检测男性不育症Dmc1基因1个致病突变位点的试剂盒及其PCR扩增方法

检测男性不育症Dmc1基因1个致病突变位点的试剂盒及其PCR扩增方法
【专利摘要】本发明公开了一种检测男性不育症Dmc1基因中1个致病突变位点的试剂盒及其PCR扩增方法。其方法特点是经耐3’-5’外切酶酶切修饰的突变检测引物在高保真DNA聚合酶参与的PCR反应中，从而提高PCR的特异性，可直接观察凝胶电泳的产物条带的有无来判断Dmc1基因相应突变位点的基因型。本检测试剂盒对仪器设备要求低，操作简单，经济，无需测序，一般分子生物学实验室即可操作。
【专利说明】检测男性不育症Dmcl基因1个致病突变位点的试剂盒及其PCR扩增方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物医学领域中的临床检测技术，涉及对人类男性不育症基因致病突变位点的检测方法。
[0002]本发明提供一种检测人类男性不育症致病基因突变的PCR试剂盒。本发明的内容涉及一种检测男性不育症Dmcl基因中I个致病突变位点的试剂盒及其PCR扩增方法，该检测结果可用来临床辅助检测男性不育症。
【背景技术】
[0003]男性不育症，是指男子在规律性生活且未避孕的情况下，一年内未使健康配偶妊娠。男性不育症(MaleInfertility)严重影响现代男性健康和家庭幸福，据WTO统计表明:育龄夫妇约15%不能生育，其中男性因素占50%。导致男性不育的原因复杂广泛，涉及生殖系统解剖结构和功能、激素调节、遗传物质、感染免疫等诸多方面的异常和障碍。其中相当一部分属于原因不明的特发性不育，包括特发性无精子、弱精子、少精子、畸形精子症。
[0004]目前，分子生物学方法已经深入到男性不育症研究当中。导致男性不育的遗传损害是多种多样的，除了染色体非整倍体畸形和基因重排，还包括微缺失和单个基因缺陷。小鼠和果蝇基因敲除实验发现超过3000个基因涉及雄性生育能力的遗传调控，相关基因不仅涉及生精细胞系，还包括与性腺及躯体发育相关的功能基因调控网络。目前发现了一大批涉及男性不育的染色体畸形和多效性单基因遗传病。
[0005]1.AZF 基因
[0006]1976年,Tiepolo和Zuffardi通过核型分析发现了 6例无精子症患者Y染色体长臂的微缺失并提出了无精子因子(AZF)概念，随后的研究将其定位于Yqll.23，AZFa缺失表现为唯支持细胞综合征，AZFb缺失表现为生精阻滞，AZFc缺失的病理表现为从正常到无精子。AZF并不是单一的基因，而是在功能上相互关联的基因家族，在精子发生、发育和成熟中发挥重要作用，各种研究表明严重精子发生障碍包括无精子症患者中约有3% -15%具有Y染色体微缺失。
[0007]2.X来源睾丸特异性逆基因
[0008]在精子发生的减数分裂期，性染色体隔离为XY小体，处于转录失活状态，X染色体上活跃表达的管家基因也停止转录，而在此时，常染色体上一些X染色体来源睾丸特异性逆基因开始转录表达，对其前辈基因的缺失表达起到补偿作用，这称为补偿假说，该假说认为逆基因在精子发生中发挥重要作用，它们的突变可能导致男性不育症的发生。一名少精子症男子发生在10q22的交互易位，CSTE2T基因就位于10q22~q23，研究推断少精子症的发生与其有关。
[0009]3.性激素相关基因
[0010]比较常见的有雄激素受体基因(AR)，卵泡刺激素受体基因(FSHR)，黄体生成素受体基因(LHR)，促性腺激素基因，促性腺激素释放激素受体基因(GnRHR)。其中，人FSH受体基因第7个外显子的纯合子点突变表现为不同程度的生精损害。LHR基因突变导致的功能丧失会引起睾丸间质细胞发育不良，轻者表现为性腺功能减退，重者表现为男性假两性畸形。FSH-b突变的男性呈现无精子症的表现。
[0011]4.线粒体相关基因
[0012]线粒体DNA的完整性和精子活动及精液质量普遍相关。KaoS在1995年发现，活动力最低的精子细胞拥有最高的4977bp mtDNA缺失率，认为mtDNA突变在精子病变中发挥重要作用。
[0013]5.人类生精阶段标志基因
[0014]精子的生成需要经历有丝分裂、减数分裂和精子形成等几个阶段，不育症患者可出现不同阶段的生精阻滞。研究发现，在某一个阶段特异性的表达某些调控生精的关键基因，利用睾丸活检组织进行特定基因表达谱检测，就可了解精子发生阻滞的阶段。[0015]随着分子生物学技术的进步和男性不育症致病基因定位的日渐明确，通过聚合酶链式反应(PCR)和基因测序等技术进行分子检测逐渐大行其道，其中，“分子开关”检测突变由于其操作简单、不用测序、成本低廉等优势，成为广泛应用的一项技术。
[0016]高保真DNA聚合酶在进行DNA扩增时，当引物与模板完全配对时，则在聚合酶的聚合中心直接进行聚合反应；当引物与模板不完全配对时，则送到酶解中心进行校正，校正后的引物再被送回聚合中心进行聚合反应；如果引物不能被即时校正，则PCR反应无法正常进行，从而引发聚合反应的非成熟性终止。于是产生了“配对引物可以延伸，不配对引物不延伸”二元化效果。在进行点突变分析时，就可以利用这种二元化效果对特定位点进行非此即彼的二元化识别。而且，聚合酶对错配碱基的识别并不局限于引物的3’末端或新生DNA分子，也能识别3’末端上游I个至数个碱基距离的错配。根据这一特征，可以认为高保真聚合酶对DNA合成时的碱基错配存在一个反复识别的过程。由此，可以将耐外切酶消化的硫化磷酸修饰的碱基特异性引物结合具有3’ -5’外切酶活性的高保真DNA聚合酶进行PCR反应，而构成了受单碱基差异调控的复合突变敏感性“分子开关”。
[0017]该突变敏感性“分子开关”已经成功应用于神经性耳聋GJB3基因和苯丙酮尿症PAH基因突变位点的检测；对性染色体以及线粒体上的SNP位点的检测也取得成功，说明“分子开关”突变检测技术是一种简便经济实用的突变检测方法。本专利运用突变敏感性“分子开关”突变检测技术，建立了男性不育症Dmcl基因的I个致病突变位点的检测方法。

【发明内容】

[0018]本发明的目的在于提供了一种检测人类男性不育症致病基因突变的PCR试剂盒及相应的PCR扩增方法。目的是建立导致人类男性不育症的Dmcl基因中I个致病突变位点的检测方法，该检测结果用于判读患者是否携带Dmcl致病突变。
[0019]本发明的技术要点是设计引物，根据目的片段的有无为临床诊断提供依据。为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下:
[0020]根据男性不育症的Dmcl基因中I个致病突变位点G817C设计以下引物:
[0021]正常模板配对引物G817C N F:5’-TCAAATGACTGCCGA_3’;突变模板配对引物G817CM F:5’-TCAAATGACTGCCCA-3’;共同的下游引物 G817C R:5’-AGGTTCAAGTGATTC-3’。其中，所述正常模板配对引物G817C N F和突变模板配对引物G817C M F的3’端的-3与-2位碱基之间的磷酸二酯键采用磷硫酰修饰，或将-2位碱基经锁核酸化(LNA)修饰。其扩增产物长度318bp，其序列见序列表中的序列4。
[0022]本发明提供了检测一种男性不育症Dmcl基因中I个致病突变位点G817C的试剂盒，包括:2XPCR反应mix。mix中含有PCR反应缓冲液、dNTP、引物、耐热性高保真pfu DNA聚合酶、溴酚蓝上样缓冲液。
[0023]为达到上述目的，本发明采用的技术方案是:一种采用权利要求1和4所述的试剂盒检测男性不育症Dmcl基因I个致病突变位点的一套操作流程，包括:
[0024]1，PCR扩增采用权利要求书I的一组引物。
[0025]2，PCR扩增由预变性和30-40次扩增温度循环组成。PCR反应条件为:95°C预变性IOmin, 94°C变性 30sec，55°C退火 30sec，72°C延伸 30sec，循环 30-40 次。循环结束后 72°C补齐延伸IOmin后反应结束。琼脂糖电泳分析鉴定PCR产物。将样品及阳性和阴性对照一起电泳鉴定，完成后，将凝胶经溴化乙锭染色后在紫外灯下观察，比较各泳道电泳条带情况，以判定样品为受检样品是否带有致病突变。
[0026] 上述技术方案中，所述引物是PCR技术中重要的组成部分，它是一小段单链DNA，作为DNA复制的起始点。
[0027]上述方案中，在运用PCR扩增方法时，将以上所列针对不同突变位点的一组引物中，突变模板配对引物与下游引物为一对，正常模板配对引物与下游引物为另外一对，这两对引物分别与该组对应检测位点基因型位置的DNA模板，PCR反应mix构成两个单独的反应体系；分别对2个单独的反应体系进行PCR扩增。
[0028]由于上述技术方案的运用，本发明与现有技术相比具有下列优点和效果:
[0029]1，本发明采用特殊设计并经修饰的引物，其PCR产物特异性非常高。利用该基因检测方法，在完成PCR反应和凝胶电泳后，可直接观察产物条带的有无来判断男性不育症Dmcl基因I个致病突变位点的基因型。
[0030]2，本发明操作简单，经济，无需测序，一般分子生物学实验室即可操作。
【专利附图】

【附图说明】
[0031]附图1:本发明采用PCR扩增方法检测Dmcl基因G817C位点得到的凝胶电泳图(第一组引物，三个样本)。
[0032]第1 泳道，100bp DNA Ladder Marker,条带大小(bp)由上至下分别为 1500、1000、900、800、700、600、500、400、300、200、100(下同);第 2 泳道，样品 1，引物 G817C N F和G817C R配对的PCR产物电泳图；第3泳道，样品1，引物G817C M F和G817C R配对的PCR产物电泳图；第4泳道，样品2，引物G817C N F和G817C R配对；第5泳道，样品2，引物G817C M F和G817C R配对的PCR产物电泳图；第6泳道，样品3，引物G817C N F和G817CR配对的PCR产物电泳图；第7泳道，样品3弓丨物G817CMF和G817C R配对的PCR产物电泳图。
【具体实施方式】
[0033]下面结合【具体实施方式】对本发明作进一步说明，但本发明不受实施例的限制。
[0034]所有实施例中的分子生物学操作方法为该领域技术人员所熟悉，可以参考Sambrook等“分子克隆”(实验室手册，冷泉港，1989)及“精编分子生物学实验指南”(美/F.奥斯伯等著，颜子颖等译，北京，科学出版社，1998)。
[0035]实施例一
[0036] 以人类男性不育症Dmcl基因致病位点G817C所在的Dmcl基因的第11外显子DNA序列为模板，利用软件primer premier 5.0设计引物。
[0037]检测G817C突变位点的引物的碱基序列:
[0038]正常模板配对引物G817C N F:5’-TCAAATGACTGCCGA_3’;突变模板配对引物G817CM F:5’-TCAAATGACTGCCCA-3’;共同的下游引物 G817C R:5’-AGGTTCAAGTGATTC-3’。其中，所述正常模板配对引物G817C N F和突变模板配对引物G817C M F的3’端的-3与-2位碱基之间的磷酸二酯键采用磷硫酰修饰，或将-2位碱基经锁核酸化(LNA)修饰。
[0039]实施例二
[0040]取受检患者血液样品，提取DNA后，才用引物试剂盒使用流程操作。PCR产物用凝胶电泳系统进行鉴定，根据电泳条带的有无来判断Dmcl基因G817C突变位点的基因型。具体判断方法如下:
[0041 ] 1，当突变模板配对引物与下游引物组成的一对引物对未知的DNA模板进行PCR扩增，如果观察到目的电泳条带则表明该未知DNA模板在相应的检测位点含有突变型基因。
[0042]2，当正常模板配对弓丨物与下游引物组成的一对引物对未知的DNA模板进行PCR扩增，如果观察到目的电泳条带则表明该未知DNA模板在相应的检测位点含有正常型基因。
[0043]3，当上述两对引物都对未知DNA模板进行扩增并通过电泳观察到目的条带，则表明该检测位点为杂合型。
[0044]PCR扩增结果如附图一所示。根据PCR产物电泳条带状况判断，样品I的Dmcl基因中G817C位点为正常纯合；样品2的基因型为突变纯合；样品3的基因型为杂合。将该片段送测序，测序结果印证了 PCR检测结果正确。由此判断，样品I的携带者患有遗传病男性不育症的几率很低；样品2的携带者患有遗传性男性不育症的几率极高。
[0045]实施例三
[0046]取受检患者血液样品，提取DNA后，试剂盒使用流程操作。PCR产物用凝胶电泳系统进行鉴定，根据电泳条带的有无来判断Dmcl基因G817C突变位点的基因型。具体判断方法同实施例一。PCR扩增结果如附图二所示。根据PCR产物电泳条带状况判断，样品I的Dmcl基因中G817C位点为正常纯合；样品2的基因型为突变纯合；样品3的基因型为杂合。将该片段送测序，测序结果印证了 PCR检测结果正确。由此判断，样品I的携带者患有遗传病男性不育症的几率很低；样品2的携带者患有遗传性男性不育症的几率极高。
【权利要求】
1.一种检测人类男性不育症致病基因突变的PCR试剂盒。其特征在于:所述试剂盒包括检测男性不育症Dmcl基因中I个致病突变位点G817C的一组特异性引物中及PCR反应mix。
2.根据权利要求1，以男性不育症Dmcl基因致病位点G817C所在的Dmcl基因的第11外显子DNA序列为模板设计引物。其特征在于:针对致病位点G817C所设计的引物对中，正常模板配对引物中上游引物的3’端含有序列TGCCGA或下游引物的3’端含有序列GGATCG，突变模板配对引物中上游引物的3’端含有序列TGCCCA或下游引物的3’端含有序列GGATGG。其中3’端的-3与-2位碱基之间的磷酸二酯键采用磷硫酰修饰，或将_2位碱基经锁核酸化(LNA)修饰。
3.根据权利要求2，优选的一组特异性引物的序列分别如下所示。 正常模板配对引物G817C N F:5’ -TCAAATGACTGCCGA-3’ ；突变模板配对引物G817C MF:5’ -TCAAATGACTGCCCA-3’;共同的下游引物 G817C R:5’ -AGGTTCAAGTGATTC-3’。其中，所述正常模板配对引物G817C N F和突变模板配对引物G817C M F的3’端的-3与-2位碱基之间的磷酸二酯键采用磷硫酰修饰，或将-2位碱基经锁核酸化(LNA)修饰。
4.根据权利要求3，所述正常模板配对引物及突变模板配对引物的3’端的-3与-2位碱基之间的磷酸二酯键采用磷硫酰修饰，或将-2位碱基经锁核酸化(LNA)修饰。
5.一种采用权利要求1和2检测人类男性不育症Dmcl基因中I个致病突变位点G817C的PCR扩增方法，其特征在于:PCR扩增由预变性和30-40次扩增温度循环组成，循环条件为 95°C预变性 10min，94°C变性 30sec，55°C退火 30sec，72°C延伸 30sec，循环 30-40 次。循 环结束后72°C补齐延伸IOmin后反应结束。
【文档编号】C12Q1/68GK103911424SQ201210595000
【公开日】2014年7月9日 申请日期:2012年12月28日 优先权日:2012年12月28日
【发明者】朱威, 贺雄雷, 潘武广, 郭蕾, 雷楗勇, 潘岷溟 申请人:广州君赫生物科技有限公司