一种降解多环芳烃的不动杆菌及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，涉及一株不动杆菌菌株，本发明还涉及所述菌株在降 解多环芳烃中的应用以及一种降解多环芳烃的方法。
【背景技术】
[0002] 多环芳香烃化合物（PAHs)是一类由两个或两个以上苯环以线性排列、弯接或者 簇聚等不同方式排列形成的有机化合物。根据PAHs分子量的大小，可以将多环芳烃分为低 分子量的PAHs(如萘、菲，芴等）和高分子量的PAHs(如荧蒽、芘、苯并芘等）。多环芳烃的 来源主要包括两个方面：一方面是自然界自身的活动，如森林火灾、动植物遗体腐烂、石油 煤炭形成、火山喷发等；另外一个方面是人类活动，如化石的不完全燃烧、城市固体废弃物 的焚烧、石油开采、加工运输以及化工生产和汽车尾气的排放等。人类活动向环境贡献了绝 大多数的多环芳烃污染，是公认的主要污染来源。PAHs已经广泛存在于空气，水体和土壤及 其河流湖泊的沉积物，随着全球人口数量的不断增长以及城市化、工业化进程的不断加剧， 人类生存环境中的多环芳烃的控制和修复已经变得刻不容缓。
[0003] 多环芳烃是一类环境持久性污染物。由于其独特的化学结构，多环芳烃具有低水 溶性，高疏水性和强化学稳定性，在自然界中难以被生物体利用。同时，多环芳烃也是被广 泛证实的具有致癌、致畸、致突变的"三致"效应的环境污染物。由于其独特的化学稳定性， 传统的物理化学方法（挥发、光解、化学氧化、电修复以及混凝絮凝等方法）难以去除，同时 处理成本高昂，容易产生二次污染。
[0004] 微生物修复是利用微生物将有机污染物转化为碳基大分子和二氧化碳的过程， 实施和建立一套有机污染物的微生物修复工艺的核心是寻找代谢速度快，环境适应性强 的污染物降解菌，直接从环境中富集筛选微生物是一种最有效的技术手段，它具有定植能 力强，环境适应性广等特点。目前人们已经从各类生态环境中筛选获得多种多环芳烃降 解菌，包括假单胞菌（Pseudomonas)、红球菌（Rhodococcus)、分枝杆菌（Mycobacterium)、 芽孢杆菌（Bacillus)、鞘氨醇单胞菌（Sphingomonas)、气单胞菌（Aeromonas)、拜叶 林克氏菌（Beijerinckia)、拟诺卡氏菌（Nocardioides)、解环菌（Cycloclasticus)、 伯克氏菌（Burkholderia)、丛毛单胞菌（Polaromonas)以及一些嗜热厌氧的菌属 如嗜油菌（Neptunomonas)、两面神菌（Janibacter)、诺卡氏菌（Nocardia)、变性菌 (Deltaproteobacteria)和产喊菌（Alcaligenes)等。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一株用于降解多环芳烃的不动杆菌。
[0006] 申请人从石油污染的土壤中分离获得一株能够快速降解多环芳烃的菌株，通过 生理生化鉴定和核糖体16SrDNA基因序列分析将其鉴定为不动杆菌属（Acinetobacter sp.)，命名为W145。该菌株已于2014年5月9日送交位于湖北省武汉市武汉大学内的中国 典型培养物保藏中心（CCTCC)保藏，保藏编号为：CCTCCNO:M2014192。
[0007] 该菌株能够高效降解多环芳烃，尤其是菲、芘、荧蒽、萘。同时该菌株在pH5. 5~ 9. 0,以及盐离子浓度<5%下，能快速生长，具有耐盐碱和广泛的酸碱度环境适应能力，是 对土壤、污水、淤泥中的多环芳烃进行降解的优秀生物材料。
[0008] 在降解土壤、污水、淤泥中的多环芳烃时，按每lKg污染物中接种105~10 7CFU的 不动杆菌W145,能达到最佳的降解效果。
[0009] 在接种前调节污染物的pH为5. 5~9. 0,以及盐离子浓度< 5%，能达到较佳的降 解效果。
[0010] 在接种前调节污染物的pH为7. 2,以及盐离子浓度为2%，能达到最佳的降解效 果。
[0011] 更详细的技术方案见《具体实施方案》所述。
【附图说明】
[0012] 图1是不动杆菌W145对不同多环芳烃的降解能力。
[0013] 图2是不动杆菌W145在250mg/L菲浓度下的生长和降解曲线。
[0014] 图3是不动杆菌W145对pH值的敏感性柱状图。
[0015] 图4是不动杆菌W145对钠离子浓度的敏感性柱状图。 具体实施方案
[0016] 以下结合实施例对本发明进行详细地说明。应该说明的是，本发明的实施例仅限 于对于本发明进行说明，而没有限制作用。本发明中所涉及的其它各种操作，均为本领域的 常规技术，文中没有特别说明的部分，本领域的普通技术人员可以参照本发明申请日之前 的各种常用工具书、科技文献或相关的说明书、手册等予以实施。
[0017] 实施例1不动杆菌W145的分离鉴定
[0018] 采用来自胜利油田长期受石油污染的土壤为筛选土壤，具体筛选方案如下：
[0019] 1)取10g土壤，加入到100ml含有250mg/L菲的无机盐培养基MSM中，28°C震荡培 养7天，取10ml培养物转接到另100ml含有250mg/L菲的无机盐培养基MSM中；连续转接 5次，得到富集微生物的培养液。
[0020] 2)取0. 1ml步骤1)所得到的培养液，涂布到含250mg/L菲的MSM固体平板上，28°C 静止培养5天后，将平板上长出来的菌落转接到含250mg/L菲的MSM固体平板上，继续培养 生长，直到平板上出现单一的菌落。
[0021] 3)挑取MSM固体平板上生长出来的单菌落，接种到含有250mg/L菲的MSM液体培 养基中，28 °C震荡培养5天，获得本发明的菌株。
[0022] 进一步对菌株进行了形态学和分子生物学鉴定。
[0023] 首先，对菌株的形态学特征进行了初步的观察，结果表明，该菌株为革兰氏阴性 菌，杆状。
[0024] 同时，发明人分离获得菌株的基因组DNA，然后以细菌16SrRNA基因的通用引物 27F和1492R引物对DNA进行PCR扩增；将获得的PCR扩增产物进行测序，其序列如序列表 SEQIDN0:1所示。然后，利用NCBI核酸数据库，根据菌株16SrRNA基因序列进行了BLAST 分析，结果表明菌株的16SrRNA基因序列与不动杆菌属的同源性高达99%的相似性，结合 革兰氏染色和形态学观察，发明人将该菌株命名为不动杆菌（Acinetobactersp.)W145。
[0025] 实施例2不动杆菌W145对多环芳烃的降解能力验证
[0026] 发明人对W145菌株对常见多环芳烃降解能力进行了研宄。以100ml不含有碳源 的MSM培养基为基础，分别添加不同的多环芳烃作为唯一碳源；然后接入106CFU的不动杆 菌W145,置于28°C震荡培养5天后，测定培养物在0D_的吸光度值。以不添加任何碳源的 培养基为负对照。由于培养基中未添加除多环芳烃外的任何碳源，因此菌株的生长速度和 生物量即体现了菌株对多环芳烃的降解和利用能力。
[0027] 如图1所示，不动杆菌W145对荧蒽、芘、菲具有较强的降解能力，对萘也具有一定 的降解能力，而对其它的多环芳烃如联苯、芴、苯并芘等几乎没有降解能力，表明不动杆菌 W145对多环芳径的降解具有一定的专属性。
[0028] 实施例3不动杆菌W145对多环芳烃的降解效率
[0029] 为了进一步分析不动杆菌W145对多环芳烃的降解效率，以菲为唯一碳源，对不动 杆菌W145的生长速度和降解速度进行了测试。将处于对数生长期的不动杆菌W14以1%接 种量接种到以250mg/L菲为唯一碳源的MSM培养基中，置于28°C震荡培养。同时，每12个 小时测定一次培养物的〇D_值和残留菲的浓度。
[0030] 如图2所示，不动杆菌W145从接种开始就具备了菲降解能力，并且在12小时后降 解能力和菌株生长都迅速增加，并且，随着培养物中残留菲浓度的减少，菌株生长逐渐进入 平台期。在接种100小时后，培养物中的菲几乎完全被降解。这表明不动杆菌W145具有快 速高效降解多环芳径的能力，能够将液体培养基中的250mg/L的菲在五天内完全降解。
[0031] 实施例4不动杆菌W145的环境适应特征
[0032] 对不动杆菌W145对pH值和盐离子浓度的适应性进行了测试。
[0033] 采用R2A培养基，分别利用MES(2-(N-吗啉）乙磺酸），TAPS0(3-[N-三（羟甲基） 甲胺]-2-羟基丙磺酸），Tris-HCl将R2A液体培养基的pH值调整为5. 0、5. 5、6. 0、6. 5、 7. 0、7. 2、8. 0、8. 5、9. 0 ;然后接种新鲜的不动杆菌W145到上述不同pH值的培养基中，28°C 震荡培养24小时后测定其0D_，结果如图3所示：不动杆菌W145在pH6. 0到pH9. 0范围 内的生长，在pH低于5. 5时基本上没有明显的生长趋势。这表明本发明所提供的不动杆菌 W145具有广泛的pH适应性，具有修复酸性和碱性土壤的潜力。
[0034]与上述培养条件相似，同样采用R2A培养基，在其培养基中添加NaCl，使其终浓度 分别为1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10% ;然后接种新鲜的不动杆菌W145到 上述不同钠离子浓度的培养基中，28°C震荡培养24小时后测定其0D_，结果如图4所示。不 动杆菌W145在添加4%以内的钠离子的条件下其生长不受影响；添加钠离子浓度达到5% 能够维持不低于50%的生长，当在培养基中添加6%以上的钠离子的时候，W145仍然有生 长的趋势。这表明当采用不动杆菌W145进行有机污染物生物修复的时候，为了实现其菌株 的高效定植和维持其代谢活性，污染物中的盐离子浓度应该控制在5 %以内。
[0035] 实施例5多环芳烃类有机污染物的降解
[0036] 取土壤或污水或淤泥，先调节pH为7. 2,盐离子重量浓度为2%，然后按每lKg土 壤或污水或淤泥中接种1〇5~10 7CFU的不动杆菌W145,混匀。
【主权项】
1. 一株降解多环芳径的不动杆菌（Acinetobacter sp. )W145,保藏在中国典型培养物 保藏中心，保藏编号为：M2014192,所述多环芳烃为菲、荧蒽、芘和萘。
2. 权利要求1所述的不动杆菌W145在降解多环芳烃中的应用。
3. -种降解多环芳烃的方法，其特征在于：包括向含有多环芳烃的污染物中接种权利 要求1所述不动杆菌W145的步骤。
4. 根据权利要求3所述的降解多环芳烃的方法，其特征在于：向每IKg含有多环芳烃 的污染物中接种IO5~10 7CFU的不动杆菌W145,所述污染物是土壤或污水或淤泥。
5. 根据权利要求3或4所述的降解多环芳烃的方法，其特征在于：还包括在接种前调 节污染物的pH为5. 5~9. 0,以及盐离子浓度彡5%的步骤。
6. 根据权利要求5所述的降解多环芳烃的方法，其特征在于：还包括在接种前调节污 染物的pH为7. 2,以及盐离子浓度为2%的步骤。
【专利摘要】本发明属于生物技术领域，公开了一种不动杆菌(Acinetobacter sp.)W145，该菌株保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO：M2014192，本发明所公开的菌株对菲、荧蒽、芘和萘具有高效快速的降解能力，是对土壤或环境进行生物修复的优秀材料。CCTCC NO：M201419220140509
【IPC分类】C02F11-02, C02F3-34, C12R1-01, B09C1-10, C12N1-20, C02F101-32
【公开号】CN104745515
【申请号】CN201510159230
【发明人】黄巧云, 陈雯莉, 汪方奎, 李偲, 黄凤斋
【申请人】华中农业大学
【公开日】2015年7月1日
【申请日】2015年4月7日