幽门螺旋杆菌及其耐药基因突变检测试剂盒和检测方法与流程

本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及一种幽门螺旋杆菌及其耐药基因突变检测试剂盒和检测方法，该试剂盒用于PCR体外扩增法检测胃粘膜组织、胃液中的幽门螺旋杆菌 23S rRNA基因及其变异，适用于幽门螺旋杆菌感染的辅助诊断。

背景技术：

幽门螺旋杆菌（Helicobacter pylori，简称Hp）是革兰氏阴性、微需氧的细菌，生存于胃部及十二指肠的各区域内。在人群中具有较高的感染率。随着幽门螺旋杆菌(H pylori)在人群中传播广泛，以及抗生素的广泛应用，H pylori耐药菌株的发生率逐年上升，根除的难度逐渐增加。最近报道H pylori耐药是全球性的，其耐药是导致根除治疗失败的主要原因。对H pylori根除治疗的常用抗生素有：克拉霉素、甲硝唑、阿莫西林、四环素及喹诺酮类等，大多数H pylori菌株对这些抗生素的耐药是由突变引起的，包括自发突变和通过耐药信息的传递引起的突变等。根据中华医学会消化病学会Hp学组2005年对全国16个省市340例Hp耐药情况进行的多中心研究表明，对克拉霉素的耐药率为27.6%，有文献表明幽门螺旋杆菌的23S rRNA第2142或2143位点变异和克拉霉素耐药相关。H pylori对抗生素耐药的检测目前已经不再局限于传统的药物敏感性试验，由传统的细菌培养、药物敏感试验逐渐转向分子生物学检测方法。耐药基因突变的检测若能成为H pylori检查的常规项目，无论从患者的医药费开支还是药物对患者引起的不良反应方面，均有重要意义。

目前临床检测幽门螺旋杆菌主要包括Hp培养，尿素酶实验，Hp糖体ELESA检测和免疫印迹检测法。培养的方法需要1~2周时间，免疫方法不能直接检测菌体，且不能检测是否耐药。

幽门螺旋杆菌耐药的检测主要是通过细菌培养进行检测以及基于聚合酶链式反应为基础的分子生物学技术。包括方法主要有聚合酶链式反应－限制性片段长度多态性分析技术（实时定量PCR(real-time PCR)）结合溶解曲线(melting curve）分析技术、荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization，FISH)、以PCR为基础的变性高效液相色谱分析技术（PCR -denaturing highperformance liquid chromatography,PCR-DHPLC)、优势同源形成分析技术（preferentialhomoduplexformationassay,PHFA)、反向杂交。PCR-RFLP方法简单、敏感、准确，是一种非创伤性的检测方法，临床应用前景广阔，但是存在临床标本易被污染的缺点。PCR-FISH方法不能确定除克拉霉素外其他抗生素的耐药性。以PCR为基础的变性高效液相色谱分析技术是一种简单，快速，功能强大发现基因突变的技术，但是只能提供样本有无突变的信息，需要结合序列分析才能得出具体的突变类型。总之，目前市场上的试剂盒只能单一的检测幽门螺旋杆菌存在或者是否耐药，并且PCR循环反应时间过长，一般需要2.5小时，试剂盒的保存温度一般是-20℃。

技术实现要素：

本发明旨在提供一种幽门螺旋杆菌及其耐药基因突变检测试剂盒和检测方法，利用该试剂盒能够快速、简便地检测幽门螺旋杆菌、幽门螺旋杆菌23S rRNA基因以及23S rRNA上第2142或2143位点变异。

为达到上述目的，本发明采用的技术方案是：一种幽门螺旋杆菌及其耐药基因突变检测试剂盒，包括KOD DNA 聚合酶、引物HPC-F、引物HPC-R、特异性靶向荧光探针、阳性参考品1、阳性参考品2以及阳性参考品3；

所述引物HPC-F为针对幽门螺旋杆菌23S rRNA基因设计的正向引物，该正向引物的序列为5’-GTGGAGGTGAAAATTCCTCCTACCC-3’（如SEQ NO:1所示）；

所述引物HPC-R为针对幽门螺旋杆菌23S rRNA基因设计的反向引物，该反向引物的序列为5’-GGCTCCATAAGAGCCAAAGCCCTTAC-3’ （如SEQ NO:2所示）；

所述特异性靶向荧光探针是以幽门螺旋杆菌23S rRNA野生型基因组为模板设计的探针，其碱基序列为5’- CAAGACGGAAAGACCC -3’（如SEQ NO:3所示）， 荧光染料为氟硼二吡咯；

所述阳性参考品1是以野生型幽门螺旋杆菌23S rRNA基因为模板而设计的一段线性重组DNA序列，阳性参考品1的序列为5’-GTCGGTTAAATACCGACCTGCATGAATGGCGTAACGAGATGGGAGCTGTCTCAACCAGAGATTCAGTGAAATTGTAGTGGAGGTGAAAATTCCTCCTACCCGCGGCAAGACGGAAAGACCCCGTGGACCTTTACTACAACTTAGCACTGCTAATGGGAATATCATGCGCAGGATAGGTGGGAGGCTTTGAAGTAAGGGCTTTGGCTCTTATGGAGCCATCCTTGAGATACCACCCTTGAT-3’（如SEQ NO:4所示），其中，带有下划线的碱基从左到右分别表示野生型幽门螺旋杆菌23S rRNA基因的2142和2143位点；

所述阳性参考品2是以幽门螺旋杆菌23S rRNA基因的2142位点有突变为模板而设计的一段线性重组DNA序列，阳性参考品2的序列为5’-GTCGGTTAAATACCGACCTGCATGAATGGCGTAACGAGATGGGAGCTGTCTCAACCAGAGATTCAGTGAAATTGTAGTGGAGGTGAAAATTCCTCCTACCCGCGGCAAGACGGGAAGACCCCGTGGACCTTTACTACAACTTAGCACTGCTAATGGGAATATCATGCGCAGGATAGGTGGGAGGCTTTGAAGTAAGGGCTTTGGCTCTTATGGAGCCATCCTTGAGATACCACCCTTGAT-3’（如SEQ NO:5所示），其中，带有下划线的碱基表示幽门螺旋杆菌23S rRNA基因的2142位点突变后的碱基；

所述阳性参考品3是以幽门螺旋杆菌23S rRNA基因的2143位点有突变为模板而设计的一段线性重组DNA序列，阳性参考品3的序列为5’-GTCGGTTAAATACCGACCTGCATGAATGGCGTAACGAGATGGGAGCTGTCTCAACCAGAGATTCAGTGAAATTGTAGTGGAGGTGAAAATTCCTCCTACCCGCGGCAAGACGGAGAGACCCCGTGGACCTTTACTACAACTTAGCACTGCTAATGGGAATATCATGCGCAGGATAGGTGGGAGGCTTTGAAGTAAGGGCTTTGGCTCTTATGGAGCCATCCTTGAGATACCACCCTTGAT-3’（如SEQ NO:6所示），其中，带有下划线的碱基表示幽门螺旋杆菌23S rRNA基因的2143位点突变后的碱基。

上述技术方案中的有关内容解释如下：

1、上述方案中，KOD DNA聚合酶是从鹿儿岛县小宝岛的含硫气孔中分离出来的超嗜热原始菌Thermococcus kodakaraensis KOD1提取纯化出来的，具有很强的3'→5'核酸外切酶活性(校正活性)，保真性约为Taq DNA Polymerase的50倍。具有1Kb/30s以上的DNA合成速度，该速度是最为普通的Taq聚合酶的两倍。另外，持续合成能力等较为优秀也是其伸长速度很快的主要原因之一。采用KOD DNA聚合酶，可以使一次循环的时间从原来的几分钟缩短为几十秒。生产公司为TOYOBO公司，其结构参见日本专利JP2008306935A。

2、上述方案中，所述荧光探针为QProbe，通过混合特定的排列，将具有荧光淬灭这一特征的荧光色素作为标识的探针。QProbe的结构参见日本专利JP2011097956A，利用这一特征，就无需使用插入DNA嵌入剂等其它双链核酸结构的色素，也无需使用会引起FRET现象的两种探针，而是使用在一种荧光物质中作出标识的探针，在不会阻碍高速扩增的同时，能够特异性地检测出目标核酸序列。

3、上述方案中，所述试剂盒还包括内部质控引物IC-F、内部质控引物IC-R、内部质控探针以及内部质控模板；所述内部质控引物IC-F是针对Lagarosiphon madagascariensis的matK基因设计的正向引物，该正向引物的序列为5’-CCCGGTTATTGTAGAAATTCCTTTCTCCCGTC-3’ （如SEQ NO:7所示）；

所述内部质控引物IC-R是针对Lagarosiphon madagascariensis的matK基因设计的反向引物，该反向引物的序列为5’-CCCCATCCAGGATTGTAGAATTTGAATCAAG-3’ （如SEQ NO:8所示）；

所述内部质控探针是以Lagarosiphon madagascariensis的matK基因为模板而设计的探针，该探针的序列为5’-GATCTATTCATTCGATATTCC-3’ （如SEQ NO:9所示）；

所述内部质控模板为Lagarosiphon madagascariensis的matK基因的一个片段，内部质控模板的序列为5’-GCGGTTATTGTAGAAATTCCTTTCTCCCGTCCATTTTTTCTTGAAGAAAAAAAAGAAATACCAAAATATCAAAATTTACGATCTATTCATTCGATATTCCCTTTTTTAGAGGACAAATTTTTACATTTAAATTATGTGTCTGATATAGTAATACCTTATCCTATTCATCTCGAAATCTTGATTCAAATTCTACAATCCTGGAT-3’ （如SEQ NO:10所示）。

所述Lagarosiphon madagascariensis（拉丁文学名）是一种水草、有茎草，主要分布在马达加斯加。

4、上述方案中，所述阳性参考品1、阳性参考品2以及阳性参考品3均是事先设计好的、当做已知浓度及碱基序列的样本，和其他被检样本一起进行检测，从而验证检测结果的准确性。

为达到上述目的，本发明还一种幽门螺旋杆菌及其耐药基因突变的检测方法，包括以下步骤：

第一步，准备目标物，以目标物作为检测的对象，目标物为不经任何处理的被检样本或者为从被检样本中提取的幽门螺旋杆菌核酸，所述被检样本为胃粘膜组织、牙菌斑或漱口水；

第二步，以所述目标物为模板基因链，利用权利要求1或2所述试剂盒进行荧光定量PCR扩增反应，荧光定量PCR扩增反应的反应体系为：

引物HPC-F 0.1μmol/L，0.52至1.04μL；

引物HPC-R 0.1μmol/L，0.52至1.04μL；

特异性靶向荧光探针 0.1μmol/L，0.4至0.8μL；

内部质控引物IC-F 0.1μmol/L，0.52至1.04μL；

内部质控引物IC-R 0.1μmol/L，0.52至1.04μL；

内部质控探针 0.1μmol/L，0.4至0.8μL；

内部质控模板 4ng/μL，1.8至3.6μL；

MgCl₂*6H₂O 0.35g/L，0.52至1.04μL；

dNTPs 0.02mM，0.4至0.8μL；

KOD DNA 聚合酶 0.02U/μL，0.4至0.8μL；

KOD buffer 3.2至6.4μL；

模板 4至8μL；

第三步，用高分辨率熔解曲线法进行检出，检出条件依次为：

（1）94.0 ℃，30.0秒，

（2）39.0 ℃，30.0秒，

（3）40.0~75.0℃，0.09℃/秒；

第四步，检出结果通过阳性判断值来判断，阳性判断值的三种结果的判断依据为：

（1）幽门螺旋杆菌菌群阳性及23S rRNA基因2142和2143位点无突变：荧光微分值≥10，并且熔解曲线峰值所在的熔解温度在50℃~60℃之间；

（2）幽门螺旋杆菌菌群阳性及23S rRNA基因2142或2143位点有突变：荧光微分值≥10，并且熔解曲线峰值所在的熔解温度在42℃~50℃之间；

（3）幽门螺旋杆菌菌群阴性：无荧光微分值，内部质控荧光微分值≥1.0，且其熔解曲线峰值所在的熔解温度在42℃~68℃之间；

所述荧光微分值是指对检测到的目标物的荧光强度随温度变化的值做微分求导，得到荧光微分值。

1、上述方案中，所述dNTP是脱氧腺苷三磷酸（dATP）、脱氧胞苷三磷（dCTP）、脱氧鸟苷三磷酸（dGTP）、脱氧胸腺三磷酸（dTTP）的混合物。

2、上述方案中，所述第二步的荧光定量PCR扩增反应的反应过程如下：

（1）94.0℃预变性30.0秒，

（2）97.0℃变性1.0秒，

（3）60.0℃退火3.0秒，

（4）63.0℃延伸 5.0秒，其中，步骤（2）~（4）循环50次。

3、上述方案中，高分辨熔解曲线（high-resolution melt，HRM) 分析技术是近几年来在国外兴起的一种用于突变扫描和基因分型的最新遗传学分析方法，是一种基于单核苷酸熔解温度不同而形成不同形态熔解曲线的基因分析新技术，具有极高的敏感性，可以检测出单个碱基的差异，并且成本低、通量高、速度快、结果准确、不受检测位点的局限，实现了真正的闭管操作。

本发明的设计原理是：本发明的试剂盒采用PCR法对目标核酸进行扩增，并采用荧光标记探针（QProbe）检测目标核酸的方法，来检测幽门螺旋杆菌的23S rRNA基因及其第2142或2143位点变异的试剂盒。以幽门螺旋杆菌的23S rRNA基因领域为目标模板基因链，加入正向引物和反向引物，进行变性、退火，采用能高速扩增的KOD DNA 聚合酶催化各引物延伸基因链。这时，dNTP底物，镁离子的酶活性作用于退火的引物进行延伸，反复进行来扩增目标基因链。之后，扩增核酸和幽门螺旋杆菌23S rRNA基因特异性配对的HPC Qprob探针杂交结合，通过引起的荧光变化来检测幽门螺旋杆菌的23S rRNA基因。利用全自动核酸提纯及荧光定量PCR分析系统（采用的仪器为全自动基因分析仪GENECUBE，生产商为TOYOBO）检测幽门螺旋杆菌的23S rRNA第2142或2143位点变异，能够准确确认幽门螺旋杆菌及其耐药变异，帮助临床医师决定根除Hp治疗的最适三联疗法方案，临床医师据此可决定适合患者的药物、剂量及经济的治疗方案，为临床合理用药、个体化用药和治疗提供强有力的手段。

本发明有益效果：

（1）现有PCR反应体系的量一般需要40μＬ，而本发明的荧光定量PCR扩增反应体系的量最低仅为13.2μＬ。

（2）本发明的荧光定量PCR扩增反应时间大大缩短，变性、退火、延伸的50次循环最低仅需0.5个小时即可完成。

（3）现有的幽门螺旋杆菌耐药基因突变检测试剂盒需要在-20℃条件下保存，而本发明的试剂盒在2~8℃条件下即可保存。

（4）本发明采用全封密的PCR扩增，可防止携带污染等造成假阳性结果的发生。

总之，本发明的试剂盒及其检测方法对幽门螺旋杆菌能够快速、简便、准确地检测幽门螺旋杆菌、幽门螺旋杆菌23S rRNA基因以及23S rRNA上第2142或2143位点变异。

附图说明

附图1为幽门螺旋杆菌菌群阳性及23S rRNA基因2142和2143位点无突变时的荧光定量PCR扩增熔解曲线图，横坐标是温度，纵坐标是荧光微分值；

附图2为幽门螺旋杆菌菌群阳性及23S rRNA基因2142位点有突变时的荧光定量PCR扩增熔解曲线图，横坐标是温度，纵坐标是荧光微分值；

附图3为幽门螺旋杆菌菌群阳性及23S rRNA基因2143位点有突变时的荧光定量PCR扩增熔解曲线图，横坐标是温度，纵坐标是荧光微分值；

附图4为幽门螺旋杆菌菌群阴性时的荧光定量PCR扩增熔解曲线图，横坐标是温度，纵坐标是荧光微分值；

附图5为内部质控品的荧光定量PCR扩增熔解曲线图，横坐标是温度，纵坐标是荧光微分值。

具体实施方式

下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述：

实施例：幽门螺旋杆菌及其耐药基因突变检测试剂盒和检测方法

该幽门螺旋杆菌耐药基因突变检测试剂盒包括KOD DNA 聚合酶、引物HPC-F、引物HPC-R、特异性靶向荧光探针、阳性参考品1、阳性参考品2以及阳性参考品3；

所述引物HPC-F为针对幽门螺旋杆菌23S rRNA基因设计的正向引物，该正向引物的序列为5’-GTGGAGGTGAAAATTCCTCCTACCC-3’；

所述引物HPC-R为针对幽门螺旋杆菌23S rRNA基因设计的反向引物，该反向引物的序列为5’-GGCTCCATAAGAGCCAAAGCCCTTAC-3’；

所述特异性靶向荧光探针是以幽门螺旋杆菌23S rRNA野生型基因组为模板设计的探针，其碱基序列为5’- CAAGACGGAAAGACCC -3’， 荧光染料为氟硼二吡咯；

所述阳性参考品1是以野生型幽门螺旋杆菌23S rRNA基因为模板而设计的一段线性重组DNA序列，阳性参考品1的序列为5’-GTCGGTTAAATACCGACCTGCATGAATGGCGTAACGAGATGGGAGCTGTCTCAACCAGAGATTCAGTGAAATTGTAGTGGAGGTGAAAATTCCTCCTACCCGCGGCAAGACGGAAAGACCCCGTGGACCTTTACTACAACTTAGCACTGCTAATGGGAATATCATGCGCAGGATAGGTGGGAGGCTTTGAAGTAAGGGCTTTGGCTCTTATGGAGCCATCCTTGAGATACCACCCTTGAT-3’ ，其中，带有下划线的碱基从左到右分别表示野生型幽门螺旋杆菌23S rRNA基因的2142和2143位点；

所述阳性参考品2是以幽门螺旋杆菌23S rRNA基因的2142位点有突变为模板而设计的一段线性重组DNA序列，阳性参考品2的序列为5’-GTCGGTTAAATACCGACCTGCATGAATGGCGTAACGAGATGGGAGCTGTCTCAACCAGAGATTCAGTGAAATTGTAGTGGAGGTGAAAATTCCTCCTACCCGCGGCAAGACGGGAAGACCCCGTGGACCTTTACTACAACTTAGCACTGCTAATGGGAATATCATGCGCAGGATAGGTGGGAGGCTTTGAAGTAAGGGCTTTGGCTCTTATGGAGCCATCCTTGAGATACCACCCTTGAT-3’，其中，带有下划线的碱基表示幽门螺旋杆菌23S rRNA基因的2142位点突变后的碱基；

所述阳性参考品3是以幽门螺旋杆菌23S rRNA基因的2143位点有突变为模板而设计的一段线性重组DNA序列，阳性参考品3的序列为5’-GTCGGTTAAATACCGACCTGCATGAATGGCGTAACGAGATGGGAGCTGTCTCAACCAGAGATTCAGTGAAATTGTAGTGGAGGTGAAAATTCCTCCTACCCGCGGCAAGACGGAGAGACCCCGTGGACCTTTACTACAACTTAGCACTGCTAATGGGAATATCATGCGCAGGATAGGTGGGAGGCTTTGAAGTAAGGGCTTTGGCTCTTATGGAGCCATCCTTGAGATACCACCCTTGAT-3’，其中，带有下划线的碱基表示幽门螺旋杆菌23S rRNA基因的2143位点突变后的碱基。

所述试剂盒还包括内部质控引物IC-F、内部质控引物IC-R、内部质控探针以及内部质控模板；

所述内部质控引物IC-F是针对Lagarosiphon madagascariensis的matK基因设计的正向引物，该正向引物的序列为5’-CCCGGTTATTGTAGAAATTCCTTTCTCCCGTC-3’；

所述内部质控引物IC-R是针对Lagarosiphon madagascariensis的matK基因设计的反向引物，该反向引物的序列为5’-CCCCATCCAGGATTGTAGAATTTGAATCAAG-3’；

所述内部质控探针是以Lagarosiphon madagascariensis的matK基因为模板而设计的探针，该探针的序列为5’-GATCTATTCATTCGATATTCC-3’；

所述内部质控模板为Lagarosiphon madagascariensis的matK基因的一个片段，内部质控模板的序列为5’-GCGGTTATTGTAGAAATTCCTTTCTCCCGTCCATTTTTTCTTGAAGAAAAAAAAGAAATACCAAAATATCAAAATTTACGATCTATTCATTCGATATTCCCTTTTTTAGAGGACAAATTTTTACATTTAAATTATGTGTCTGATATAGTAATACCTTATCCTATTCATCTCGAAATCTTGATTCAAATTCTACAATCCTGGAT-3’。

所述内部质控引物IC-F、内部质控引物HPC-R、内部质控探针以及内部质控模板用于验证所述试剂盒在检测幽门螺旋杆菌耐药基因突变时是否真实、有效，参见附图5所示。

在实际生产中，所述幽门螺旋杆菌耐药基因突变检测试剂盒可以做成包含下列组分的试剂盒：

（1）聚合酶试剂 [ KOD Mix ]：由KOD DNA 聚合酶和dNTP组成，规格为140μＬ×1支、140μＬ×2支、140μＬ×3支或140μＬ×6支；

（2）引物・探针试剂 [ HPC Mix ]：即由引物HPC-F、引物HPC-R以及特异性靶向荧光探针组成的混合试剂，规格为140μＬ×1支、140μＬ×2支、140μＬ×3支或140μＬ×6支；

（3）阳性质控品1 [ HPC PC1 ]：即为阳性参考品1，规格为300μＬ×1支；

（4）阳性质控品2 [ HPC PC2 ]：即为阳性参考品2和阳性参考品3的混合物，规格为300μＬ×1支；

（5）阴性质控品[ HPC NC ]：即为不含有DNA的缓冲液，规格为300μＬ×1支；

阳性参考品1、阳性参考品2、阳性参考品3均是构建到载体质粒上保存。质粒构建过程如下：

引物设计——pcr扩增——割胶回收DNA片段——构建载体——转化培养——阳性克隆鉴定——37℃摇床培养——质粒抽提——测序确认碱基序列。

抽提后的质粒再配制成所述阳性质控品1，配制方法如下：

（1）配制稀释液：加入50%配方量的纯化水→加入Tris-HCl缓冲液（pH7.6）→加入剩余的纯化水（涡旋震荡3次，每次5秒）→得0.002mol/L的Tris-HCl（pH 7.6）稀释液；

（2）HP野生型质粒预稀释：加入50%配方量的所述稀释液→加入HP野生型质粒溶液→加入剩余的所述稀释液（涡旋震荡3次，每次5秒）→得到X拷贝/微升HP野生型质粒溶液（X代表质粒浓度的具体数值）；

（3）得到阳性质控品1：加入50%配方量的稀释液→加入X拷贝/微升HP野生型质粒溶液→加入剩余的稀释液（涡旋震荡3次，每次5秒）→得到阳性质控品1。

抽提后的质粒再配制成所述阳性质控品2，配制方法如下：

（1）配制稀释液：加入50%配方量的纯化水→加入Tris-HCl缓冲液（pH 7.6）→加入剩余的纯化水（涡旋震荡3次，每次5秒）→得0.002mol/L的Tris-HCl（pH 7.6）稀释液；

（2）HP质粒（2142位点突变）预稀释：加入50%配方量的稀释液→加入HP质粒（2142位点突变）溶液→加入剩余的稀释液（涡旋震荡3次，每次5秒）→X拷贝/微升HP质粒（2142位点突变）溶液；

（3）HP质粒（2143位点突变）预稀释：加入50%配方量的稀释液→加入HP质粒（2143位点突变）溶液→加入剩余的稀释液（涡旋震荡3次，每次5秒）→X拷贝/微升HP质粒（2143位点突变）溶液；

（4）得到阳性质控品2：加入50%配方量的稀释液→加入X拷贝/微升HP质粒（2142位点突变）溶液→加入X拷贝/微升HP质粒（2143位点突变）溶液→加入剩余的稀释液（涡旋震荡3次，每次5秒）→得到阳性质控品2。

检测方法包括以下步骤：

第一步，准备目标物，以目标物作为检测的对象，目标物为不经任何处理的被检样本或者为从被检样本中提取的幽门螺旋杆菌核酸，所述被检样本为人的胃粘膜组织，被检样本可直接上机进行检测。直接使用胃粘膜组织时，避免使用含血多的样本。如果使用血液成分含量多，或者肝素含量多的样本，请注意充分去除血液以及肝素成分。血液成分或肝素残存的情况下，会对PCR扩增反应有影响，不能正常检测。需要保存样本时，请保存在-80℃以下。使用长期冻存的样本时，务必恢复到室温后再使用；

第二步，以所述目标物为模板基因链，利用所述试剂盒进行荧光定量PCR扩增反应，荧光定量PCR扩增反应的反应体系为：

引物HPC-F 0.1μmol/L，0.52μL；

引物HPC-R 0.1μmol/L，0.52μL；

特异性靶向荧光探针 0.1μmol/L，0.4μL；

内部质控引物IC-F 0.1μmol/L，0.52μL；

内部质控引物IC-R 0.1μmol/L，0.52μL；

内部质控探针 0.1μmol/L，0.4μL；

内部质控模板 4ng/μL，1.8μL；

MgCl₂*6H₂O 0.35g/L，0.52μL；

dNTPs 0.02mM，0.4μL；

KOD DNA 聚合酶 0.02U/μL，0.4μL；

KOD buffer 3.2μL；

模板 4μL；

在上述荧光定量PCR扩增反应的反应体系中，在各组分的使用浓度不变的前提下，各组分的体积用量最多可为上述数值的2倍，即引物HPC-F的所用体积为1.04μL，引物HPC-R的所用体积为1.04μL，特异性靶向荧光探针的所用体积为0.8μL，内部质控引物IC-F的所用体积为1.04μL，内部质控引物IC-R的所用体积为1.04μL，内部质控探针的所用体积为0.8μL，内部质控模板的所用体积为3.6μL，MgCl₂*6H₂O的所用体积为1.04μL，dNTPs的所用体积为0.8μL，KOD DNA 聚合酶的所用体积为0.8μL，KOD buffer的所用体积为6.4μL，模板的所用体积为8μL。

所述荧光定量PCR扩增反应的反应过程如下：

（1）94.0℃预变性30.0秒，

（2）97.0℃变性1.0秒，

（3）60.0℃退火3.0秒，

（4）63.0℃延伸 5.0秒，其中，步骤（2）~（4）循环50次。

第三步，用高分辨率熔解曲线法进行检出，检出条件依次为：

（1）94.0 ℃，30.0秒，

（2）39.0 ℃，30.0秒，

（3）40.0~75.0℃，0.09℃/秒；

整个荧光定量PCR扩增反应直接在全自动基因分析仪GENECUBE（生产商为TOYOBO）上进行。具体步骤为：将被检样本4μL、聚合酶试剂[KOD Mix]4μL、引物・探针试剂[HPC Mix]5.2μL混合后，调制成反应液。专用吸管吸取反应液到专用塑料毛细管中。进行扩增反应。进行检出，测定波长为510nm~550nm以及573nm~613nm的荧光值。测定的荧光值由专用分析软件解析，转换成表示荧光变化量的荧光微分值。解析荧光微分值，在显示屏上显示测定结果。

第四步，检出结果通过阳性判断值来判断，阳性判断值的三种结果的判断依据为：

（1）幽门螺旋杆菌菌群阳性及23S rRNA基因2142和2143位点无突变：荧光微分值≥10，并且熔解曲线峰值所在的熔解温度在50℃~60℃之间，参见附图1所示；

（2）幽门螺旋杆菌菌群阳性及23S rRNA基因2142或2143位点有突变：荧光微分值≥10，并且熔解曲线峰值所在的熔解温度在42℃~50℃之间，参见附图2和附图3所示；

（3）幽门螺旋杆菌菌群阴性：无荧光微分值，内部质控荧光微分值≥1.0，且其熔解曲线峰值所在的熔解温度在42℃~68℃之间，参见附图4所示；

所述荧光微分值是指对检测到的目标物的荧光强度随温度变化的值做微分求导，得到荧光微分值。

只有当附图5的熔解曲线中内部质控荧光微分值≥1.0，且其熔解曲线峰值所在的熔解温度在42℃~68℃之间时，表明整个检测系统是正常、有效的，特别对于判断结果为阴性时尤其重要。

上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 踏石生物科技（苏州）有限公司

<120> 幽门螺旋杆菌耐药基因突变检测试剂盒及其检测方法

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