一株合成银纳米颗粒微生物的筛选、鉴定及银纳米颗粒表征的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一株合成银纳米颗粒微生物的筛选、鉴定及银纳米颗粒表征。包括如下步骤：（1）在特定环境中采集样品，接种于富含银的培养基，重复富集，分离，获得银耐受微生物菌株；（2）将银耐受微生物菌株接种于发酵培养基，离心取发酵上清液，加入一定浓度硝酸银，观察颜色变化，利用420 nm特征吸收峰初步鉴定上述菌株；（3）将步骤（2）筛选到的合成银纳米颗粒性能高的菌株进行发酵条件优化，获得微生物生物合成银纳米颗粒，对银纳米颗粒表征，对上述菌株16S rDNA测序，并鉴定其种类。通过上述筛选方法获得一株具有合成银纳米颗粒的新型微生物，生物合成方法绿色、环境友好，在生物医学领域有更好的应用。
【专利说明】
一株合成银纳米颗粒微生物的筛选、鉴定及银纳米颗粒表征
技术领域
[0001]本发明涉及一株合成银纳米颗粒微生物的筛选、鉴定及银纳米颗粒表征，属于生物工程技术领域。
【背景技术】
[0002]目前银纳米颗粒的制备主要采用液相化学还原法、光化学还原法、微乳液法等化学方法和高能球磨、激光溅射、激光烧蚀等物理方法。物理方法所得产品质量高，但对设备要求和能耗较高，且对银纳米颗粒形貌的调控能力有限，不利于工业化生产;化学方法由于其工艺相对简单，操作相对容易，生产成本较低，是较常采用的方法，但其所用的化学试剂对人体和环境有一定的危害。近年来，纳米材料制备过程绿色化的研究日趋活跃，微生物还原法制备银纳米颗粒具有安全、环保、反应条件温和、所得银纳米颗粒稳定性高等优点，成为具有发展前景的银纳米颗粒制备新方法。
[0003]微生物作为生产纳米材料的绿色工厂，具有举足轻重的作用和地位。当前用于合成银纳米的微生物主要为细菌和真菌。真菌被大量报道可以合成银纳米，且多为胞外反应，可以实现银离子、银纳米颗粒与菌体的隔离，不存在银离子或银纳米颗粒对于菌体生长状态的影响问题，同时可以使下游银纳米颗粒的分离纯化更为简单。但真菌的培养时间相对较长，且部分需要将菌丝体进行二次发酵，使得其培养成本增加，时间延长，不太利于放大以及工业化生产。细菌相对于真菌而言，具有繁殖速度快、遗传转化操作简单等优点，因而更多地被用于合成银纳米粒子。细菌合成银纳米颗粒主要采用胞内合成与胞外合成两种方法，由于Ag+具有较强的杀菌作用，只有少数对Ag+有较强抗性的菌株才能采用菌液胞内合成的方法，因此具有较大的局限性，同时胞内合成的银纳米颗粒大多吸附在菌体细胞壁表面或内部，后期分离困难。而胞外合成法因为选用细菌上清液，所以不存在拮抗Ag+的问题，同时后期分离方便快捷，已成为细菌合成银纳米方法研究的重点。已有报道表明枯草芽抱杆菌{Bacillus subtil is)、地衣芽抱杆菌_/icAe/3i/b_ra)、不动鞘氨醇单胞舊Xsphingomonas paucimobilis sp.j5AS7)等可采用上清液胞外合成法合成银纳米颗粒。
【发明内容】
[0004]本发明通过筛选、鉴定、表征，得到一株新型的能合成银纳米颗粒的菌株。筛选获得的菌株能高效、快速的合成银纳米颗粒，为进一步研究银纳米颗粒的特性奠定基础，具有重要的潜在研究价值。
[0005]本发明的技术方案:一株合成银纳米颗粒微生物的筛选方法，包括如下步骤:
SOOl从特定环境种采集样品取少量，加入灭菌后的富集培养基于25?40°C、200 r/min
条件的摇床中振荡培养，得到富集培养液；
S002取培养后的富集培养液进行梯度稀释后，采用平板稀释涂布法涂布到筛选培养基平板上进行培养，挑取银耐受微生物菌株在另一新的筛选培养基平板上进行划线转接培养，上述所述筛选培养基中含有硝酸银，重复筛选，直至得到一定数量银耐受微生物菌株单菌落；
S003将S002中获得的银耐受微生物菌株接种于发酵培养基振荡培养，取发酵液离心分离得上清液，在上清液中加入I?20 mmol/L的硝酸银在30?70°C、200 r/min转速下培养24?72 h生物合成银纳米颗粒，利用420 nm特征吸收峰初步鉴定合成银纳米颗粒的微生物菌株。取筛选到的合成银纳米颗粒性能高的菌株进行发酵条件优化，微生物生物合成获得银纳米颗粒;利用紫外-可见分光光度计在300?600 nm范围内每隔I nm进行光谱扫描，检测银纳米颗粒特有的表面等离子体共振峰。使用X-射线衍射仪以CuKa为辐射源进行2Θ angles为20°?80°的扫描(λ=0.15418 nm)，电压50 kV，电流200 mA，扫描步长0.01670，每步间隔时间约为6s。使用乙醇做溶剂，将固体粉末溶解后，超声分散，之后用0.22 μπι滤膜过滤以除去菌体，然后高速离心收集银纳米，自然风干后取少量粉末，加入干燥的KBr粉末(银纳米粉末:KBr约为60:1)，研磨均匀后压片，使用傅立叶转换(FTIR)红外光谱仪在400?4000 cm—1范围内，间隔4 cm—1对样品进行扫描检测。取一滴经乙醇超声分散后的菌体与银纳米混合物滴在一块干净的盖玻片上，自然风干后喷金，然后在10 kV加速电压下使用场发射扫描电镜(FESEM)进行观察；
S004将银耐受微生物菌株接种于富集培养基平板上，在37°C的条件下倒置培养24 h，观察其菌落生长状态;将银耐受微生物菌株接种于筛选培养基平板上，在37 0C的条件下倒置培养48 h，观察银耐受微生物菌株的生长状态；
S005将上述银耐受微生物菌株进行16S rRNA的PCR扩增，PCR扩增中的DNA提取采用上海生工生物工程股份有限公司的细菌基因组提取试剂盒，用27F (5-AGA GTT TGA TCC TGGCTC AG-3)和 1492R (5-GGC TAC CTT GTT ACG ACTT-3)这一对引物对其 16S rRNA进行PCR扩增；
PCR反应体系为:5 yL DNA,5 yL 10 XPCR缓冲液，4 yL dNTP (含2.5 mmol/L dATP，dCTP，dGTP 和dTTP)，l yL上、下游引物，0.5 yL Taq 聚合酶，38.5 yL dd H20；
PCR反应条件为:94°C预变性3 min，进入循环，93°C变性50s，55°C退火lmin，72°C延伸I min，30个循环，72 °C延伸1 min后保存4 °C状态。PCR产物纯化试剂盒由上海捷瑞生物工程有限公司购得，纯化后进行1%琼脂糖凝胶电泳，获得条带位置正确的PCR产物后，送上海美吉生物医药科技有限公司完成测序，测序结果如SEQ所示；
获得序列后，通过GenBank中的BLAST工具进行序列比对，之后绘制系统进化树以确定该菌的进化位置及名称。
[0006]上述银耐受微生物菌株的形态学特征为:本发明的银耐受微生物菌株的菌落呈圆形，表面光滑，呈凸透镜状隆起，边缘完整，如图7所示。图7右侧场发射扫描电镜下可以观察本发明的银耐受微生物菌株形状呈梭形。本发明的银耐受微生物菌株的生理生化实验结果表明:银耐受微生物菌株是革兰氏阴性菌，在10?40°C的温度范围内都能生长，最适温度为37 0C ;在pH值为6?11时都能生长，最佳生长pH值为7.2，兼性厌氧。
[0007]本发明的上述银耐受微生物菌株的筛选方法中，通过在富集培养基中富集培养后，平板出现不同菌落，再挑取各菌落接种至筛选培养基，所述筛选培养基中加入硝酸银，使能利用硝酸银的微生物生长得到进一步的强化并逐渐形成优势菌株，然后将优势菌株转移到另一筛选培养平板上进行划线接种，使硝酸银产生菌逐渐被分离筛选出来并形成单菌落，直至得到合成银纳米颗粒性能高的银耐受微生物菌株单菌落。
[0008]本发明的银耐受微生物菌株是从某污水处理厂中分离并筛选得到的，是一株未报道的新型合成银纳米菌株，命名为Ars1iAaciDus fusiformis sp.本发明的银耐受微生物菌株的菌落在固态培养基上呈白色，菌落形态为圆形，表面光滑，呈凸透镜状隆起，边缘完整，场发射扫描电镜下观察菌体呈梭形。
[0009]本发明的银耐受微生物菌株，经革兰氏染色鉴定为革兰氏阴性菌，在25?40°C的温度范围内都能生成，在pH值7.0-8.0时都能生长。
[0010]综上所述，本发明具有的优点:
1、本发明的银耐受微生物菌株是一种新型的菌株，具有合成银纳米颗粒的能力；
2、本发明制备得到的银纳米颗粒具有生物相容性好、低毒性以及抗菌的特性，在生物医学领域具有重要的作用。
【附图说明】
[0011 ]图1是本发明银纳米颗粒合成反应前后溶液颜色变化图(左边为发酵液对照;右边为发酵液添加3 mmol/L硝酸银)。
[0012]图2是液体紫外-可见光谱扫描结果图。
[0013]图3是银纳米混合物反应后固体混合物的X-射线衍射图。
[0014]图4是银纳米混合物反应前固体混合物的X-射线衍射图。
[0015]图5是本发明的fusiformis sp.菌株合成的银纳米颗粒Zeta电位图。
[0016]图6是本发明的fusiformis sp.菌株合成的银纳米颗粒FESEM图。
[0017]图7是本发明的ZjsifiiAaciHus fusiformis sp.菌株的菌落形态图与菌体显微镜照片图。
[0018]图8是本发明的fusiformissp.菌株 16S rDNA鉴定比对结果制成的系统进化树系统进化树图。
[0019]
【具体实施方式】
[0020]下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的具体的说明，但是本发明并不限于这些实施例。
[0021]实施例1
一株合成银纳米颗粒微生物的筛选，包括如下步骤:
51.取采集到的某污水处理厂的污泥样品、某工业园区的土壤样品，分别加入到灭菌后的富集培养基中，然后在37°c、200 r/min条件下进行振荡培养24 h，得到富集培养液；
52.取培养后的富集培养液样品，用无菌水稀释11?16倍进行梯度稀释，采用平板稀释涂布法分别涂布到相应的筛选培养基平板上，所述筛选培养基中含有30mg/L的硝酸银，在37°C条件下培养48h后观察，挑取其中一株银耐受微生物菌株到另一新的筛选培养基平板上进行连续划线转接培养，直至得到一定数量银耐受微生物菌株单菌落，挑取其中一株单菌落A菌株； S3.将S2中获得的A菌株单菌落接种于液体发酵培养基，在37°C、200 r/min条件下振荡培养，取发酵液离心，收集发酵上清液，调节发酵上清液PH为10，上清液中加入18 mmol/L的硝酸银在60 0C，200 r/min转速的摇床中振荡培养48h，得到生物合成的银纳米颗粒，观察颜色变化，利用420 nm特征吸收峰初步鉴定合成银纳米颗粒的微生物菌株。
[0022]
实施例2
一株合成银纳米颗粒微生物的筛选，包括如下步骤:
51.取采集到的某污水处理厂的污泥样品、某工业园区的土壤样品，分别加入到灭菌后的富集培养基中，然后在30°C、200 r/min条件下进行振荡培养36 h，得到富集培养液；
52.取培养后的富集培养液样品，用无菌水稀释11?16倍进行梯度稀释，采用平板稀释涂布法分别涂布到相应的筛选培养基平板上，所述筛选培养基中含有50 mg/L的硝酸银，在30°C条件下培养48h后观察，挑取其中一株银耐受微生物菌株到另一新的筛选培养基平板上进行连续划线转接培养，直至获得一定数量银耐受微生物菌株单菌落，挑取其中一株单菌落B菌株；
S3.将S2中获得的B菌株单菌落接种于液体发酵培养基，在30°C、200 r/min条件下振荡培养，取发酵液离心，收集发酵上清液，调节发酵上清液PH为9，上清液中加入5 mmol/L的硝酸银在50°C，200 r/min转速的摇床中振荡培养48h，得到生物合成的银纳米颗粒，观察颜色变化，利用420 nm特征吸收峰初步鉴定合成银纳米颗粒的微生物菌株。
[0023]
实施例3
一株合成银纳米颗粒微生物的筛选，包括如下步骤:
51.取采集到的某污水处理厂的污泥样品、某工业园区的土样，分别加入到灭菌后的富集培养基中，然后在37°C、200 r/min条件下进行振荡培养36 h，得到富集培养液；
52.取培养后的富集培养液样品，用无菌水稀释11?16倍进行梯度稀释，采用平板稀释涂布法分别涂布到相应的筛选培养基平板上，所述筛选培养基中含有50 mg/L的硝酸银，在37°C条件下培养48h后观察，挑取其中一株银耐受微生物菌株到另一新的筛选培养基平板上进行连续划线转接培养，直至得到一定数量银耐受微生物菌株单菌落，挑取其中一株单菌落C菌株；
53.将S2中获得C菌株单菌落接种于液体发酵培养基，在37°C、200r/min条件下振荡培养，取发酵液离心，收集发酵上清液，调节发酵上清液PH为7，上清液中加入3 mmol/L的硝酸银在30°C，200 r/min转速的摇床中振荡培养48 h，得到生物合成的银纳米颗粒，观察颜色变化，利用420 nm特征吸收峰初步鉴定合成银纳米颗粒的微生物菌株。
[0024]
实施例4
一株合成银纳米颗粒微生物的筛选，包括如下步骤:
51.取采集到的某污水处理厂的污泥样品、某工业园区的土壤样品，分别加入到灭菌后的富集培养基中，然后在30°C、200 r/min条件下进行振荡培养24 h，得到富集培养液；
52.取培养后的富集培养液样品，用无菌水稀释11?16倍进行梯度稀释，采用平板稀释涂布法分别涂布到相应的筛选培养基平板上，所述筛选培养基中含有30mg/L的硝酸银，在30°C条件下培养48h后观察，挑取其中一株银耐受微生物菌株到另一新的筛选培养基平板上进行连续划线转接培养，直至得到一定数量银耐受微生物菌株单菌落，挑取其中一株单菌落D菌株；
S3.将S2中获得D菌株单菌落接种于液体发酵培养基，在30°C、200 r/min条件下振荡培养，取发酵液离心，收集发酵上清液，调节发酵上清液PH为8，上清液中加入3 mmol/L的硝酸银在50°C，200 r/min转速的摇床中振荡培养48 h，得到生物合成的银纳米颗粒，观察颜色变化，利用420 nm特征吸收峰初步鉴定合成银纳米颗粒的微生物菌株。
[0025]
以上所述的实施例中，实施例2中所述的B菌株比其他A、C、D菌株合成银纳米颗粒的性能要高，取B菌株进行16S rDNA鉴定比对结果制成系统进化树，经与NCBI数据库用BLAST软件进行序列比对，将比对结果得出，该菌被鉴定为梭形赖氨酸芽孢杆菌(ArsifiiAaciHusfasiformis sp.)0
【主权项】
1.一株合成银纳米颗粒微生物的筛选、鉴定及银纳米颗粒表征，其特征在于，包括如下步骤: 51.从特定环境中采集样品，取少量样品加入灭菌后的富集培养基于25?40°C、200r/min条件的摇床中振荡培养，得到富集培养液； 52.取培养后的富集培养液进行稀释后涂布到筛选培养基平板上进行培养，挑取银耐受微生物菌株在另一新的筛选培养基平板上进行划线转接培养，上述筛选培养基中含有硝酸银，重复筛选得到银耐受微生物菌株； 53.将S2获得的银耐受微生物菌株接种于发酵培养基，在25?40°C、200r/min条件下振荡培养，取发酵液离心分离得上清液，在上清液中加入I?20 mmol/L的硝酸银在30?70°C、200 r/min转速下培养24?72h生物合成银纳米颗粒，利用420 nm特征吸收峰初步鉴定合成银纳米颗粒的微生物菌株;取筛选到的合成银纳米颗粒性能高的菌株进行发酵条件优化，获得微生物生物合成银纳米颗粒;利用紫外-可见全波长扫描仪、Zeta电位仪、透射电镜、红外光谱仪及X -射线衍射仪等仪器进行对银纳米颗粒表征； 54.将合成银纳米颗粒性能高的微生物菌株进行鉴定，根据平板的菌落形态对其进行初步菌落特征描述;采用分子生物学手段对其进行遗传鉴定16S rDNA测序，通过BLAST比对后构建系统进化树，证明得到一株未报道的新型微生物菌株。2.根据权利要求1所述的合成银纳米颗粒微生物的筛选方法，其特征在于，所述步骤SI中的特定环境为富含银的污水处理厂、环境污染物及工业园区。3.根据权利要求1所述的合成银纳米颗粒微生物的筛选方法，其特征在于，所述步骤SI中的富集培养基的灭菌方式为121°C，湿热灭菌20 min，培养条件为37°C，12?48h。4.根据权利要求1所述的合成银纳米颗粒微生物的筛选方法，其特征在于，所述步骤S2中的银耐受微生物菌株主要有A、B、C、D菌。5.根据权利要求1所述的合成银纳米颗粒微生物的筛选方法，其特征在于，所述步骤S4中的合成银纳米颗粒性能高的银耐受微生物菌株为B菌株梭形赖氨酸芽孢杆菌ilysinibacillus fusiformis sp.)，所述梭形赖氨酸芽孢杆菌的16S rRNA序列如SEQ所不O
【文档编号】C12R1/01GK105907668SQ201610257732
【公开日】2016年8月31日
【申请日】2016年4月25日
【发明人】李相前, 周荣莹, 夏继林
【申请人】淮阴工学院