性状的方法
[0163]本发明提供了一种改良藻类性状的方法，所述方法包括:在藻类类囊体膜系统II外周蛋白PsbC上融合表达外源的LEAT蛋白。外源的LEAT蛋白与藻类体内的质体醌及其类似物一起，自发形成一个新的人工光反应系统，通过催化水的裂解，将吸收的光能转换为还原能储存在醌分子中，并放出氧气，而还原性的醌分子作为额外的电子来源，可以参与藻类的光合电子传递，调控体内一系列的氧化还原反应，同时还利用一些LEAT蛋白吸收一些对藻类有害的射线，如紫外或高强度的蓝光等，保护强光下的光合机构免受伤害。并进而提高了藻类的光合作用、促进生长提高了生物量和产量。所述的LEAT蛋白可以是:蓝色荧光蛋白，青色荧光蛋白，绿色荧光蛋白，黄色荧光蛋白，红色荧光蛋白或远红光荧光蛋白或他们的变异体。
[0164]使得藻类表达外源蛋白的方法是本领域周知的。通常，可通过转入携带LEAT蛋白编码基因的表达盒使植株表达荧光蛋白。
[0165]因此，本发明还提供了一种用于在藻类体内表达LEAT蛋白的表达盒。所述的表达盒包括操作性连接的调控元件以及LEAT蛋白的编码序列，从而当其转入到细胞内或整合到基因组中后，可重组表达LEAT蛋白。所述的表达盒中包括与LEAT蛋白编码序列操作性连接的启动子。所述的启动子可以是任何可指导LEAT蛋白编码序列在藻类表达的启动子，例如是组成型(例如CaMV35S启动子)的或是组织特异性的或是诱导型的。在启动子驱动下，LEAT蛋白的表达可提高藻类对光的利用效率。
[0166]本发明中，LEAT蛋白的表达盒可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其他载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。 [0167]此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性，或用于大肠杆菌的卡那霉素或氨苄青霉素抗性。
[0168]本领域技术人员均了解，藻类的光合作用的机理是非常接近的，关键参与者是内部的叶绿体，能够将其吸收的光能转换为还原力，向光合电子递体提供电子，改变它们的氧化还原状态。因此，应理解，本发明的技术方案可以适用于多种藻类生物而不仅限于蓝藻。
[0169]本发明的技术方案的主要优点在于:
[0170]本发明的方法可以拓展藻类对光能的利用，提高光合效率及产量。本发明将LEAT蛋白转到藻类中，拓展藻对太阳光能利用的光谱范围，通过催化水的裂解提供额外的电子，参与光合电子传递链，并改变氧化还原状态来调控光合机构的表达，从而达到提高对太阳光能利用效率。方法简易，成本低，效果好，成效显著。本发明对于拓展对太阳光能利用的光谱范围，提高藻类对太阳光的利用效率，降低有害辐射(紫外线UVB)以及高光强对藻类的伤害，从而提高藻类光合作用效率，最终提高生物量和经济产量具有重要意义。因此本发明可以应用于农业、生物能源产业等方面。
[0171]下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
[0172]1.材料和方法
[0173]所用LEAT蛋白序列及基因序列
[0174]本发明用到的LEAT蛋白包括荧光蛋白及不发荧光的突变体，都具有相似的三维圆柱形结构，其多肽骨架大部分折叠成11条氢键链接的β_片层，中央为包含生色基团的α螺旋。吸收光谱覆盖了大部分的可见光区和部分紫外线区(320-630nm)。
[0175]mCherry 基因序列如 SEQ ID NO:1。
[0176]mCherry 蛋白序列如 SEQ ID NO: 2 (激发波长 480_620nm)。
[0177]BFP 基因序列如 SEQ ID N0:3。
[0178]BFP 蛋白序列如 SEQ ID N0:4(激发波长 320_410nm)。
[0179]GFP 基因序列如 SEQ ID N0:5。
[0180]GFP 蛋白序列如 SEQ ID NO:6)(激发波长 400_510nm)。
[0181]YFP 基因序列如 SEQ IDN0:7。
[0182]YFP 蛋白序列如 SEQ ID N0:8(激发波长 450_530nm)。
[0183]CFP 基因序列如 SEQ ID NO:9) ?
[0184]CFP 蛋白序列如 SEQ ID NO: 10)(激发波长 350_490nm)。
[0185]YFP点突变后的基因和蛋白序列如下:
[0186]YFPmu2 (YFPm49c Y204A)基因序列如 SEQ ID NO: 11。
[0187]YFPmu2 (YFPm49c Y204A)蛋白序列如 SEQ ID NO: 12。
[0188]YFPmu4(YFPm49c F166N I168M Y204A)基因序列如 SEQ ID NO: 13。
[0189]YFPmu4(YFPm49c F166N I168M Y204A)蛋白序列(SEQ ID NO: 14)。
[0190]YFPmu7 (YFPsi48c H149C F166N K167M I168M S203A Y204A)基因序列如 SEQ ID NO: 15。
[0191]YFPmu7 (YFPsi48c H149C F166N K167M I168M S203A Y204A)蛋白序列如 SEQ ID NO: 16。
[0192]YFPl232h 基因序列如 SEQ ID NO: 17。
[0193]YFPl232h 蛋白序列 如 SEQ ID NO: 18。
[0194]YFPl232q 基因序列如 SEQ ID NO: 19。[0195]YFPl232q 蛋白序列如 SEQ ID N0:20。
[0196]mCherry点突变后的基因和蛋白序列如下
[0197]mCherrymu3 (mCherysl51c S152C K167M)基因序列如 SEQ ID NO: 210
[0198]mCherymu3 (mCherrysl51c S152C K167M)蛋白序列如 SEQ ID N0:22。
[0199]mCherrymu4(mCherrysl51c S152C K167M I202A)基因序列如 SEQ ID NO:23。
[0200]mCherymu4(mCherrysl51c S152C K167M I202A)蛋白序列如 SEQ IDNO:24?
[0201]mCherrymu5 (mCherysl51c S152C I166N K167M I202A)基因序列如 SEQ ID NO: 25。
[0202]mCherrymu5 (mCherrysl51c S152C I166N K167M I202A)蛋白如 SEQ ID NO: 26。
[0203]mGFP5 基因序列如 SEQ ID N0:27。
[0204]mGFP5 蛋白序列如 SEQ ID N0:28。
[0205]eqFP611(AY130757)基因序列如 SEQ ID N0:29。
[0206]eqFP611 蛋白序列如 SEQ ID N0:30。 [0207]hcriCP(AF363776)基因序列如 SEQ ID N0:31。
[0208]hcriCP 蛋白序列如 SEQ ID N0:32。
[0209]eforCP(EU498726)基因序列如 SEQ ID N0:33。
[0210]eforCP 蛋白序列如 SEQ ID N0:34。
[0211]efasCFP(DQ206397)基因序列如 SEQ ID N0:35。
[0212]efasCFP 蛋白序列如 SEQ ID N0:36。
[0213]spisCP(DQ206398)基因序列如 SEQ ID N0:37。
[0214]spisCP 蛋白序列如 SEQ ID N0:38。
[0215]scubGFP(AY037767)基因序列如 SEQ ID N0:39。
[0216]scubGFP 蛋白序列如 SEQ ID N0:40。
[0217]rf1RFP(AY037773)基因序列如 SEQ ID N0:41。
[0218]rfloRFP 蛋白序列如 SEQ ID N0:42。
[0219]rmueGFP(AY015996)基因序列如 SEQ ID N0:43。
[0220]rmueGFP 蛋白序列如 SEQ ID N0:44。
[0221]ceriantRFP(AY296063)基因序列如 SEQ ID N0:45。
[0222]ceriantRFP 蛋白序列如 SEQ ID N0:46。
[0223]anm2CP(AY485336)基因序列如 SEQ ID N0:47。
[0224]anm2CP 蛋白序列如 SEQ ID N0:48。
[0225]phiYFP(AY485333)基因序列如 SEQ ID N0:49。
[0226]phiYFP 蛋白序列如 SEQ ID N0:50。
[0227]cpGFP(AB185173)基因序列如 SEQ ID N0:51。
[0228]cpGFP 蛋白序列如 SEQ ID N0:52。
[0229]YFPl 基因序列如 SEQ ID NO:55
[0230]YFP1J31 蛋白序列如 SEQ ID NO:56
[0231]GFP突变后的基因和蛋白序列如下:
[0232]GFPl 基因序列如 SEQ ID NO:57
[0233]GFP1J31 蛋白序列如 SEQ ID NO:58[0234]LEAT蛋白的原核表达及其纯化
[0235]PCR扩增mCherry全长基因，PCR产物用BamHI和SalI酶切后接入pGEX_4T_l (GEhealthcare, Uppsala, Sweden)载体中，使得 GST 融合在 mCherry 基因的 N端，然后质粒转化 E.coli BL21 (DE3) (Promega,Madison,WI) ? PCR 扩增正向引物为:5’_CCC迎ATCCATGGTGAGCMGGGCGAGGAG-3 ’ (SEQ ID NO: 53)，反向引物为:5 ’ -CCGGTCGACCTACTTGTACAGCTCGTCCATG-3’(SEQ ID N0:54)。正向和反向引物序列下划线部分分别为BamHI和Sail酶切位点。
[0236]pRSET-BFP 经 EcoRI/XhoI 酶切将 BFP 全长基因片段连接到 pGEX-4T_lEcoRI/XhoI位点中，使得GST融合在BFP基因的N端，然后质粒转化E.coli BL21 (DE3)。
[0237]mCherry 点突变体基因(mCherrymu3, mCherrymu4 和 mCherrymu5)通过合成获得(金斯瑞生物科技，南京，中国)，合成序列时分别两端带有BamHI和SacI,合成后mCherrymu3, mCherrymu4 和 mCherrymu5 片段连接到 pUC57 载体 BamHI/SacI 酶切位点。pUC57-mCherrymu3, pUC57-mCherrymu4 和 pUC57_mCherrymu5 用 BamHI 和 SacI 酶切后，片段接入pET30a (Novagen)载体，使得6XHis标签融合在mCherry各突变基因的N端。将质粒转化E.coli BL21(DE3)菌株中，诱导表达融合蛋白。
[0238]分别以pEYFP，pECFP(Clonetech)和 pl301-GFP(Li N, Zhang D-S, Liu H-S etal.The rice tapetum degeneration retardation gene is required for tapetumdegradation andanther development.The Plant Cell2006; 18:2999-3014.)为模板，利用 iProofHigh-Fidelity DNA 聚合酶(Bio-rad)，通过 PCR 扩增 YFP，CFP, GFP 基因以及 C末端去除的YFP突变体基因(YFPl)和GFP突变体基因(GFPp231),将PCR产物用KpnI和SacI酶切后连接到pET51b载体(Novagen)中，YFPmu2、YFPmu4等的点突变通过引物扩增引入。以上的基因的N末端融合有str印II，将测序正确的质粒转化到BL21-CodonPluS菌株(Promega, Madison, WI)中，以 20。C，0.1mlIPTG 诱导过夜。
[0239]12个LEAT蛋白基因通过合成获得(金斯瑞生物科技，南京，中国)，合成序列时分别两端带有BamHI和SacI或EcoRI和SacI酶切位点，用BamHI和SacI或EcoRI和SacI酶切后接入pET30a (Novagen)，N末端与6XHis标签融合。将质粒转化E.coli BL21 (DE3)菌株中，诱导表达融合蛋白。
[0240]上述融合蛋白的诱导表达参照生产厂商的产品说明书。纯化的蛋白经脱盐后，-80° C保存在含10%甘油的50mM的PBS缓冲液中。
[0241]LEAT蛋白光下催化水裂解放氧速率的测定
[0242]将1.85毫升的50禮PBS (pH6.5)，加入Clark型氧电极的反应池中，然后在暗中先后加入终浓度为0.1-1 μ g/ml LEAT蛋白(GFP蛋白含量约为10 μ g/ml)和400 μ M各种类型对苯醌。然后在其激发波长的光下(光强约为1-2 μ mol HT2s-1)测定其放氧速率。
[0243]荧光蛋白在光下催化TMBQ的还原能力测定方法
[0244]将2ml50mM PBS(pH6.5)加入3ml四面透光的石英比色杯中。然后避光先后加入终浓度为0.02-1 μ g/ml LEAT蛋白(GFP蛋白含量约为20 μ g/ml)和400 μ M2，3，5-三甲基-1,4-对苯醌(TMBQ)。然后在各自适合波长的光(光强约为1-2 μ mol m_2s_1)下用UV-3000 (日本岛津公司Shimadzu)分别测定其OD436吸收减少速率，TMBQ还原速率按照其在436nm处的消光系数(41.AiT1CnT1)进行计算。[0245]Rubisco酶活力测定
[0246]1，5_ 二憐酸核酮糖羧化酶 / 加氧酶(ribulose-l, 5-bisphosphate carboxylase/oxygenase, Rubisco)羧化活性的测定:用缓冲溶液(50mM Tris-HCl pH7.8, ImMEDTA, 50mMNaCl和2mM β -Mercaptoethano I)从蓝藻中快速提取可溶性蛋白。将匀浆离心(4° C，12，000g，6分钟)所得上清液用于分析Rubisco活力。用14C同位素法测定 Rubisco 的羧化活性(Wang ZY, Snyder Gff, Esau BD, Portis AR, OgrenWL(1992)Species-dependentvariation in the interaction of substrate-boundribulose-l, 5-bisphosphate carboxylase/oxygenase(rubisco)and rubisco activase.Plant PhysiologylOO: 1858-1862)。
[0247]蓝藻细胞活体放氧测定
[0248]活体条件的光合放氧的叶绿素含量为每毫升10-20 μ g,光强为500 μ mol JiT2S'绿光依赖的光合放氧的作用光为520nm,光强约为6 μ mol m 2S、
[0249]蓝藻叶绿素荧光及P700氧化还原的测定
[0250]利用带有IOlED发射-检测-比色杯装置(ED-1OlUS)的PAM叶绿素荧光仪(Walz，Effeltrich，德国)测定细胞叶绿素荧光参数的变化。细胞经暗适应30秒后，打开非光化学调制光束(1.6可Hz)测得最小应该值，Fo ;细胞在远红光或绿光下，用饱和闪光(XMT103，Walz, Effeltrich，德国)测得Fm’荧光水平；在远红光或绿光下，测定细胞荧光的稳态水平(Fs);在照射指定时 间的远红光或绿光后测定测定Fo’值；在作用光下加入ΙΟμΜ敌草隆(DCMU)测定最大荧光(Fm);用 1-[(Fm，-Fs)/(Fm，-Fo)x(Fo’ -Fs)算出 QA 值。用带有ED-P700DW-E光吸收单元的PAM叶绿素荧光仪，检测810-830纳米的光吸收变化来反映P700的氧化还原状态的变化，在照射远红光40秒后测定P700暗中的还原初始速率(Klughammer and Schreiber,1998, Mi et al.1992)。
[0251]蓝藻细胞密度的测定
[0252]蓝藻接种后每天用分光光度计(UV-2450，Shimadzu)测定730nm吸光值来决定细胞密度，对在不同生长光下培养3天的细胞进行拍照，记录生长表型。
[0253]光合电子递体细胞色素f和质蓝素的氧化还原测定
[0254]利用分光光度计(UV-2450，Shimadzu)测定554.5nm吸收的上升或下降来决定细胞色素f还原和氧化变化；测定598nm的下降和上升决定质蓝素的还原和氧化。光依赖的细胞色素f和质蓝素的氧化还原的是用带有激发光源的分光光度计(UV-3000，Shimadzu)检测，作用光是将白色光分别通过不同的干涉滤光片获得，用适当的滤光片保护检测窗口。细胞色素f还原速率按照其在554.5nm处的消光系数31500m-1cm-1)，质蓝素的还原速率按照598nm处的消光系数(47001^01^1)进行计算。
[0255]集胞蓝藻PsbC融合蛋白突变体以及生长条件
[0256]通过分子生物学的技术，将外源基因YFP通过同源重组的技术，融合到能源藻——集胞蓝藻PCC6803(常规藻种，获自日本京都大学)的光系统II PsbC基因的C末端上。PsbC-YFP转基因蓝藻转化质粒的构建如图14A所示，利用pEYFP载体(ClontechLaboratories, Inc.CA, USA)构建了 pEYFP_SpK质粒，将这些带有YFP的质粒插入PsbC 基因的 C 末端，引物为:PsbC_SalF, ggggtcgactatttaccatgccctcc ;PsbC_BamHR,gggggatccaagtcgaggtcaggcatga;PsbDn_EcoRF, ggggaattcgttgttcatgcctgac ；PsbDn-XbaR, gggtctagaaatttggagtgaggcc,构建了用于转化蓝藻的 PsbC_YFP_SpR 质粒。
[0257]利用自然转化法将PsbC-YFP-SpK转化质粒对蓝藻细胞进行转化，在含有链霉素的抗生素的琼脂平板上画线，放在蓝藻的培养箱中培养，获得转化的克隆后，进行PCR鉴定(图14B)，然后在含有100 μ g/ml链霉素培养基中进行整合。
[0258]蓝藻细胞的培养
[0259]野生型集胞蓝藻6803、PsbC-YFP转基因蓝藻用含5mM Tris-HCl (pH8.0)的BG-1l培养基，在30°C，2%(v/v)C02、连续照射光GOym0InT2iT1)的条件下通气培养，突变株系的培养基中添加适当的抗生素。
[0260]I1.实施例
[0261 ] 实施例1、LEAT蛋白利用光能催化水的裂解
[0262]ULEAT蛋白在作用光下催化水对质体醌的类似物2，3，5_三甲基_1，4_对苯醌的还原。
[0263]已有报道表明，GFP蛋白能够作为电子供体还原一些氧化态的小分子化合物如NAD+、铁氰化钾以及一些蛋白如细胞色素C、以FAD为辅基的蛋白(Bogdanov AM等，2009，Nature Chemical Biology.5:459-461),但这一反应是不可持续的。本发明人利用纯化的大肠杆菌表达重组蛋白。预照光的YFP和mCherry虽然可以作为电子供体，但是其反应是不可持续的(图1)。通过监测醌分子的在436nm吸收减少来分析LEAT蛋白催化的醌分子的光下还原。
[0264]LEAT蛋白可以作为一类与叶绿体内反应中心叶绿素a相似的反应中心色素，在作用光的激发下，能够催化水对甲基醌或其衍生物的还原，例如质体醌的类似物2，3，5-三甲基-1，4-对苯醌(图2)。与TMBQ的光下还原相似，LEAT蛋白光下催化的水裂解放氧反应是光强依赖的。虽然GFP光下也有催化水裂解放氧活性，但其活性比较低(图3和图4)，其余的LEAT蛋白都具有很强的催化TMBQ还原(图2)并放出氧气的活力(图5)，且是TMBQ浓度依赖的(图5)。
[0265]YFP/mChery在其他甲基醌存在时，也能在光下催化水裂解反应，其中在TMBQ存在的情况下，YFP和mCherry蛋白分子的光下裂解水放氧活力最高，其中TMBQ>DMBQ2>MBQ>DMBQ1，而用杜醌(DuroQuinone，DQ，四甲基-1，4-对苯醌)和泛醌类似物(2，3- 二甲氧基-5-甲基-1，4-对苯醌，UQ)替代TMBQ时，YFP和mCherry蛋白则没有光下裂解水放氧的活力(图6)。生物体内有有各种醌类物质，其中甲基醌衍生物是最重要的一类醌之一，比如=TMBQ的类似物质体醌含量很高，在细胞质和叶绿体中都有广泛分布。
[0266]2.LEAT蛋白光下催化TMBQ还原和水裂解放氧活力不依赖于其荧光的强弱
[0267]自然界中存在许多不发光但能吸收光的生色蛋白。为了进一步探讨LEAT蛋白的荧光特性与其光下催化水裂解放氧能力关系，将YFP和mCherry生色团周围相关残基进行突变，各得到了 3个荧光大幅度减弱的点突变:YFPmu2 (YFPhi49c Y204A)，YFPmu4 (YFPhi49c
F166N I168M Y204A) ρρ^(-yppSHSC H149C F166N Κ167Μ Ι168Μ S203A Υ204Α) mCherrymu3 (mCherryS151C 训况
K167M), mCherrymu4 (mCherrysl51c S152C K167M I202A), mCherrymu5 (mCherrysl51c S152C I166N K167M I2(I2A)。本发明人比较了这些突变体与野生型的光吸收能力、荧光强度、在光下催化TMBQ还原和水裂解放氧能力。吸收和荧光光谱扫描实验结果发现，这6个突变体只能发很弱的荧光或基本不发荧光。其中YFPmu2和mCherrymu3的吸收光的能力分别减少到原来的30%和40%(图7A，E)，但其荧光强度分别只有原来的~I和4%(图7D，H)。其他的4个突变体不仅荧光强度减弱得更多，其吸收光的能力也由很大幅度减少。其中YFPmu4和YFPmu7的荧光强度分别只有野生型的0.04%和0.07%(图7A,B,E, F),而mCherrymu4和mCherrymu5的突光强度分别只有野生型的3%和5%(图7C，G)。
[0268]进一步的光下裂解水放氧活力测定表明，不管LEAT蛋白是否发荧光都能在光下催化醌介导的裂解水放氧。放氧活力不仅没有随着荧光强度降低，反而有大幅度的提高。其中YFPmu2和YFPmu7分别是野生型的6倍和30倍，mCherrymu3是野生型的6倍(图7D, H)。这些结果表明，醌介导的LEAT蛋白催化水裂解放氧活性与其是否能发射荧光无关，而与蛋白吸收光能并传递和转换光能的能力有关。由于其没有荧光来耗散吸收的光能，它们催化TMBQ还原和水裂解放氧的活力反而更高。
[0269]3、YFP 突变体 YFPL232H，YFPl232q, YFP1^231 和 GFP1^31 放氧活力
[0270]通过对GFP和YFP，CFP, BFP氨基酸序列进行序列比较后发现(图8)，232位的氨基酸可能对放氧活力有影响。YFP⑵2H突变体光下裂解水放氧活性降低到野生型YFP的1%以下，如图9A。但是去除C末端后YFP (图9A)和GFP (图9B)蛋白在TMBQ存在的情况下催化水裂解放氧活力很高。说明GFP活力较低的主要原因在于232位的组氨酸，还表明现在活力较低的LEAT蛋白经过简单的遗传改造，如去除C末端，就可以大幅度提高它的活力，用于提闻光合效率。
[0271]实施例2、不同来源的LEAT蛋白光下催化水裂解放氧能力的比较
[0272]从110种刺胞动物(Cnidarian)和节足动物(Arthropoda)来源的突光蛋白和非荧光生色蛋白(表1)中选择 了 9个荧光蛋白和3个非荧光生色蛋白(图12)。这12个蛋白在进化树上分别属于A、B、C、D等不同的分支(图10)。这12个荧光蛋白和非荧光生色蛋白加上GFP系列和dsRED系列荧光蛋白在进化上覆盖了目前已报道的大部分的荧光蛋白和非突光生色蛋白(Alieva et al., 2008, Diversity and evolution of coar I fluorescentproteins.PLoS 0ne3 (7): e2680.do1: 10.1371/journal, pone.0002680)，它们分子进化途径以及氨基酸的同源性与GFP系列和dsRED系列的LEAT蛋白有很大的差别(图13A和13B)。利用大肠杆菌表达这些蛋白，发现虽然它们的荧光强度、吸收光谱、荧光光谱有比较大的差异，但都有不同程度的光下催化水裂解放氧的活力(表2)。这就有可能将其或其突变体经过合适的遗传改造，利用其催化水裂解的功能，使得水在光下作为稳定持续的电子供体，改善光合生物的性状。
[0273]表1、110种刺胞动物(Cnidarian)和节足动物(Arthropoda)来源突光蛋白和非荧光生色蛋白名称及基因序列号(Alieva et al.，2008)
[0274]
【权利要求】
1.一种改良藻类性状的方法，包括以下步骤: 1)将一种或多种编码光能吸收和传递蛋白的多核苷酸转化进入藻类； 2)从转化后的藻类中选择出相较对照藻类而言性状获得改良的藻类； 上述光能吸收和传递蛋白是能够利用光能催化水的裂解和2，3，5-三甲基-1，4-对苯醌的还原的蛋白。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的编码光能吸收和传递蛋白的多核苷酸选自下组: (a)编码荧光蛋白或其经一个或多个氨基酸位点突变后荧光强弱或荧光发射光谱发生变化的，但依然能够利用光能催化水的裂解和2，3，5-三甲基-1，4-对苯醌的还原的突变体蛋白的多核苷酸； 或 (b)编码非荧光生色蛋白或其经一个或多个氨基酸位点突变后但依然能够利用光能催化水的裂解和2，3，5-三甲基-1，4-对苯醌的还原的突变体蛋白的多核苷酸。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的编码荧光蛋白或其经一个或多个氨基酸位点突变后荧光强弱或荧光发射光谱发生变化的，但依然能够利用光能催化水的裂解和2，3，5-三甲基-1，4-对苯醌的还原的突变体蛋白的多核苷酸选自下组: (a)编码SEQID N0:4所示氨基酸序列的蛋白的多核苷酸； (b)编码SEQID NO: 10所示氨基酸序列的蛋白的多核苷酸； (c)编码SEQID NO:36所示氨基酸序列的蛋白的多核苷酸； (d)编码SEQID NO:6所示氨基酸序列的蛋白的多核苷酸； (e)编码SEQID NO:28所示氨基酸序列的蛋白的多核苷酸； (f)编码SEQID N0:40所示氨基酸序列的蛋白的多核苷酸； (g)编码SEQID N0:44所示氨基酸序列的蛋白的多核苷酸； (h)编码SEQID NO:52所示氨基酸序列的蛋白的多核苷酸； (i)编码SEQID NO:8所示氨基酸序列的蛋白的多核苷酸； (j)编码SEQ ID NO: 12所示氨基酸序列的蛋白的多核苷酸； (k)编码SEQ ID NO: 14所示氨基酸序列的蛋白的多核苷酸； (I)编码SEQ ID NO: 16所示氨基酸序列的蛋白的多核苷酸； (m)编码SEQ ID NO: 18所示氨基酸序列的蛋白的多核苷酸； (η)编码SEQ ID NO:20所示氨基酸序列的蛋白的多核苷酸； (ο)编码SEQ ID NO:50所示氨基酸序列的蛋白的多核苷酸； (P)编码SEQ ID ΝΟ:2所示氨基酸序列的蛋白的多核苷酸； (q)编码SEQ ID NO:22所示氨基酸序列的蛋白的多核苷酸； (r)编码SEQ ID NO:24所示氨基酸序列的蛋白的多核苷酸； (s)编码SEQ ID NO:26所示氨基酸序列的蛋白的多核苷酸； (t)编码SEQ ID NO:30所示氨基酸序列的蛋白的多核苷酸； (u)编码SEQ ID NO:34所示氨基酸序列的蛋白的多核苷酸； (v)编码SEQ ID NO:42所示氨基酸序列的蛋白的多核苷酸； (w)编码SEQ ID N0:46所示氨基酸序列的蛋白的多核苷酸；(x)编码SEQ ID N0:32所示氨基酸序列的蛋白的多核苷酸； (y)编码SEQ ID N0:48所示氨基酸序列的蛋白的多核苷酸； (z)编码SEQ ID NO:56所示氨基酸序列的蛋白的多核苷酸； (aa)编码SEQID NO:58所示氨基酸序列的蛋白的多核苷酸； (ab)编码(a)至(aa)任一所示氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且能够利用光能催化水的裂解和2，3，5-三甲基-1，4-对苯醌的还原的蛋白的多核苷酸； (ac)编码与(a)至(aa)任一氨基酸序列的蛋白的序列同源性高于70%，且能够利用光能催化水的裂解和2，3，5-三甲基-1，4-对苯醌的还原的蛋白的多核苷酸；或 (ad)与上述(a)-(ac)任一所述多核苷酸互补的多核苷酸。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的编码荧光蛋白或其经一个或多个氨基酸位点突变后荧光强弱或荧光发射光谱发生变化的，但依然能够利用光能催化水的裂解和2，3，5-三甲基-1，4-对苯醌的还原的突变体蛋白的多核苷酸选自下组: (a)如SEQID N O:3所示核苷酸序列的多核苷酸； (b)如SEQID NO:9所示核苷酸序列的多核苷酸； (c)如SEQID NO:35所示核苷酸序列的多核苷酸； (d)如SEQID NO:5所示核苷酸序列的多核苷酸； (e)如SEQID NO:27所示核苷酸序列的多核苷酸； (f)如SEQID NO:39所示核苷酸序列的多核苷酸； (g)如SEQID NO:43所示核苷酸序列的多核苷酸； (h)如SEQID NO:51所示核苷酸序列的多核苷酸； (i)如SEQID NO:7所示核苷酸序列的多核苷酸； (j)如SEQ ID NO: 11所示核苷酸序列的多核苷酸； (k)如SEQ ID NO: 13所示核苷酸序列的多核苷酸； (I)如SEQ ID NO: 15所示核苷酸序列的多核苷酸； (m)如SEQ ID NO: 17所示核苷酸序列的多核苷酸； (η)如SEQ ID NO: 19所示核苷酸序列的多核苷酸； (ο)如SEQ ID Ν0:49所示核苷酸序列的多核苷酸； (P)如SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的多核苷酸； (q)如SEQ ID NO:21所示核苷酸序列的多核苷酸； (r)如SEQ ID NO:23所示核苷酸序列的多核苷酸； (s)如SEQ ID NO:25所示核苷酸序列的多核苷酸； (t)如SEQ ID NO:29所示核苷酸序列的多核苷酸； (u)如SEQ ID NO:33所示核苷酸序列的多核苷酸； (V)如SEQ ID N0:41所示核苷酸序列的多核苷酸； (w)如SEQ ID NO:45所示核苷酸序列的多核苷酸； (x)如SEQ ID NO:31所示核苷酸序列的多核苷酸； (y)如SEQ ID NO:47所示核苷酸序列的多核苷酸； (z)如SEQ ID NO:55所示核苷酸序列的多核苷酸；(aa)如SEQID NO:57所示核苷酸序列的多核苷酸；或 (ab)与(a)-(aa)任一所述的多核苷酸互补的多核苷酸。
5.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的编码非荧光生色蛋白或其经一个或多个氨基酸位点突变后依然能够利用光能催化水的裂解和2，3，5-三甲基-1，4-对苯醌的还原的突变体蛋白的多核苷酸选择下组: (a)SEQ ID NO: 38所不氣基酸序列的蛋白； (b)将(a)所示氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且能够利用光能催化水的裂解和2，3，5-三甲基-1，4-对苯醌的还原的蛋白； (c)与(a)所示氨基酸序列的蛋白的序列同源性高于70%，且能够利用光能催化水的裂解和2，3，5-三甲基-1，4-对苯醌的还原的蛋白；或 (d)与(a)-(c)任一所述多核苷酸互补的多核苷酸。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的编码非荧光生色蛋白或其经一个或多个氨基酸位点突变后依然能够利用光能催化水的裂解和2，3，5-三甲基-1，4-对苯醌的还原的突变体蛋白的多核苷酸选自下组: (a)如SEQID NO:37所示核苷酸序列的多核苷酸；或 (b)与(a)所述的多核 苷酸互补的多核苷酸。
7.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的编码光能吸收和传递蛋白的多核苷酸还选自:编码选自下列GenBank登录号的蛋白的多核苷酸:
AF168421、AY646070、AY646072、AY646071、AF168424、AF168420、AY182022、AY182023、DQ206381、DQ206392、DQ206382、AY181556、AY679113、EU498721、AY182017、AY646069、AY646066、AY151052、EU498722、AY647156、AY508123、AY508124、AY508125、AF435432、AY646067、AY485334、AY485335、AY646068、AF545827、AF545830、AY037776、AB180726、DQ206383、DQ206395、DQ206396、DQ206385、EU498723、AB193294、AY182020、AY182021、AB107915、DQ206389、P42212、AY268073、AY181553、AY181554、AY181555、DQ206393、AY155344、AY037766、AY679112、AF401282、EU498724、AY268076、AY268074、AY268075、AY268071、AY268072、DQ206391、AY015995、AY182014、AF372525、EU498725、DQ206390、AF168422、AY646073、AY296063、AF272711、AB128820、DQ206379、DQ206380、AF168419、AY059642、EF186664、AF420591、DQ206387、AY182019、AY765217、AB085641、AY181552、DQ206386、AY182013、AY646064、AY485333、AF168423、AY646077、AY646076、AY646075、EF587182、AF363775、AF383155、DQ206394、DQ206376、AF38315、AF363776、AY461714、AB209967、DQ206377、DQ206378 ;或上述蛋白经一个或多个氨基酸位点突变后荧光强弱或荧光发射光谱发生变化的，但依然能够利用光能催化水的裂解和2，3，5-三甲基-1，4-对苯醌的还原的突变体蛋白。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述将多核苷酸转化入藻类方法包括:将含有编码光能吸收和传递蛋白的多核苷酸的表达盒转入藻类中，从而在藻类中表达上述多核苷酸。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的光能吸收和传递蛋白的多核苷酸通过同源重组的方式转化进入藻类；更佳地，使得光能吸收和传递蛋白的多核苷酸整合到植物类囊体膜上。
10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的改良藻类性状选自下列一种或几种: 提高藻类的生物量； 促进藻类生长； 提高藻类的光利用效率； 增加藻类PSI或PSII的光化学效率； 增加藻类光合电子传递效率； 提闻操类对CO2的同化能力； 提高藻类的净光合效率； 提高藻类的光合器官的光保护能力； 提高藻类中光合辅助色素的含量；或 提高藻类的光合放氧速率。
11.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的藻类是真核藻类或原核藻类。所述的藻类含有光合机构或含有叶绿素。
12.光能吸收和传递蛋白或编码光能吸收和传递蛋白的多核苷酸的用途，用于改良藻类性状。
13.一种藻类，其特征在于，所述藻类的细胞中含有外源的一种或多种编码光能吸收和传递蛋白的多核苷酸。
【文档编号】C12N1/13GK103911291SQ201210594376
【公开日】2014年7月9日 申请日期:2012年12月31日 优先权日:2012年12月31日
【发明者】米华玲, 陈根云, 蔡伟明, 孙卫宁, 朱新广 申请人:中国科学院上海生命科学研究院