一种复合微生物菌剂及其制备方法和应用
【专利摘要】本发明提供了一种醋糟发酵的复合微生物菌剂，所述菌剂包含混合真菌；所述混合真菌由黄孢原毛平革菌、康氏木霉、黑曲霉和无花果曲霉混合组成。本发明还提供了上述菌剂的制备方法及其在醋槽发酵中的应用。降低醋糟中的粗纤维含量，增加醋糟中容易消化的还原糖含量，增加醋糟中水解酶的活性，提高醋糟的饲用价值。CGMCC No. 298020090327
【专利说明】
一种复合微生物菌剂及其制备方法和应用
技术领域
[0001] 本发明属于有机废弃物农用资源化的微生物技术处理领域，涉及一种能促进醋糟 发酵的复合微生物菌剂及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 醋糟是以淀粉质原料为主料固态发酵酿造食醋过程中产生的残渣。我国食醋年产 量为200~250万吨，且每年以7%的速度逐年增长。按照生产1吨标准固态发酵二级食醋产 生0.6~0.7吨醋糟计算，我国年产醋糟量为120~175万吨。如此丰富且成本低廉的醋糟资 源目前尚未得到充分合理的利用，不仅造成资源浪费还导致环境污染。除少部分被周围村 民直接用作饲料外，大部分被丢弃。而醋糟粗纤维含量高，适口性差，消化率低，直接饲喂 时，营养物质利用率低，严重制约了醋糟作为饲料原料的大规模应用。
[0003] 近年来，由于微生物发酵操作简单，成本低，经济环保，成为当前糟渣类资源增值 利用技术研究的热点。利用真菌发酵，不仅可以降解醋糟中的纤维素成分，而且能增加水解 酶活性，可以显著提高醋糟的营养价值和附加值。有学者对醋糟发酵工艺进行了探讨研究， 但是效果并不理想，一是粗纤维含量下降幅度较低，下降幅度最高的仅为16.23%，其二是 工艺复杂，需要进行前处理，其三是发酵时间长。
【发明内容】
[0004] 基于上述【背景技术】，本发明的目的在于降低醋糟中的粗纤维含量，增加醋糟中容 易消化的还原糖含量，增加醋糟中水解酶的活性，提高醋糟的饲用价值;并且建立成本低 廉，操作简单，效果显著，适合大规模应用于纤维素类废弃物开发利用的混菌发酵工艺。
[0005] 本发明提供了 一种复合微生物菌剂，所述菌剂包含混合真菌；
[0006] 所述混合真菌由黄孢原毛平革菌(ACCC 30414)、康氏木霉(CGMCC 3.2878)、黑曲 霉(ACCC 30557)和无花果曲霉(NTG-23)组成;优选地，以混合真菌中的真菌数量比例计所 述黄孢原毛平革菌:康氏木霉为:黑曲霉:无花果曲霉的比例为（1~4):(1~4):(1~4):(1 ~4);更优选地，所述黄孢原毛平革菌、康氏木霉、黑曲霉和无花果曲霉以1:1:1:1的真菌 数量比例混合组成。
[0007] 本发明还提供了上述菌剂的制备方法，所述方法包括：
[0008] 1)将黄孢原毛平革菌、康氏木霉于28°C分别独立地在PDA培养基上培养5~8天；
[0009] 同时，将黑曲霉和无花果曲霉于28°C分别独立地在察氏培养基上培养5~8天； [0010] 2)以无菌生理盐水于无菌环境下分别将步骤1)中所述四种菌的孢子洗脱，得到分 别含有黄孢原毛平革菌孢子的溶液、含有康氏木霉孢子的溶液、含有黑曲霉孢子的溶液和 含有无花果曲霉孢子的溶液；
[0011] 3)将步骤2)得到的四种孢子溶液分别于室温下以150rpm震荡4小时；
[0012] 4)将步骤3)处理后的分别孢子溶液分别过滤，得到黄孢原毛平革菌孢子悬液、康 氏木霉孢子悬液、黑曲霉孢子悬液和无花果曲霉孢子悬液；
[0013] 5)将步骤4)得到的黄孢原毛平革菌孢子悬液、康氏木霉孢子悬液、黑曲霉孢子悬 液和无花果曲霉孢子悬液以相应的比例混合，即得菌剂；
[0014] 优选地，所述步骤5)还包括将所述黄孢原毛平革菌孢子悬液、康氏木霉孢子悬液、 黑曲霉孢子悬液和无花果曲霉孢子悬液调整至以孢子/ml计的相同的浓度;更优选地，所述 黄孢原毛平革菌孢子悬液、康氏木霉孢子悬液、黑曲霉孢子悬液和无花果曲霉孢子悬液以 体积比1:1:1:1混勾。
[0015] 在根据本发明的一个实施方案中，步骤4)中过滤是将孢子溶液通过8层纱布实现 的。
[0016] 在根据本发明的一个实施方案中，步骤5)中孢子悬液的浓度为1 X 106个孢子/ml。
[0017] 在根据本发明的一个实施方案中，步骤6)所述菌剂为干燥后密封的干粉菌剂;优 选为通过真空冷冻干燥处理获得。
[0018] 本发明进一步提供了一种醋糟发酵的方法，所述方法包括：
[0019] a)以g:ml计将比例为3:7的醋糟与矿物元素培养液混匀，得到醋糟固体培养基；
[0020] 其中，所述矿物元素培养液以去离子水为溶剂，含有Tween-80?2g/L、NaN〇3 2g/ L、KH2P〇4 1.5g/L、CaCl2 0.3g/L、MgS〇4*7H20 0.3g/L、FeS〇4*7H20 0.005g/L、MnS〇4*H20 0.0016g/L、ZnS〇4 · 7H20 0.0014g/L、CoCl2 · 6H20 0.0005g/L，并且所述矿物元素培养液通 过5M NaOH和1M HC1将pH值调整为6;
[0021] b)向步骤a)所述的醋糟固体培养基中加入相当于醋糟质量的1%的尿素，混匀； [0022] C)向经步骤b)处理的醋糟固体培养基中加入相当于醋槽质量的0.03%的MnS〇4 · H20，混匀，进行灭菌处理并冷却；
[0023] d)向经步骤c)处理的醋糟固体培养基中加入所述的菌剂，以25°C发酵培养5天。
[0024]在根据本发明的一个实施方案中，步骤d)中，菌剂的加入量为第30g醋糟对应的加 入4X106个孢子的菌剂。
[0025]在根据本发明的一个实施方案中，当所述菌剂为干粉状态时，以无菌生理盐水复 溶制备孢子悬液;优选地，孢子悬液的浓度为4 X 106个孢子/ml。
[0026] 更进一步地，本发明提供了通过上述方法得到的发酵产物，所述发酵产物经真空 冷冻干燥处理，冷冻干燥处理的时间为48小时；优选地，所述发酵产物经冷冻干燥后，粉碎 并密封装袋。
[0027] 本发明还提供了上述发酵产物在制备饲料中的应用；优选地，所述饲料选自家禽 饲料、家畜饲料、水产饲料。
[0028] 另一方面，本发明具有以下有益效果：
[0029 ] 1、混菌组合:黄孢原毛平革菌、康氏木霉、黑曲霉和无花果曲霉NTG-23。
[0030] 2、发酵后的变化：
[0031] (1)还原糖含量提高。
[0032] (2)羧甲基纤维素酶活性提高。
[0033] (3)木聚糖酶活性提高。
[0034] (4)纤维素含量下降。
[0035] (5)半纤维素含量下降。
[0036] (6)木质素含量下降。
[0037] (7)粗纤维含量下降。
[0038] 3、发酵周期短。
[0039] 4、发酵过程简单，醋糟未经前处理。
【具体实施方式】
[0040]下面结合实施例进一步说明本发明，应当理解，实施例仅用于进一步说明和阐释 本发明，并非用于限制本发明。
[0041 ]除非特别指明，本发明所使用的试剂和材料均可通过商业途径获得。
[0042]除非特别指明，本发明所涉及的黄孢原毛平革菌、黑曲霉均可通过商业途径获得。 其中，黄孢原毛平革菌、黑曲霉可由位于北京市海淀区中关村南大街12号的中国农业微生 物菌种保藏管理中心(ACCC)购得，黄孢原毛平革菌的保藏号为ACCC 30414,黑曲霉保藏号 为ACCC 30557;康氏木霉和无花果曲霉NTG-23由位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中 国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC)保藏，康氏木霉保藏号为CGMCC No . 3.2878,无花果曲霉NTG-23保藏号为CGMCC No . 2980(分类命名：无花果曲霉 Aspergillus ficuum，保藏日期：2009年03月27日。
[0043]实施例1培养基制备
[0044] PDA培养基配方(g/L):马铃薯浸粉3.0，葡萄糖20.0，琼脂15.0，自然pH。
[0045] 察氏培养基配方（g/L):蔗糖30.0,琼脂 12.0，NaN03 3.0，MgS〇4 · 7H20 0.5，KCL 0.5，FeS〇4.7H20 0·01，Κ2ΗΡ〇4 1.0,自然pH。
[0046] 按照配方配制，经过煮沸，装入干净锥形瓶，封口膜封口，皮筋扎紧，121°C高压灭 菌20min，结束后取出置于超净工作台（开紫外杀菌和通风），冷却至40-60°C，倒入无菌的平 皿中（均匀，水平，无气泡），冷却凝结呈固态，备用。
[0047]实施例2菌株的培养
[0048] 将黄孢原毛平革菌(ACCC 30414)、康氏木霉(CGMCC 3.2878)在PDA培养基上活化 两次，然后接到PDA平板培养基上28°C培养至产生大量孢子(一周左右）。
[0049] 将黑曲霉(ACCC 30557)、无花果曲霉(NTG-23)在察氏培养基上活化两次，然后接 到察氏平板培养基上28°C培养至产生大量孢子(一周左右）。
[0050]实施例3制备孢子悬液
[0051] 1.用无菌生理盐水(0.9%NaCl溶液)将四种菌的孢子从平板上洗脱下来，分别得 到各个菌的孢子液(操作过程为无菌操作）。
[0052] 2.将获得的孢子液置于250mL锥形瓶(装有玻璃珠）中，室温下150rmp摇床震荡4h， 打碎分散孢子。
[0053] 3.震荡后的孢子液用8层纱布过滤(用到漏斗、玻璃棒），得到孢子悬液。
[0054] 4.采用血球计数板显微镜下观察计数的方法，调整各种菌的孢子悬液至1 X 106个 孢子/mL，备用。
[0055]孢子悬液也可通过真空冷冻干燥技术处理为干燥的孢子粉菌剂，以便于保存或包 装商用。
[0056]实施例4配制醋糟固体培养基
[0057] 矿物元素培养液配方：1L水溶液含有Tween-8D?2g，NaN〇3 2g，KH2P〇4 1.5g， CaCl2 0.3g，MgS〇4.7H20 0.3g，FeS〇4.7H20 0.005g，MnS〇4.H2〇 0.0016g，ZnS〇4.7H2〇 0.0014g,CoCl2· 6H2O 0.0005g；
[0058] 1.配制矿物元素培养液:按照上述配方配制矿物元素培养液，然后以5M NaOH和1M HC1调整其pH值为6。
[0059] 2.将30g醋糟置于500mL锥形瓶中，加入70mL上述矿物元素培养液调整固体发酵培 养基的初始水分含量使其达到70% ;
[0060] 3.向醋糟固体培养基中加入1%的尿素(尿素/醋糟）（即0.3g)，充分混匀；
[00611 4.向醋糟固体培养基中加入0.009g的MnS04 · H20(即相当于步骤2中醋糟的质量的 0.03%)，充分混匀；
[0062] 5.放置高压灭菌锅中121°C灭菌20分钟，取出放在超净台里冷却。
[0063]实施例5醋糟发酵
[0064] 1.向实施例4中的醋糟培养基中加入实施例3制备的四种菌的孢子悬液(浓度1 X 106个孢子/mL)各lmL，充分混匀。
[0065] 2.置于25 °C恒温培养箱中通风保湿，培养5天。
[0066] 3.培养结束后，将发酵产物置于真空冷冻干燥中，冷冻干燥48个小时，即得到干燥 的发酵产物。
[0067] 4.将样品粉碎，装袋保存得到成品。
[0068]步骤1中也可使用无菌去离子水将孢子粉菌剂复溶为孢子悬液，并使孢子悬液浓 度调整至1 X 106个孢子/mL。使用中每30g醋糟对应地加入每种菌的孢子悬液lml，或将四种 菌等比例混合后的孢子悬液4ml，或者加入相应的孢子数的菌剂。
[0069]实施例6醋糟发酵
[0070] 1.向实施例4中的醋糟培养基中加入实施例3制备的四种菌的孢子悬液(浓度IX 106个孢子/mL)，其中，取孢原毛平革菌0.4ml、黑曲霉lml、黄孢原毛平革菌lml、黑曲霉 1.6ml，充分混匀。
[0071 ] 2.置于25 °C恒温培养箱中通风保湿，培养5天。
[0072] 3.培养结束后，将发酵产物置于真空冷冻干燥中，冷冻干燥48个小时，即得到干燥 的发酵产物。
[0073] 4.将样品粉碎，装袋保存得到成品。
[0074]步骤1中也可使用无菌去离子水将孢子粉菌剂复溶为孢子悬液，并使孢子悬液浓 度调整至1 X 106个孢子/mL。使用中每30g醋糟对应地将四种菌以相应比例混合后的孢子悬 液4ml，或者加入相应的孢子数的菌剂。
[0075]实施例7醋糟发酵
[0076] 1.向实施例4中的醋糟培养基中加入实施例3制备的四种菌的孢子悬液(浓度IX 106个孢子/mL)其中，取孢原毛平革菌lml、黑曲霉0.4ml、黄孢原毛平革菌1.6ml、黑曲霉 lml，充分混匀。
[0077] 2.置于25 °C恒温培养箱中通风保湿，培养5天。
[0078] 3.培养结束后，将发酵产物置于真空冷冻干燥中，冷冻干燥48个小时，即得到干燥 的发酵产物。
[0079] 4.将样品粉碎，装袋保存得到成品。
[0080]步骤1中也可使用无菌去离子水将孢子粉菌剂复溶为孢子悬液，并使孢子悬液浓 度调整至1 X 106个孢子/mL。使用中每30g醋糟对应地将四种菌以相应比例混合后的孢子悬 液4ml，或者加入相应的孢子数的菌剂。
[0081 ]实施例8醋糟发酵
[0082] 1.向实施例4中的醋糟培养基中加入实施例3制备的四种菌的孢子悬液(浓度IX 106个孢子/mL)其中，取孢原毛平革菌lml、黑曲霉1.6ml、黄孢原毛平革菌0.4ml、黑曲霉 lml，充分混匀。
[0083] 2.置于25 °C恒温培养箱中通风保湿，培养5天。
[0084] 3.培养结束后，将发酵产物置于真空冷冻干燥中，冷冻干燥48个小时，即得到干 燥的发酵产物。
[0085] 4.将样品粉碎，装袋保存得到成品。
[0086]步骤1中也可使用无菌去离子水将孢子粉菌剂复溶为孢子悬液，并使孢子悬液浓 度调整至1 X 106个孢子/mL。使用中每30g醋糟对应地将四种菌以相应比例混合后的孢子悬 液4ml，或者加入相应的孢子数的菌剂。
[0087]实施例9醋糟发酵
[0088] 1.向实施例4中的醋糟培养基中加入实施例3制备的四种菌的孢子悬液(浓度1 X 106个孢子/mL)其中，取孢原毛平革菌1.6ml、黑曲霉1.2ml、黄孢原毛平革菌0.8ml、黑曲霉 0.4ml，充分混匀。
[0089] 2.置于25 °C恒温培养箱中通风保湿，培养5天。
[0090] 3.培养结束后，将发酵产物置于真空冷冻干燥中，冷冻干燥48个小时，即得到干燥 的发酵产物。
[0091 ] 4.将样品粉碎，装袋保存得到成品。
[0092]步骤1中也可使用无菌去离子水将孢子粉菌剂复溶为孢子悬液，并使孢子悬液浓 度调整至1 X 106个孢子/mL。使用中每30g醋糟对应地将四种菌以相应比例混合后的孢子悬 液4ml，或者加入相应的孢子数的菌剂。
[0093]实施例10发酵产物检测
[0094]( - )直接使用四种菌等比例混合后进行发酵得到的发酵产物(如表1所示）
[0095] 1 ·还原糖产量达到35 · 57mg/gds，比空白组高出108 · 01 %。
[0096] 2.木聚糖酶活性达到439.07U/gds，比单菌发酵的最高值高出432.08%。
[0097] 3.羧甲基纤维素酶活性达到8.15U/gds，比单菌发酵的最高值高出243.88%。
[0098] 4.纤维素含量降低了 17.11 %。
[0099] 5.半纤维素含量降低了 68.61 %。
[0100] 6.木质素含量降低了 14.44%。
[0101 ]表1四种菌发酵醋糟前后成分比较表
[0104] (二)对发酵后的醋糟进行检测
[0105] 检测方法：
[0106] 1、还原糖含量测定
[0107] 采用DNS(Miller，1959)方法测定，以葡萄糖为标准物。
[0108] 2、羧甲基纤维素酶活性和木聚糖酶活性测定
[0109] 采用DNS法测定羧甲基纤维素酶活性(Feng，et al.2011);采用DNS法测定木聚糖 酶活性（Latif，et al.2006)。
[0110] 3、纤维素、半纤维素和木质素含量测定
[0111] 使用滤袋(ΑΝΚ0Μ)测定发酵产物中中性洗涤纤维(NDF)、酸性洗涤纤维(ADF)、酸性 洗涤木质素(ADL)和灰分含量。纤维素、半纤维素和木质素含量由计算得出，即纤维素= ADF - ADL;半纤维素= NDF - ADF;木质素= ADL- 灰分（El-Zoghbi 1994;Van Soest，et al,1991)〇
[0112] 4、粗纤维含量测定
[0113] 采用国家标准《饲料中粗纤维的含量测定-过滤法》(GB/T 6434-2006)测定。
[0114] (三)检测结果：
[0115] 实施例5发酵后的醋糟的检测结果(详见表2)如下：
[0116] 1.还原糖含量提高170.00%。
[0117] 2.羧甲基纤维素酶活性提高418.99%。
[0118] 3.木聚糖酶活性提高507.45 %。
[0119] 4.纤维素含量下降19.43%。
[0120] 5.半纤维素含量下降68.97 %。
[0121] 6.木质素含量下降19.64%。
[0122] 7.粗纤维含量下降29.02%。
[0123] 表2醋糟混菌发酵条件优化前后成分比较表
[0125] 采用实施例6~9的菌剂进行发酵，也获得了与实施例10相当的效果，发酵后，还原 糖含量、羧甲基纤维素酶活性、木聚糖酶活性均显著提高，同时，醋糟中纤维素含量、半纤维 素含量下降、木质素含量下降以及粗纤维含量均下降。
[0126] 尽管本发明已进行了一定程度的描述，明显地，在不脱离本发明的精神和范围的 条件下，可进行各个条件的适当变化。可以理解，本发明不限于所述实施方案，而归于权利 要求的范围，其包括所述每个因素的等同替换。
【主权项】
1. 一种醋糟发酵的复合微生物菌剂，其特征在于，所述菌剂包含混合真菌； 所述混合真菌由黄抱原毛平革菌（ACCC 30414)、康氏木霉（CGMCC 3.2878)、黑曲霉 (ACCC 30557)和无花果曲霉(NTG-23)组成;优选地，W混合真菌中的真菌数量比例计所述 黄抱原毛平革菌:康氏木霉为：黑曲霉:无花果曲霉的比例为（1~4):(1~4):(1~4):(1~ 4);更优选地，所述黄抱原毛平革菌、康氏木霉、黑曲霉和无花果曲霉:1:1:1的真菌数量 比例混合组成。2. 如权利要求1所述的菌剂的制备方法，其特征在于，所述方法包括： 1) 将黄抱原毛平革菌、康氏木霉于28°C分别独立地在PDA培养基上培养5~8天； 同时，将黑曲霉和无花果曲霉于28°C分别独立地在察氏培养基上培养5~8天； 2. W无菌生理盐水于无菌环境下分别将步骤1)中所述四种菌的抱子洗脱，得到分别含 有黄抱原毛平革菌抱子的溶液、含有康氏木霉抱子的溶液、含有黑曲霉抱子的溶液和含有 无花果曲霉抱子的溶液； 3) 将步骤2)得到的四种抱子溶液分别于室溫下W15化pm震荡4小时； 4) 将步骤3)处理后的抱子溶液分别过滤，得到黄抱原毛平革菌抱子悬液、康氏木霉抱 子悬液、黑曲霉抱子悬液和无花果曲霉抱子悬液； 5) 将步骤4)得到的黄抱原毛平革菌抱子悬液、康氏木霉抱子悬液、黑曲霉抱子悬液和 无花果曲霉抱子悬液W相应的比例混合，即得菌剂； 优选地，所述步骤5)还包括将所述黄抱原毛平革菌抱子悬液、康氏木霉抱子悬液、黑曲 霉抱子悬液和无花果曲霉抱子悬液调整至W抱子/ml计的相同的浓度;更优选地，所述黄抱 原毛平革菌抱子悬液、康氏木霉抱子悬液、黑曲霉抱子悬液和无花果曲霉抱子悬液W体积 ttl :1:1:1混匀。3. 如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤4)中过滤是将抱子溶液通过8层纱布实 现的。4. 如权利要求2或3所述的方法，其特征在于，步骤5)中抱子悬液的浓度为1 X 106个抱 子/ml。5. 如权利要求2~4中任一项所述的方法，其特征在于，步骤5)所述菌剂为干燥后密封 的干粉菌剂;优选为通过真空冷冻干燥处理获得。6. -种醋糟发酵的方法，其特征在于，所述方法包括： a) Wg:ml计将比例为3:7的醋糟与矿物元素培养液混匀，得到醋糟固体培养基； 其中，所述矿物元素培养液W去离子水为溶剂，含有Tvveen-80'?2g/L、NaM)3 2g/L、 Κ此P〇4 1.5g/L、CaCl2 0.3g/L、MgS〇4.7H20 0.3g/L、FeS〇4.7H20 0.005g/L、MnS〇4·此Ο 0.0016g/L、ZnS〇4 · 7出Ο 0.0014g/L、CoCl2 · 6出Ο 0.0005g/L，并且所述矿物元素培养液通 过5M NaOH和1M肥1将抑值调整的为6; b) 向步骤a)所述的醋糟固体培养基中加入相当于醋糟质量的1%的尿素，混匀； C)向经步骤b)处理的醋糟固体培养基中加入相当于醋槽质量的0.03%的MnS〇4 ·此0， 混匀，进行灭菌处理并冷却； d)向经步骤C)处理的醋糟固体培养基中加入如权利要求1所述的菌剂，W25°C发酵培 养5天。7. 如权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤d)中，菌剂的加入量为第30g醋糟对应的 加入4X ΙΟ6个抱子的菌剂。8. 如权利要求6或7所述的方法，其特征在于，当所述菌剂为干粉状态时，W无菌生理盐 水复溶制备抱子悬液;优选地，抱子悬液的浓度为4 X 106个抱子/ml。9. 一种根据权利要求6~8中任一项所述的方法得到的发酵产物，其特征在于，所述发 酵产物经真空冷冻干燥处理，冷冻干燥处理的时间为48小时;优选地，所述发酵产物经冷冻 干燥后，粉碎并密封装袋。10. 如权利要求9所述的发酵产物在制备饲料中的应用；优选地，所述饲料选自家禽饲 料、家畜饲料、水产饲料。
【文档编号】C12R1/645GK105969669SQ201610265908
【公开日】2016年9月28日
【申请日】2016年4月26日
【发明人】董晓芳, 佟建明, 崔耀明
【申请人】中国农业科学院北京畜牧兽医研究所