鲍曼不动杆菌膜蛋白a1s_0851作为抗原的应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及一种鲍曼不动杆菌膜蛋白A1S_0851作为抗 原的应用。
【背景技术】
[0002] 鲍曼不动杆菌（Acinetobacterbaumannii)属于奈瑟氏菌科，不动杆菌属，是一种 不发酵糖类、氧化酶阴性、不能运动的革兰氏阴性杆菌。鲍曼不动杆菌广泛存在于自然界的 水及土壤、医院环境及人体皮肤、呼吸道、消化道和泌尿生殖道中，为条件致病菌。鲍曼不动 杆菌对温、热、紫外线及化学消毒剂均有较强的抵抗力，常规的消毒剂只能抑制其生长，不 能将其杀灭，因此，鲍曼不动杆菌常藏匿于各种医疗器械及医院病房角落，对于重症患者， 如老年患者、危重疾病及机体抵抗力弱的患者，以及使用各种侵入性操作和长期使用广谱 抗生素治疗的患者来说，鲍曼不动杆菌可成为重要的致病菌。临床上，其主要引起肺部感 染，也可引发败血症、严重软组织或伤口感染、插管相关感染、尿路感染、菌血症和继发性脑 膜炎等症状。医院感染的科室分布以重症监护室为最多，其次为呼吸内科。
[0003] 鲍曼不动杆菌感染有着悠久的历史，从20世纪八十年代起就有了鲍曼不动杆菌 感染爆发的报道，而自美国1991年报道了耐碳青霉烯鲍曼不动杆菌（CRAB)菌株后，各国均 陆续报道了耐碳青霉烯鲍曼不动杆菌，且据统计数据，其比例逐年升高。鲍曼不动杆菌的感 染与耐药已经成为一个世界性难题，常呈多重耐药和泛耐药，且耐药菌在特定人群中常引 起大规模爆发流行，感染患者的病死率常高达75%。2010年中国耐药检测的监测数据显示 不动杆菌对头孢哌酮/舒巴坦耐药率为30. 7%，对米诺环素耐药率为31. 2%，其他药物如 亚胺培南、美罗培南、头孢吡肟、头孢他啶、头孢西丁、哌拉西林/他唑巴坦、氨苄西/舒巴 坦、阿米卡星、庆大霉素、环丙沙星等耐药率均在50%以上。由于耐药性及耐药机制复杂，鲍 曼不动杆菌的耐药菌株引发的感染已经成为临床上非常棘手的问题。普通抗生素对它的治 疗作用已不明显，鲍曼不动杆菌即将面临无抗生素可治的境地，采用疫苗来预防和控制鲍 曼不动杆菌的感染，特别是对抗高度耐药鲍曼不动杆菌的感染已成为刻不容缓的任务。
【发明内容】
[0004] 有鉴于此，本发明的目的在于提供一种鲍曼不动杆菌膜蛋白A1S_0851作为抗原 的应用。
[0005] 本发明所述技术方案如下：
[0006] 1、鲍曼不动杆菌膜蛋白A1S_0851作为抗原的应用，所述膜蛋白A1S_0851的氨基 酸序列如SEQIDNO. 2所示。
[0007] 2、鲍曼不动杆菌重组蛋白A1S_0851在制备疫苗中的应用，所述重组蛋白 A1S_0851的氨基酸序列如SEQIDNO. 2所示。
[0008] 3、由鲍曼不动杆菌重组蛋白A1S_0851制备得到的鲍曼不动杆菌疫苗，所述重组 蛋白A1S_0851的氨基酸序列如SEQIDNO. 2所示。
[0009] 优选的，所述疫苗还包括佐剂，所述佐剂为终浓度13. 5mg/mL的氢氧化铝。
[0010] 优选的，所述疫苗还包括稀释液，所述稀释液pH值为6. 0,由浓度为10mM的组氨 酸、质量分数〇. 9%的NaCl和质量分数0. 01 %的泊洛沙姆188组成。
[0011] 4、上述疫苗的制备方法，包括如下步骤：
[0012] (1)用pH值为6. 0的疫苗稀释液溶解浓度为30mg/mL的氢氧化铝佐齐IJ，得溶液A; 所述氢氧化铝佐剂与疫苗稀释液的体积比为9:1;
[0013] (2)用步骤（1)所述疫苗稀释液稀释重组蛋白A1S_0851，得蛋白浓度为0.3yg/ yL的溶液B;
[0014] (3)取等体积的溶液A和溶液B于4~32°C条件下进行吸附，即得疫苗。
[0015] 5、上述疫苗在制备预防或治疗鲍曼不动杆菌感染的药物中的应用。
[0016] 6、鲍曼不动杆菌重组蛋白A1S_0851作为抗原免疫动物得到的抗体，所述重组蛋 白A1S_0851的氨基酸序列如SEQIDNO. 2所示。
[0017] 优选的，所述抗体为免疫小鼠或者兔得到的IgG抗体。
[0018] 本发明的有益效果在于：本发明通过分析鲍曼不动杆菌基因信息，选取鲍曼不动 杆菌的膜蛋白A1S_0851作为疫苗的候选抗原，通过基因工程的手段，选用pEGX-6P-2融合 蛋白表达载体对A1S_0851抗原进行克隆、表达，并用表达的重组蛋白免疫小鼠进行抗原性 评价以及抗鲍曼不动杆菌感染的免疫保护性评价，结果表明鲍曼不动杆菌A1S_0851基因 编码的蛋白具有抗鲍曼不动杆菌感染的效果，是理想的鲍曼不动杆菌疫苗抗原。与全菌灭 活疫苗相比，由于全菌灭活疫苗外膜复合物成分比较复杂，可能含有效的保护性抗原成分， 也可能存在与免疫保护无关或者副作用的成分，且制备过程难于标准化，而基因工程亚单 位疫苗抗原成分明确，效果明确，副作用小，安全性高，是一种理想的疫苗形式。
【附图说明】
[0019] 为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图：
[0020] 图1鲍曼不动杆菌A1S_0851基因PCR扩增凝胶电泳结果；其中，M泳道为marker， 1泳道为A1S_0851基因PCR扩增产物。
[0021] 图2pGEX-6p-2/AlS_0851重组质粒凝胶电泳鉴定结果；其中，1~4泳道为重组质 粒，M泳道为marker，其中泳道3为鉴定正确的重组质粒。
[0022] 图3重组工程菌pGEX-6P-2-AlS_0851/XL-lblue诱导表达重组蛋白A1S_0851结 果；其中，M泳道为marker，1~3泳道依次为16、25和30°C条件下IPTG诱导处理后，破碎 菌体并离心所得上清液中的重组蛋白A1S_0851 ;4~6则依次为16、25和30°C条件下IPTG 诱导处理后，破碎菌体并离心所得沉淀中的重组蛋白A1S_0851。
[0023] 图4重组工程菌pGEX-6P-2-AlS_0851/XL-lblue发酵过程中细菌的生长曲线图； 整个生长曲线比较标准，前期细菌生长较快，后期诱导时曲线较平稳。
[0024] 图5重组工程菌pGEX-6P-2-AlS_0851/XL-lblue发酵获得的目的蛋白鉴定结果； 各泳道从左到右依次为maker、IPTG诱导lh、2h、3h、4h;由图可知，经过工程菌发酵成功获 得重组A1S_0851蛋白。
[0025] 图6对发酵获得的重组蛋白A1S_0851经GST琼脂糖凝胶4B亲和层析的纯化结果 图，结果显示，目的蛋白纯度在95%以上，目的蛋白分子量在33kDa左右，与预期大小相符 合。M:蛋白标准品，泳道1 :重组蛋白A1S_0851与GST融合蛋白，泳道2为纯化后经酶切后 的重组蛋白A1S_0851。
[0026] 图7重组蛋白A1S_0851Q HP层析图。
[0027] 图8为重组蛋白A1S_0851经QHP层析后SDS-PAGE结果图，图中，泳道1:标准蛋 白；泳道2 :GST亲和PP酶切后洗脱样品；泳道3:QHP流穿样品；泳道4:QHP层析后样品。
[0028] 图9为重组蛋白A1S_0851QHP层析去内毒素后SDS-PAGE结果图，图中，泳道1: 标准蛋白；泳道2:QHP层析去内毒素后样品。
[0029] 图10鲍曼不动杆菌攻毒后，不同浓度菌液的小鼠生存率图。
[0030] 图11重组蛋白A1S_0851免疫后第14天，ELISA检测小鼠免疫后疫苗抗原特异性 IgG体液应答水平，实验组滴度与氢氧化铝佐剂对照组及疫苗稀释液对照组滴度相比，均有 显著差异（P〈〇.〇l)。
【具体实施方式】
[0031] 下面对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实验方 法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。
[0032] 鲍曼不动杆菌ATCC国际标准株ATCC17978,由美国ATCC提供；引物由TaKaRa 公司合成；宿主菌株XLl-blue大肠杆菌购于美国安捷伦公司；质粒pGEX-6p-2购于美国 GEHealthcare公司；primeSTARHSDNA聚合酶、DNA分子量标准（marker)、限制性内切 酶BamHI和NotI、蛋白分子量标准（marker)、DNA连接酶均购于大连TakaRa公司；细菌 基因组提取试剂盒购于天根公司；质粒提取试剂盒和凝胶回收试剂盒购于美国Omega公 司；氨苄西林、卡那霉素购自华北制药股份有限公司；谷胱甘肽琼脂糖凝胶4B购自美国GE Healthcare公司；高压勾质机APV-1000购自丹麦AnInvernsysGroup;BALB/C小鼠购自 北京华阜康公司；氢氧化铝佐剂购自美国GENERALCHEMICAL公司；药用级组氨酸购自美国 Merck公司；药用级泊洛沙姆188购自美国Merck公司，无热原。
[0033] 试剂配制：
[0034] 5X蛋白质上样缓冲液由以下组分组成：PH6.8,250mMTris-HCl10% (W/V)，SDS 0? 5% (W/V)，溴酚蓝50% (