用于修复重油污染海岸线的复合菌剂及其制备方法与应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于微生物技术及石油污染海岸线生物修复技术领域，具体涉及一种能专 项降解重油污染物以用于修复重油污染海岸线的复合菌剂及其制备方法与应用。
【背景技术】
[0002] 海洋既是人类赖以生存和发展的资源宝库，又是重要的运输环境。随着石油需求 的日益增长，海洋石油工业、运输业的迅速发展，以及海上石油勘探、开采和运输规模的不 断扩大，海洋溢油和污染事故频频发生，石油及其产品已经成为仅次于蓝藻、赤潮的第二大 海洋污染源。而当溢油事故发生在近海时，由于潮汐和海浪作用，海岸线环境所的受威胁将 难以避免。我国拥有大陆海岸线1. 8万公里、岛屿海岸线1. 4万公里，沿线遍布着水产养殖 区、旅游景观区、海岸工业区和生态保护区，海岸线溢油污染一旦发生，必将意味着海岸环 境质量的下降、生态系统的破坏、经济产业的损失和人类健康的损害。而且由于石油污染物 的物理难溶性、化学稳定性、生物毒性及生物累积效应，溢油污染可能影响海岸线数十年至 数百年，其危害之重、影响之久，使得经济、高效、环境友好的石油污染海岸线治理技术研发 具有重要的战略意义。
[0003] 生物修复是指利用生物尤其是微生物将环境中的污染物降解或无害化，使受污染 生态系统的正常功能得以恢复的过程，具有成本低、操作简单、不产生二次污染的显著优 点。20世纪90年代初，生物修复技术在美国阿拉斯加威廉王子湾溢油污染治理中被首次成 功应用，开创了溢油污染海岸线生物治理的先河，近20年来逐渐成为国内外研宄和攻关的 热点。
[0004] 溢油污染海岸线生物修复的基础是微生物对石油污染物的新陈代谢作用，已有研 宄证实，自然界中许多微生物能以石油中的烷烃、芳烃、低分子量多环芳烃为单一碳源和能 源利用，或以共代谢的方式实现高分子量多环芳烃的降解。而在溢油污染事故发生后，海岸 线环境往往由于缺乏合适的微生物，或因石油污染物的胁迫和营养条件的缺乏，导致微生 物的数量过低、生长缓慢、活性受到抑制，自净能力不足。采用生物修复技术，一方面可向海 岸线环境中投加高效耐盐石油降解菌剂，以显著提高菌群和菌种数量，该菌剂可经土著菌 种富集驯化而成，也可在不构成物种安全威胁的前提下引入外源石油降解菌或转基因菌， 这种方法又称为生物强化法；另一方面，是通过投加必需的N、P营养或表面活性剂，改善菌 种的生长环境，提高其代谢速率和污染物的生物可用性，这种方法又称为生物促进法。生物 修复为溢油污染环境提供了一个有效的治理途径，在修复石油污染海岸线环境中的作用日 益突出。
[0005] 现已公开的石油污染环境生物修复方法中，多针对常规土壤、地下水溢油污染，如 CN102453678A、CN101603018A、CN102382784A、CN102021132A等，而针对水文、地质、气 候等更为复杂、极端的海岸线（或海洋）环境的则相对很少。CN102676424A公开了一株 从钻井废弃泥浆中筛选得到的嗜盐芽孢杆菌Y-B，可应用于石油行业高盐含油废液及海岸 线溢油突发事故处理中，然而，单一菌种只能利用石油中的某种或某类组分，只有多种微生 物的协同作用才能实现石油污染物各组分最大限度的降解。CN102533615A公开了一种协 同降解石油的复合菌液及其制备方法，该复合菌液由两株食烷菌和一株海杆菌构成，对烷 烃组分和芳烃组分的降解更充分，适用于海洋溢油污染的海岸线或滩涂的生物修复，所涉 及菌种分离于我国南海、黄海沉积物。CN10171725A以短小芽孢杆菌、威尼斯不动杆菌等 4种菌株的混合发酵液和固定化载体为原料制备成复用菌剂，可在污染场地形成竞争优势， 显著增加烃类降解微生物的数量，提高原油的生物降解效率。CN102491592A向石油污染滩 涂中施加再生油脂、无机营养制剂并进行翻耕，实现废物利用和修复效果的提高，该方法属 于生物促进的技术角度。
[0006] 以上成果对于生物修复技术治理石油污染的作用再次给出了充分的肯定，但由于 国内该领域的起步较晚，该类技术在我国海岸线溢油污染环境治理中尚无大规模实践。另 外，随着国内外石油资源紧张形势的加剧，较为劣质的重油日渐受到重视，国内炼厂的掺炼 量日益加大，除了我国的渤海油田、辽河油田、胜利油田等主要的重油基地外，大量重油经 由海洋运输从国外进口，重油泄漏和污染的风险日益加大。由于重油中难生物降解组分的 含量更高，生物抑制性更强，生物修复的难度更大，研发高效修复石油尤其是重油污染海岸 线的专项菌剂更为重要。
【发明内容】
[0007] 本发明的一个目的在于提供一种修复石油污染海岸线的专项复合菌剂，能专项降 解原油特别是重油污染物。
[0008] 本发明的另一目的在于提供所述复合菌剂的制备方法。
[0009] 本发明的另一目的在于提供所述的复合菌剂在修复原油污染特别是重油污染海 岸线、或溢油污染盐碱土壤中的应用。
[0010] 为实现上述目的，一方面，本发明提供了一种用于修复重油污染海岸线的复合菌 剂，该复合菌剂包括水谷鞘氨醇杆菌（Sphingobacteriummizutaii)、木糖氧化无色杆菌 (Achromobacterxylosoxidans)以及皮氏无色杆菌（Achromobacterpiechaudii) 〇
[0011] 根据本发明的具体实施方案，本发明筛选得到了三株具有高效降解石油功能的菌 株，本发明中分别命名为XG-3、XG-14、XG-11。其中：
[0012] 菌株XG-3已于2013年7月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通 微生物中心（地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研宄所），保藏 编号：CGMCCNo. 8000;分类命名：水谷鞘氨醇杆菌Sphingobacteriummizutaii。本发明 的菌株XG-3能以重质原油为单一碳源生存，其主要生理生化特征如下：水谷鞘氨醇杆菌 SphingobacteriummizutaiiXG-3的菌落呈球形凸起，半透明；菌体为直杆状，无芽孢，无 鞭毛，革兰氏染色阴性，G+C= 54. 6% ;氧化酶及接触酶阳性，硝酸盐还原阴性，不能水解淀 粉，能氧化乙醇产酸，能发酵葡萄糖、麦芽糖、蔗糖等。该菌种耐盐性好，在0~10%的盐度 范围内均能生存，盐度>5%时其生长略受抑制。在模拟海水盐度下，该菌种10d内对初始浓 度为lg/L的委内瑞拉重油降解效率达40%以上。
[0013] 菌株XG-14已于2013年7月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微 生物中心（地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研宄所），保藏编 号：CGMCCNo. 8022;分类命名：木糖氧化无色杆菌Achromobacterxylosoxidans。本发明 的菌株XG-14能以重质原油为单一碳源生存，其主要生理生化特征如下：木糖氧化无色杆 菌AchromobacterxylosoxidansXG-14的菌落湿润有光泽，表面光滑、边缘整齐；菌体呈短 杆状，有1-5根周毛，革兰氏染色阴性，G+C= 54. 0% ;氧化酶、接触酶、硝酸盐还原呈阳性， 不产生吲哚，乙醇氧化产酸，不发酵葡萄糖，不水解淀粉。该菌种耐盐性佳，盐度达到7%时 依然生长良好，达到10%后略受抑制。该菌种于模拟海水盐度下，l〇d内对初始浓度为lg/ L的委内瑞拉重油降解效率达45%以上。
[0014] 菌株XG-11已于2013年7月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通 微生物中心（地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研宄所），保 藏编号：CGMCCNo. 8021;分类命名：皮氏无色杆菌Achromobacterpiechaudii。本发明 的菌株XG-11能以重质原油为单一碳源生存，其主要生理生化特征如下：皮氏无色杆菌 AchromobacterpiechaudiiXG-11菌落较小，圆形，无色到灰白色，略凸起，表面光滑且边 缘完整；菌体为球杆状，具有运动性，革兰氏染色阴性，G+C= 54. 3%，氧化酶、接触酶阳性， 硝酸盐还原阳性，不产生吲哚，不水