一株具有低温降解石油功能的红球菌及其应用
【专利摘要】本发明公开了一株具有低温降解石油功能的红球菌Rhodococcus sp.QY?2，其保藏号为CGMCC No.11634。该菌株筛选自我国北方受石油污染的海域，可在低温条件下高效地降解石油，特别是可在0℃的极端环境下高效地降解石油。本发明的红球菌QY?2可应用于海洋石油污染的生物修复中，尤其可应用于我国北方海域冬季(包括冰期)等低温环境下的溢油生物修复工作中。CGMCC No. 1163420151109
【专利说明】
一株具有低温降解石油功能的红球菌及其应用
技术领域
[0001] 本发明属于微生物技术领域，涉及一株海洋低温菌及其在海洋石油污染生物修复 中的应用。所述菌株具有能在o°c的极端条件下高效降解石油烃的特点。
【背景技术】
[0002] 随着海洋运输业的高速发展和海洋开采业的快速崛起，海洋溢油事故日益频发， 使得海洋环境的平衡遭到了严重的破坏。在冬季，特别是冰期，一但发生海上溢油事故，由 于短链石油烃蒸发缓慢，长链烃凝为固体，使有机污染物持久存在，会对当地生态系统造成 相当大的危害，而且也加大了溢油应急和生态修复工作的难度。在我国北方地区，尤其北黄 海和渤海海域，一年中有近5个月处于低温期，冬季海水温度平均在2°C左右，也会有结冰 期。虽然目前已经发现了一些能在〇°C左右降解石油的海洋低温降解菌，但菌源主要来自极 地环境。外源菌的大量引入易对生态环境产生威胁，因此在我国低温海域筛选出高效的低 温降解石油烃的细菌本地种，进一步商业化，对我国北方海域的石油污染清除将有很高的 应用价值，也会产生出可观的经济效益。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的在于针对上述现有技术的不足提供一株在低温条件下可降解石油 的海洋石油降解菌。该菌株筛选自我国北方受石油污染的海域，可在〇°C的极端环境下高效 地降解石油。
[0004] 本发明所提供的具有在低温条件下降解石油性能的红球菌(Rhodococcus sp.) QY-2是从胶州湾筛选获得的。2013年11月22,中石化输油储运公司潍坊分公司输油管线破 裂。事故发生后，部分原油沿着雨水管线进入胶州湾，污染附近海域。溢油发生一周后，取表 层被原油污染的海水，经过筛选得到Rhodococcus sp.QY-2。
[0005] 该菌株已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称:CGMCC，地址 为:北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101)保藏，保藏 号为CGMCC No. 11634，保藏日期为2015年11月09日。
[0006] 本发明的Rhodococcus sp.QY-2的特征如下：
[0007] (1)菌落特征:乳酪色、圆形、凸起、光滑、边缘完整。
[0008] ( 2)遗传学特征：16S rDNA分析，表明其属于红球菌属（Rhodococcus )。菌株 Rhodococcus sp.QY-2的16S rDNA序列具体可见序列表。
[0009] (3)石油降解性能特征：在0°C条件下，经过60天的降解实验后，原油降解率可达 53%〇
[0010]本发明还提供红球菌(Rhodococcus sp. )QY-2在低温条件下降解石油中的应用， 优选地，该菌降解石油中的石油烃。所述低温条件是指〇°C~15°C，尤其是指0°C~4°C，最好 为0°C。本发明的红球菌QY-2可应用于海洋石油污染的生物修复中，尤其可应用于低温环境 中。
[0011]本发明的有益效果：
[0012]本发明的Rhodococcus SP.QY-2是一株高效海洋低温石油降解菌，即使是在0°C的 条件下还能保持较高的石油烃降解活力。
[0013] 本发明的菌株培养方法简单，培养基原料易得，菌株对石油烃降解能力强，适用于 我国北方海域溢油(包括冰期溢油）的生物修复工作。
【具体实施方式】
[0014] 下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以 任何方式限制本发明。另外，下述实施例中，如无特殊说明，所使用的实验方法均为常规方 法，所用材料、试剂等均可从生物或化学试剂公司购买。
[0015] 下述实施例采用的培养基及其组成为如下：
[0016] MMC培养基为：NaCl 24g，NH4N03 1.0g，KCl 0.7g，KH2P〇4 2.0g，Na2HP〇43.0g， MgS〇4.7H20 7.0g，微量元素 CaCl2 0.02mg/L，FeCl3.6H20 0.5mg/L，CuS〇4〇.005mg/L， MnCl2.4H2〇 0.005mg/L，ZnS〇4.7H20 0.1mg/L，加去离子水至lL，pH 7.4;
[0017] 2216E液体培养基为：蛋白胨5g，酵母膏lg，磷酸高铁0. lg，加去离子水至lOOOmL， pH值7.4~7.8;
[0018] 2216E琼脂培养基为:蛋白胨5g，酵母膏1 g，磷酸高铁0. lg，琼脂15g，加去离子水至 100〇1^，？田直7.4~7.8。
[0019] 实施例1菌株Rhodococcus sp.QY-2的分离与鉴定
[0020] 1.菌株Rhodococcus sp.QY-2的分离
[0021] (1)样品采集:2013年11月22,中石化输油储运公司潍坊分公司输油管线破裂，部 分原油污染了胶州湾附近海域。溢油发生一周后，取表层被原油污染的海水；
[0022] (2)富集驯化:于250mL三角瓶中加入lOOmLMMC培养基，120°C下灭菌15min，加入采 集回来的海水样品5mL和灭菌后的原油0.5mL。将混合液置入生化培养箱，于150r/min、10 °C 下振荡培养30d;培养结束后取培养液5mL进行下一轮转接培养:将5mL培养液加入到已灭菌 的含有〇.5mL原油的100mL MMC培养液中，于150r/min条件下培养30d。重复上述步骤，每轮 的培养温度比上一轮低1°C，直至0°C，并在0°C条件下长期驯化。
[0023] (3)分离纯化:将经过富集驯化的微生物培养液进行梯度稀释，并在2216E固体培 养基上进行平板划线，〇°C培养直至长出清晰菌落。挑选生长良好的菌落，在已灭菌的2216E 固体培养基上分3个区域进行划线，置入生化培养箱，于0°C下培养。挑取3区具有生长优势 的单菌落，进行二次划线分离。如此反复多次划线，直到分离出菌落单一的菌株，命名为菌 株QY-2。
[0024] 2.菌株Rhodococcus sp.QY-2的鉴定
[0025] (1)菌落特征:乳酪色、圆形、凸起、光滑、边缘完整。
[0026] (2)遗传学特征：16S rDNA分析，表明其属于红球菌属(Rhodococcus)，被分类为红 球菌(Rhodococcus sp.)。该菌株已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保 藏，其保藏号为CGMCC No.11634,保藏日期为2015年11月09日。16S rDNA序列如SEQ ID Νο·1〇
[0027]实施例2菌株Rhodococcus sp.QY-2的发酵
[0028]用无菌接种环挑取纯化后的菌苔至装有lOOmL已灭菌的2216E液体培养基的三角 瓶锥形中，低温振荡培养7(1(0°(：，12(^/1^11)，成为种子液；将种子液按10%体积比加入 2216E液体培养基中，0 °C下培养7天，获得发酵液。
[0029] 实施例3在0°C条件下菌株Rhodococcus sp.QY-2石油经降解率的测定
[0030] (1)降解菌种子液
[0031] 用无菌接种环挑取纯化后的菌苔至装有100mL已灭菌的2216E液体培养基的三角 瓶锥形中，低温振荡培养7d(0°C，120r/min)。
[0032] (2)降解培养
[0033] 称取0.5g原油溶于20mL已过滤灭菌的正己烧中，移至装有100mL已灭菌的MMC液体 培养基的三角瓶锥形中，放置到振荡器上振荡直至正己烷挥发完全，按照10%的接种量接 种菌株Rhodococcus sp.QY-2种子液，低温振荡培养60d(0°C，120r/min)。以不接种降解菌 的培养液作为空白组。
[0034] (3)萃取
[0035]降解培养结束后，在培养液中加入3mL 50%的硫酸溶液进行酸化。将酸化后的培 养液移入250mL的分液漏斗中。用20mL的正己烷清洗空三角瓶后把正己烷倒入分液漏斗，充 分振荡后静置。液体明显分层后把下层液体转至三角瓶中，上层液离心后通过铺满无水硫 酸钠的砂芯漏斗过滤除水后收集，进行下一步分析。萃取2~3次，然后合并上层液。
[0036] (4)原油标准曲线绘制
[0037] 称取O.lg油样品溶于正己烷中，移至100mL的容量瓶中，定容得到浓度为l.OOmg/ mL的油标准储备溶液。移取5mL油标准储备溶液于50mL容量瓶中，用正己烷定容，得到浓度 为0. lmg/mL油标准使用液。分别移取一定量的0. lmg/mL油标准使用液于25mL容量瓶中，用 正己烷定容，得到一系列已知浓度的油溶液。采用紫外分光光度法，在227nm处测其吸光度。 以油浓度为纵坐标，吸光度为横坐标，绘制标准曲线。
[0038] (5)吸光度测量
[0039]采用紫外分光光度计进行测量。在227nm的波长下，以正己烷的吸光度为参比，用 10mm石英比色皿测萃取液吸光度。若吸光值超过标准曲线范围，则对萃取液按照1/10的比 例逐级稀释。根据标准曲线，算出其相应的浓度。
[0040] (6)结果
[0041 ] 降解率的计算:降解率D =( Co-&) /Co X 100 %
[0042]式中Co:空白瓶(不加菌）中原油的浓度;&:实验瓶(加菌）中原油的浓度。
[0043]计算结果为降解率为53%，说明在0°C条件下本发明的菌株对原油具有高效的降 解能力。
[0044] 实施例4在15°C条件下菌株Rhodococcus sp.QY-2石油经降解率的测定
[0045] (1)降解菌种子液
[0046]用无菌接种环挑取纯化后的菌苔至装有100mL已灭菌的2216E液体培养基的三角 瓶锥形中，低温振荡培养5d( 15°C，120r/min)。
[0047] (2)降解培养
[0048] 称取0.5g原油溶于20mL已过滤灭菌的正己烧中，移至装有100mL已灭菌的MMC液体 培养基的三角瓶锥形中，放置到振荡器上振荡直至正己烷挥发完全，按照10%的接种量接 种菌株Rhodococcus sp.QY-2种子液，低温振荡培养60d(15°C，120r/min)。以不接种降解菌 的培养液作为空白组。
[0049] (3)萃取
[0050]降解培养结束后，在培养液中加入3mL 50%的硫酸溶液进行酸化。将酸化后的培 养液移入250mL的分液漏斗中。用20mL的正己烷清洗空三角瓶后把正己烷倒入分液漏斗，充 分振荡后静置。液体明显分层后把下层液体转至三角瓶中，上层液离心后通过铺满无水硫 酸钠的砂芯漏斗过滤除水后收集，进行下一步分析。萃取2~3次，然后合并上层液。
[0051 ] (4)原油标准曲线绘制
[0052] 称取O.lg油样品溶于正己烷中，移至100mL的容量瓶中，定容得到浓度为l.OOmg/ mL的油标准储备溶液。移取5mL油标准储备溶液于50mL容量瓶中，用正己烷定容，得到浓度 为0. lmg/mL油标准使用液。分别移取一定量的0. lmg/mL油标准使用液于25mL容量瓶中，用 正己烷定容，得到一系列已知浓度的油溶液。采用紫外分光光度法，在227nm处测其吸光度。 以油浓度为纵坐标，吸光度为横坐标，绘制标准曲线。
[0053] (5)吸光度测量
[0054]采用紫外分光光度计进行测量。在227nm的波长下，以正己烷的吸光度为参比，用 10mm石英比色皿测萃取液吸光度。若吸光值超过标准曲线范围，则对萃取液按照1/10的比 例逐级稀释。根据标准曲线，算出其相应的浓度。
[0055] 降解率的计算:降解率D =( Co-&) /Co X 100 %
[0056] 式中Co:空白瓶中原油的浓度:实验瓶中原油的浓度。
[0057] (6)结果
[0058] 降解率的计算:降解率〇=(〇)-&)/0) X 100%
[0059]式中Co:空白瓶(不加菌）中原油的浓度;&:实验瓶(加菌）中原油的浓度。
[0060]计算结果降解率为67%，说明在15°C条件下本发明的菌株对石油具有高效的降解 能力。
【主权项】
1. 一株具有低温降解石油功能的红球菌Rhodococcus sp . QY-2，其保藏号为CGMCC No.11634。2. 如权利要求1所述的红球菌QY-2在低温条件下降解石油中的应用。3. 根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述红球菌QY-2降解石油中的石油烃。4. 根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于，所述低温条件为(TC~15 °C。5. 根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述低温条件为(TC。
【文档编号】C12R1/01GK105907675SQ201610289660
【公开日】2016年8月31日
【申请日】2016年5月4日
【发明人】郭平, 林建国, 曹宾霞
【申请人】大连海事大学