一种烟用微生物菌剂及其制备方法和应用
【专利摘要】公开了一种烟用微生物菌剂及其制备方法和应用，属于微生物技术应用领域。本发明通过将产朊假丝酵母(Candida utilis)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)组成的微生物菌剂均匀喷施在烟叶和烟丝上，可有效降解烟草中纤维素、半纤维素、果胶、蛋白质、淀粉等有害大分子前体物质，从而达到降低卷烟焦油中自由基、稠环芳烃以及氮亚硝胺等主要危害成分的目的，提高烟草质量。
【专利说明】
一种烟用微生物菌剂及其制备方法和应用
技术领域
[0001] 本发明涉及一种微生物技术应用领域，具体涉及一种通过添加微生物菌剂降解烟 草中有害物质的方法。
【背景技术】
[0002] 以下对本发明的相关技术背景进行说明，但这些说明并不一定构成本发明的现有 技术。
[0003] 影响烟草品质和风味的化学成份及因素极为复杂，但至今无论自然及人工发酵未 能被有效降解的有害成份主要是占烟草本身干重28 %的细胞壁成份:纤维素、半纤维素、木 质素、果胶，它们在烟草整个贮藏、醇化、加工过程中极少发生降解变化，无论烟草本身、烟 草发酵中的微生物还是生物活性酶类均对这类大分子物质无降解能力，由于其作为有害成 份在烟草中数量较大，对烟草内在品质及风味的不利影响显而易见。
[0004] 其次烟草发酵过程中，有益小分子物质的转化和积累是烟草通过醇化发酵提高质 量的主要途径。因此在降解有害大分子的同时，增加微生物能有效利用烟草原有及大分子 所降解的小分子物质，并大量转化为各类醇、醛、酮、酯、酸等有益小分子，无疑对加速醇化 发酵、提高烟草质量是有效的。
[0005] 同时在大量有益微生物的活动作用下，能够抑制烟叶中引起氮亚硝胺类积累的有 害微生物的生长活动，并能大量还原烟叶内的硝酸盐、亚硝酸盐减少形成氮亚硝胺类的前 体物质，并对烟草本身在燃烧过程中，产生稠环芳烃、氮亚硝胺及自由基、烟碱、焦油的各类 大分子物质进行降解和转化从根本上降低卷烟有害物质的来源，达到降低危害的目的。此 外，在发酵过程中提高烟草质量，使其口味更加适宜消费者的需求，更安全。
[0006] 目前公认提高烟草品质的有效途径是通过微生物降解烟草中大分子有害物质及 转化小分子物质成为有益成分，但目前几乎所有的研究都集中在降解淀粉、蛋白质方面，面 对占烟草干重28%以上的细胞壁成分(纤维素、半纤维素、木质素和果胶）的降解研究至今 鲜有报道。
【发明内容】
[0007] 为了解决上述技术问题，本发明提出一种通过在烟草发酵过程中，施加有益微生 物菌剂降解有害大分子的方法。
[0008] 选择能够较好的在烟草表面生长、代谢，而且具有较强的分解纤维素、半纤维素、 果胶、蛋白质、淀粉等有害大分子能力的菌株。
[0009] 将该菌株喷施于烟叶表面，能够迅速转化糖、氨基酸等小分子物质，形成醇、醛、 酮、酸等有益成分，并能使烟草中亚硝酸盐、硝酸盐等物质形成氨，降低氮亚硝胺的前体物 质，达到降低烟气中氮亚硝胺量目的的菌种。
[0010] 并可通过各类微生物科学组合，喷施于烟叶及烟丝表面，使其代谢活动能够有效 的提尚香烟品质。
[0011] 上述的方法具体包括下列步骤：
[0012] 1、菌种培育
[0013] 针对烟草难降解大分子有害物质，选择对烟草细胞壁的纤维素、木质素、果胶等易 在烟草燃吸过程中形成有毒有害物的大分子前体物质有显著降解作用，并能将其大量转化 为各类醇、醛、酮、酯、酸等有益小分子物质的产朊假丝酵母(Candida utilis)、枯草芽孢杆 菌(Bacillus subtilis)为作用菌株，经试管斜面培养和摇瓶培养制成相应的微生物菌剂。
[0014] (1)枯草芽孢杆菌的斜面及摇瓶培养采用牛肉膏蛋白胨培养基(牛肉膏3g/L，蛋白 胨l〇g/L，氯化钠5g/L，pH 7.0-7.2，固体培养基需添加琼脂至15-20g/L)。斜面培养条件:35 °C，24-36小时。摇瓶培养条件：35°C，180r/min，24-48小时。
[0015] (2)产朊假丝酵母的斜面及摇瓶培养采用马铃薯培养基（马铃薯200g，蔗糖20g，pH 自然，固体培养基需添加琼脂至15_20g/L)斜面培养条件:30°C，48小时。摇瓶培养条件:30 °C，180r/min，48小时。
[0016] 本发明所采用的细菌、真菌培养基均为实验室常见的培养基，可由西安紫瑞生物 科技有限公司直接商购获得。
[0017] 本发明所使用的菌株:产朊假丝酵母、枯草芽孢杆菌可从西安紫瑞生物科技有限 公司直接商购获得。
[0018] 2、菌液复配
[0019] 将所得的产朊假丝酵母、枯草芽孢杆菌菌剂按照质量比1:1复配，并加入质量比 0.5-1.0 %的无机盐作为菌株在烟叶生长的补充营养物质，制备微生物菌剂。
[0020] 所述产朊假丝酵母、枯草芽孢杆菌的菌含量均多108CFU/mL。
[0021] 所述的无机盐由磷酸二氢钾（1.5g/L)、磷酸氢二钾（1.5g/L)、硫酸铵（1.5g/L)、七 水硫酸镁(〇. 5g/L)、氯化钠(1. Og/L)组成。
[0022] 3、喷施微生物菌剂发酵 [0023]喷施工艺分两部进行：
[0024] (1)烟叶喷施菌剂发酵:烟叶喷施菌剂在烟叶复烤后发酵醇化的过程中添加，伴随 人工发酵的整个过程。具体包括将上述微生物菌剂按照1.0-5.0%的质量比均匀喷施于烟 叶表面，并维持温度在25_35°C，发酵约2-3月。
[0025] (2)烟丝喷施菌剂发酵:烟叶人工发酵期间喷施的微生物菌剂在卷烟制丝过程中 有较大损失，为增加烟草表面的微生物菌株含量，进一步提高烟草品质，在制丝工艺完成后 的加香加料阶段补充微生物菌剂，按照0.5-1.0 %的质量比均匀喷施于烟丝表面，并维持温 度在25-35°C，发酵约4-6小时。
[0026]添加完微生物菌剂的烟丝按照卷烟正常工艺制作成样品烟。
[0027]本发明的优点在于：
[0028] 1.尽管目前公认提高烟草品质的有效途径是通过微生物降解烟草中大分子有害 物质及转化小分子物质成为有益成分，但目前几乎所有的研究都集中在降解淀粉、蛋白质 方面，面对占烟草干重28%以上的细胞壁成分(纤维素、半纤维素、木质素和果胶)的降解研 究至今鲜有报道。
[0029]本发明在大量试验的基础上，通过科学合理的选育、复配微生物菌株，实现对烟草 主要有害成分前体物质较全面的降解和转化。
[0030] 2.烟草发酵改善品质的工作涉及大分子有害物质的降解，小分子物质转化成有益 成分，是一个极其复杂的过程，需有各类有效菌群的相互作用，但微生物的相互拮抗作用使 这一过程难以实现。
[0031] 本发明凭借大量的经验和实验摸索、掌握各类微生物的性能、代谢途径及生理生 化特性，选择合适的微生物菌群来相互配合完成这一过程，达到发酵的目的。
[0032] 3.由于烟草生产的特殊性，其整个生产工艺过程极不适合微生物的生长及进行相 关的代谢活动，因此微生物对烟草的发酵作用是一个极其缓慢、低效的过程。
[0033] 本发明选育的微生物具有极强的环境及生存条件的适应性，在适当的条件下，完 全能够较好的完成这一过程。
[0034]上述说明是本发明技术方案的概述，为了能更清楚了解本发明的技术手段，并可 依据说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例进行详细说明。
【具体实施方式】
[0035]下面对本发明的示例性实施方式进行详细描述。对示例性实施方式的描述仅仅是 出于示范目的，而绝不是对本发明及其应用或用法的限制。
[0036]本发明实施例中使用的菌种包括:产肮假丝酵母(Candida util is)、枯草芽孢杆 菌(Bacillus subtilis)，从西安紫瑞生物科技有限公司商购获得。
[0037] 所述的产朊假丝酵母能以尿素和硝酸作为氮源，在培养基中不需要加入任何生长 因子即可生长，能够有效同化硝酸盐，在降低氮亚硝胺类物质产生过程中发挥重要作用，其 产生的纤维素酶、半纤维素酶以及内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶等，可有效降解烟草的细胞 壁成分为酶解糖类，后者是卷烟香气形成的重要前体物质。
[0038] 所述的枯草芽孢杆菌抗逆性强，对稠环芳烃类物质有较好的降解作用，并能很好 的促进小分子有益物质的转化，添加到烟叶表面可改善烟叶香气，使烟叶中蛋白质含量降 低，可溶性氮，特别是氨、胺和酰胺含量增加，生物碱降低，pH值大幅度增加，研究指出，经由 该菌处理的烟叶制作的卷烟烟气更加细腻、醇和、余味干净，而对香气量和香气质影响不 大。
[0039] 本发明实施例中使用的培养基均为实验室常用的牛肉膏蛋白胨培养基、马铃薯培 养基，可由西安紫瑞生物科技有限公司直接商购获得。
[0040] 本发明实施例中使用的烟叶、场地及其它制烟、检测设备等均由上海烟草集团技 术中心提供。
[0041 ] 实施例1 [0042] 菌剂制备
[0043]分别取产朊假丝酵母、枯草芽孢杆菌菌株冻干管活化，经试管斜面培养、摇瓶培 养，制成微生物菌剂。
[0044]其中产朊假丝酵母的斜面及摇瓶培养采用马铃薯培养基，斜面培养条件:30°C，48 小时。摇瓶培养条件:30°C，180r/min，48小时；
[0045] 枯草芽孢杆菌的斜面、摇瓶培养采用牛肉膏蛋白胨培养基斜面培养条件：35°C， 24-36小时。摇瓶培养条件：35°C，180r/min，24-48小时。
[0046] 配置菌液
[0047]将产朊假丝酵母、枯草芽孢杆菌菌液按照1:1的质量比配置成2000g的微生物菌 剂，并添加总含量为0.5 %的无机盐。
[0048]烟叶喷施菌剂及发酵
[0049] 将上述1000g微生物菌剂均匀喷施到100kg烟叶中，维持温度在25-35°C，发酵2-3 月。
[0050] 对照组100kg烟叶不做任何处理，并置于实验组相同的环境中发酵2-3月。
[0051]卷烟主要危害成分检测
[0052] 利用实验组和对照组烟叶制丝并卷制样品烟，用吸烟机抽吸，用吸烟机抽吸，测定 卷烟烟丝及主流烟气每毫克焦油中稠环芳烃、氮亚硝胺含量，结果如表1、表2所示：
[0053]
[0055] 实施例2
[0056] 菌剂制备
[0057] 分别取产朊假丝酵母、枯草芽孢杆菌菌株冻干管活化，经试管斜面培养、摇瓶培 养，制成微生物菌剂。
[0058]其中产朊假丝酵母的斜面及摇瓶培养采用马铃薯培养基，斜面培养条件:30°C，48 小时。摇瓶培养条件:30°C，180r/min，48小时；
[0059] 枯草芽孢杆菌的斜面、摇瓶培养采用牛肉膏蛋白胨培养基斜面培养条件：35°C， 24-36小时。摇瓶培养条件：35°C，180r/min，24-48小时。
[0060] 配置菌液
[0061] 将产朊假丝酵母、枯草芽孢杆菌菌液按照1:1的质量比配置成2000g的微生物菌 剂，并添加总含量为0.5 %的无机盐。
[0062]喷施菌剂及烟叶发酵
[0063] 将上述2000g微生物菌剂均匀喷施到100kg烟叶中，维持温度在28-35°C，发酵2-3 月。
[0064]烟丝喷施菌剂及发酵
[0065]将上述经微生物菌剂发酵处理的烟叶配料并制丝；
[0066]按照步骤（1)、（2)方法，制备微生物菌剂，按照0.5-1.0%的质量比均匀喷施于 50kg上述烟丝表面，并维持温度在25-35 °C，发酵约4-6小时；
[0067]对照组烟丝不再喷施微生物菌剂，同样维持温度在25-35Γ，发酵约4-6小时。 [0068]卷烟主要危害成分检测
[0069] 利用实验组和对照组烟丝卷制样品烟，用吸烟机抽吸，用吸烟机抽吸，测定卷烟烟 丝及主流烟气每毫克焦油中稠环芳烃、氮亚硝胺含量，结果如表3、表4所示：
[0070]
[0072] 实施例3
[0073] (1)菌剂制备
[0074]分别取产朊假丝酵母、枯草芽孢杆菌菌株冻干管活化，经试管斜面培养、摇瓶培 养，制成微生物菌剂。
[0075]其中产朊假丝酵母的斜面及摇瓶培养采用马铃薯培养基，斜面培养条件:30°C，48 小时。摇瓶培养条件:30°C，180r/min，48小时；
[0076] 枯草芽孢杆菌的斜面、摇瓶培养采用牛肉膏蛋白胨培养基斜面培养条件：35°C， 24-36小时。摇瓶培养条件：35°C，180r/min，24-48小时。
[0077] (2)配置菌液
[0078]将产朊假丝酵母、枯草芽孢杆菌菌液按照2:1的质量比配置成2000g的微生物菌 剂，并添加总含量为0.5 %的无机盐。
[0079] (3)烟叶喷施菌剂及发酵
[0080] 将上述2000g微生物菌剂均匀喷施到100kg烟叶中，维持温度在25-35°C，发酵2-3 月。
[0081] 对照组100kg烟叶不做任何处理，并置于实验组相同的环境中发酵2-3月。
[0082]烟丝喷施菌剂及发酵
[0083] 将上述实验组、对照组烟叶配料并制丝；
[0084]按照步骤（1)、（2)方法，制备微生物菌剂，按照0.5-1.0%的质量比均匀喷施于 100kg由实验组烟叶制作的烟丝表面，并维持温度在28-35°C，发酵约4-6小时；
[0085] 对照组仍旧不做任何处理，维持温度在28-35Γ，发酵约4-6小时。
[0086] (4)卷烟主要危害成分检测
[0087] 利用实验组和对照组烟丝卷制样品烟，用吸烟机抽吸，测定卷烟烟丝及主流烟气 每毫克焦油中稠环芳烃、氮亚硝胺含量，结果如表5、6所示：
[0088]
L0090」买施例1、2、3中添加有微生物菌刑处理的烟皁均能Μ者降低烟丝及焦油中主要苊 害成分稠环芳烃及氮亚硝胺的含量。
[0091] 对比实例1可知，在卷烟制丝工艺完成后再次添加微生物菌剂可进一步降低卷烟 危害成分的含量。由实施例3可知，增加产朊假丝酵母在微生物菌剂中的比例，可显著降低 烟丝及焦油中氮亚硝胺类物质的含量，但稠环芳烃的降低率却相对减少，说明过量的酵母 可能会抑制枯草芽孢杆菌的生长，进而使稠环芳烃的降低率减小。
[0092] 虽然参照示例性实施方式对本发明进行了描述，但是应当理解，本发明并不局限 于文中详细描述和示出的【具体实施方式】，在不偏离权利要求书所限定的范围的情况下，本 领域技术人员可以对所述示例性实施方式做出各种改变。
【主权项】
1. 一种烟用微生物菌剂，其特征是包含至少一种可分解大分子物质的菌株。2. 如权利要求1所述的烟用微生物菌剂，其中特征在于包括产朊假丝酵母和枯草芽孢 杆菌。3. 如权利要求2所述的烟用微生物菌剂的制备方法，包括下述步骤： (1) 分别取产朊假丝酵母、枯草芽孢杆菌菌株冻干管活化，经试管斜面培养、摇瓶培养， 制成微生物菌剂； (2) 将产朊假丝酵母菌液和枯草芽孢杆菌菌液混合，并添加无机盐。4. 如权利要求3所述的烟用微生物菌剂的制备方法，其中产朊假丝酵母、枯草芽孢杆菌 活菌数含量均大于或等于108CFU/mL。5. 如权利要求3所述的所述的烟用微生物菌剂的制备方法，其特征在于步骤二中产朊 假丝酵母、枯草芽孢杆菌重量比为1:1。6. 如权利要求3所述的所述的烟用微生物菌剂的制备方法，其特征在于所述无机盐由 磷酸二氢钾1.5g/L、磷酸氢二钾1.5g/L、硫酸铵1.5g/L、七水硫酸镁O . 5g/L、氯化钠 1.0 g/L 组成。7. 如权利要求1或2所述的所述的烟用微生物菌剂在发酵烟叶和烟丝中的应用。8. 如权利要求7所述的应用，其特征在于所述的烟用微生物菌剂在发酵烟叶和烟丝中 的应用中至少包括下述两个步骤中的一个： (1) 烟叶喷施菌剂发酵:将上述微生物菌剂按照1.0-5.0 %的质量比均匀喷施于烟叶表 面，并维持温度在25-35Γ，发酵约2-3月； (2) 烟丝喷施菌剂发酵:在制丝工艺完成后的加香加料阶段补充微生物菌剂，按照0.5-1.0%的质量比均匀喷施于烟丝表面，并维持温度在25-35°C，发酵约4-6小时。
【文档编号】C12N1/16GK105907684SQ201610466228
【公开日】2016年8月31日
【申请日】2016年6月23日
【发明人】陈五岭, 杜茂林
【申请人】陈五岭