1.一种幽门螺旋杆菌及其耐药基因突变检测试剂盒,其特征在于:包括KOD DNA 聚合酶、引物HPC-F、引物HPC-R、特异性靶向荧光探针、阳性参考品1、阳性参考品2以及阳性参考品3;
所述引物HPC-F为针对幽门螺旋杆菌23S rRNA基因设计的正向引物,该正向引物的序列为5’-GTGGAGGTGAAAATTCCTCCTACCC-3’;
所述引物HPC-R为针对幽门螺旋杆菌23S rRNA基因设计的反向引物,该反向引物的序列为5’-GGCTCCATAAGAGCCAAAGCCCTTAC-3’;
所述特异性靶向荧光探针是以幽门螺旋杆菌23S rRNA野生型基因组为模板设计的探针,其碱基序列为5’- CAAGACGGAAAGACCC -3’, 荧光染料为氟硼二吡咯;
所述阳性参考品1是以野生型幽门螺旋杆菌23S rRNA基因为模板而设计的一段线性重组DNA序列,阳性参考品1的序列为5’-GTCGGTTAAATACCGACCTGCATGAATGGCGTAACGAGATGGGAGCTGTCTCAACCAGAGATTCAGTGAAATTGTAGTGGAGGTGAAAATTCCTCCTACCCGCGGCAAGACGGAAAGACCCCGTGGACCTTTACTACAACTTAGCACTGCTAATGGGAATATCATGCGCAGGATAGGTGGGAGGCTTTGAAGTAAGGGCTTTGGCTCTTATGGAGCCATCCTTGAGATACCACCCTTGAT-3’ ,其中,带有下划线的碱基从左到右分别表示野生型幽门螺旋杆菌23S rRNA基因的2142和2143位点的碱基;
所述阳性参考品2是以幽门螺旋杆菌23S rRNA基因的2142位点有突变为模板而设计的一段线性重组DNA序列,阳性参考品2的序列为5’-GTCGGTTAAATACCGACCTGCATGAATGGCGTAACGAGATGGGAGCTGTCTCAACCAGAGATTCAGTGAAATTGTAGTGGAGGTGAAAATTCCTCCTACCCGCGGCAAGACGGGAAGACCCCGTGGACCTTTACTACAACTTAGCACTGCTAATGGGAATATCATGCGCAGGATAGGTGGGAGGCTTTGAAGTAAGGGCTTTGGCTCTTATGGAGCCATCCTTGAGATACCACCCTTGAT-3’,其中,带有下划线的碱基表示幽门螺旋杆菌23S rRNA基因的2142位点突变后的碱基;
所述阳性参考品3是以幽门螺旋杆菌23S rRNA基因的2143位点有突变为模板而设计的一段线性重组DNA序列,阳性参考品3的序列为5’-GTCGGTTAAATACCGACCTGCATGAATGGCGTAACGAGATGGGAGCTGTCTCAACCAGAGATTCAGTGAAATTGTAGTGGAGGTGAAAATTCCTCCTACCCGCGGCAAGACGGAGAGACCCCGTGGACCTTTACTACAACTTAGCACTGCTAATGGGAATATCATGCGCAGGATAGGTGGGAGGCTTTGAAGTAAGGGCTTTGGCTCTTATGGAGCCATCCTTGAGATACCACCCTTGAT-3’,其中,带有下划线的碱基表示幽门螺旋杆菌23S rRNA基因的2143位点突变后的碱基。
2.根据权利要求1所述的一种幽门螺旋杆菌及其耐药基因突变检测试剂盒,其特征在于:所述试剂盒还包括内部质控引物IC-F、内部质控引物IC-R、内部质控探针以及内部质控模板;
所述内部质控引物IC-F是针对Lagarosiphon madagascariensis的matK基因设计的正向引物,该正向引物的序列为5’-CCCGGTTATTGTAGAAATTCCTTTCTCCCGTC-3’;
所述内部质控引物IC-R是针对Lagarosiphon madagascariensis的matK基因设计的反向引物,该反向引物的序列为5’-CCCCATCCAGGATTGTAGAATTTGAATCAAG-3’;
所述内部质控探针是以Lagarosiphon madagascariensis的matK基因为模板而设计的探针,该探针的序列为5’-GATCTATTCATTCGATATTCC-3’;
所述内部质控模板为Lagarosiphon madagascariensis的matK基因的一个片段,内部质控模板的序列为5’-GCGGTTATTGTAGAAATTCCTTTCTCCCGTCCATTTTTTCTTGAAGAAAAAAAAGAAATACCAAAATATCAAAATTTACGATCTATTCATTCGATATTCCCTTTTTTAGAGGACAAATTTTTACATTTAAATTATGTGTCTGATATAGTAATACCTTATCCTATTCATCTCGAAATCTTGATTCAAATTCTACAATCCTGGAT-3’。
3.一种幽门螺旋杆菌及其耐药基因突变的检测方法,其特征在于:该检测方法包括以下步骤:
第一步,准备目标物,以目标物作为检测的对象,目标物为不经任何处理的被检样本或者为从被检样本中提取的幽门螺旋杆菌核酸,所述被检样本为胃粘膜组织、牙菌斑或漱口水;
第二步,以所述目标物为模板基因链,利用权利要求1或2所述试剂盒进行荧光定量PCR扩增反应,荧光定量PCR扩增反应的反应体系为:
引物HPC-F 0.1μmol/L,0.52至1.04μL;
引物HPC-R 0.1μmol/L,0.52至1.04μL;
特异性靶向荧光探针 0.1μmol/L,0.4至0.8μL;
内部质控引物IC-F 0.1μmol/L,0.52至1.04μL;
内部质控引物IC-R 0.1μmol/L,0.52至1.04μL;
内部质控探针 0.1μmol/L,0.4至0.8μL;
内部质控模板 4ng/μL,1.8至3.6μL;
MgCl2*6H2O 0.35g/L,0.52至1.04μL;
dNTPs 0.02mM,0.4至0.8μL;
KOD DNA 聚合酶 0.02U/μL,0.4至0.8μL;
KOD buffer 3.2至6.4μL;
模板 4至8μL;
第三步,用高分辨率熔解曲线法进行检出,检出条件依次为:
(1)94.0 ℃,30.0秒,
(2)39.0 ℃,30.0秒,
(3)40.0~75.0℃,0.09℃/秒;
第四步,检出结果通过阳性判断值来判断,阳性判断值的三种结果的判断依据为:
(1)幽门螺旋杆菌菌群阳性及23S rRNA基因2142和2143位点无突变:荧光微分值≥10,并且熔解曲线峰值所在的熔解温度在50℃~60℃之间;
(2)幽门螺旋杆菌菌群阳性及23S rRNA基因2142或2143位点有突变:荧光微分值≥10,并且熔解曲线峰值所在的熔解温度在42℃~50℃之间;
(3)幽门螺旋杆菌菌群阴性:无荧光微分值,内部质控荧光微分值≥1.0,且其熔解曲线峰值所在的熔解温度在42℃~68℃之间;
所述荧光微分值是指对检测到的目标物的荧光强度随温度变化的值做微分求导,得到荧光微分值。
4.根据权利要求3所述的幽门螺旋杆菌及其耐药基因突变的检测方法,其特征在于:所述第二步的荧光定量PCR扩增反应的反应过程如下:
(1)94.0℃预变性30.0秒,
(2)97.0℃变性1.0秒,
(3)60.0℃退火3.0秒,
(4)63.0℃延伸 5.0秒,其中,步骤(2)~(4)循环50次。