一株水稻根瘤菌及其在固氮产碱中的应用
【专利摘要】本发明公开了一株水稻根瘤菌及其在固氮产碱中的应用。所述的水稻根瘤菌(Rhizobium oryzae) Alt301于2016年3月11日保藏于广东省微生物菌种保藏中心（GDMCC），菌种保藏号为 GDMCC No：60018。所述菌株来源于高杆野生稻植物组织，能够与豆科植物结瘤固氮，明显促进水稻等作物生长，发酵产碱改善作物根际微生态酸碱平衡，可广泛地应用于各种农作物及豆科作物种植。在经本发明的水稻根瘤菌处理后，显著促进水稻、大豆等作物的生长。GDMCC No：6001820160311
【专利说明】
一株水稻根瘤菌及其在固氮产碱中的应用
技术领域
[0001 ]本发明属于微生物技术领域，具体地，涉及一株水稻根瘤菌及其在固氮产碱中的应用。
【背景技术】
[0002]根瘤菌是与豆科植物共生，形成根瘤并固定空气中的氮气供植物营养的一类革兰氏染色阴性需氧杆菌。正常细胞以鞭毛运动，无芽孢。可利用多种碳水化合物，并产生相当量的胞外粘液。如根瘤菌属和慢性根瘤菌属都能从豆科植物根毛侵入根内形成根瘤，并在根瘤内成为分枝的多态细胞一类菌体。类菌体在根瘤内不生长繁殖，却能与豆科植物共生固氮，对豆科植物生长有良好作用。类菌体执行固氮功能，将分子氮还原成NH3,分泌至根瘤细胞内，并合成酰胺类或酰脲类化合物，输出到根瘤，由根的传导组织运输至宿主地上部分供利用。与宿主的共生关系是宿主为根瘤菌提供良好的居住环境、碳源和能源以及其他必需营养，而根瘤菌则为宿主提供氮素营养。例如:人工接种根瘤的花生每年每平方米的固氮量为7.2?12.4g，即每亩花生可以从固氮作用中获得相当于10?17公斤尿素的氮，特别在贫瘠土壤中，人工接种根瘤菌所需的氮素养分有2/3来自于共生固氮。仅1/3是从土壤吸收来的。根瘤每天固定的氮素有94%供给植株，仅有6%留在根瘤中。花生植株不断地从根瘤中得到氮素供应，终身受益。根瘤菌接种剂经中国100多万亩土地豆科作物长达50年的试验、示范证明，根瘤菌接种剂能大量减少化肥的使用量，改善农产品品质，使农产品达到AA级绿色食品要求;有效提高农作物的产量;无任何不良副作用，不构成重金属污染;施用成本只有化肥的1/10;根瘤菌剂还具有培肥地力，改良土壤结构，肥地养地之功能，所以根瘤菌接种技术在豆科作物种植中的作用是其他任何技术措施无法替代的，具有十分重要的地位。
【发明内容】
[0003]本发明针对现有技术的不足，提供了一株水稻根瘤菌(Rhizobiumoryzae )Alt301。所述菌株具有固氮、产碱能力，生长势良好、对环境适应性强。
[0004]本发明的另一目的在于提供所述菌株在固氮产碱中的应用。所述水稻根瘤菌的应用能大量减少化肥的使用量，改善农产品品质，有效提高农作物的产量。通过所述菌株产碱改善作物作物根区的微生态酸碱平衡，促进和提高各类微生物的活性，从而能够显著提高蔬菜及作物产量和品质的菌株。
[0005]本发明的上述目的是通过以下技术方案予以实现的。
[0006]一株水稻根瘤菌(Rhizobium oryzae)Alt301，所述菌株于2016年3月11日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，菌种保藏号为GDMCC No: 60018，分类命名为:水稻根瘤菌(Rhizobium oryzae);保藏地址为广东省广州市先烈中路100号。
[0007]本发明所述菌株为本实验室分离的新种中的菌株，经查找还未有关于水稻根瘤菌的专利文献，而本发明固氮酶活性为500?600nmol.mL—1.h—1，按照与实施例5相同方法产碱，溶液pH值升至7.8?8.1之间，因此，本发明相较于现有技术具有意想不到的技术效果。
[0008]所述水稻根瘤菌Alt301具有如下形态和生理、生化特性:
[0009]a、菌体形态特性:水稻根瘤菌的细胞为革兰氏阴性菌，细胞短杆状，不形成芽孢，大小0.8?1.1ym xl.4?1.8μηι，具单侧生鞭毛。
[0010]b、菌落形态特性:菌落在YMA培养基平板上生长速度较快，菌落圆形，乳白色，半透明。28°C，生长72小时，菌落直径3?5mm。
[0011]c、生理生化特性:兼性厌氧，革兰氏阴性，不利用α-3-酮基乳糖，为非土壤农杆菌，能够与大豆、菜豆结瘤，但是比正对照的大豆根瘤菌结瘤时间晚约10天。菌株在改良LB液体培养基上生长产碱，使培养液的PH值由6.8升高到pH7.8以上。能以糊精、淀粉、吐温40、吐温80、N-乙酰基-D-葡萄糖胺、侧金盏花醇、L-阿拉伯糖、D-阿拉伯糖、D-纤维二糖、赤藻糖醇、D-果糖、L-果糖、龙胆二糖、α-D-葡萄糖、m-肌醇、α-D-乳糖、麦芽糖、D-甘露醇、D-蜜二糖、β-甲基-D-葡萄糖苷、阿洛酮糖、L-棉子糖、D-棉子糖、D-山梨醇、蔗糖、D-海藻糖、松三糖、甲基丙酮酸、单甲基琥珀酸、顺-乌头酸(丙烯三羧酸)、柠檬酸、甲酸、D-半乳糖醛酸、D-葡萄糖酸、D-葡萄醛酸、β-羟基丁酸、a-酮戊二酸、D，L-乳酸、丙二酸、奎尼酸、D-丙氨酸、溴丁二酸、琥珀酸、癸二酸、D-葡萄二酸、L-丙氨酸、L-丙氨酰甘氨酸、L-天冬酰胺酸、L-天门冬氨酸、L-谷氨酸、甘氨酰-L-天门冬氨酸、L-组氨酸、L-丝氨酸、L-焦谷氨酸、L-脯氨酸、羟基-L-脯氨酸、丙三醇、γ -氨基丁酸、尿刊酸、尿苷、6-磷酸葡萄糖、1-磷酸葡萄糖、L-苏氨酸为碳源的培养基上生长；URE(urease，脈酶)，VP(voges proskauer)，ONPG(o_nitrophenyl-0D-galactopyranosidase，β_半乳糖苷酶)，0X(cytochrome oxidase，细胞色素氧化酶)反应阳性。pH生长范围为pH5-pH8 ；对NaCl较敏感，在低于1.5 %NaCl浓度下可生长;菌株可在100μg.mL 1的氨节青霉素、5yg.mL 1新霉素培养基上生长。而对卡拉霉素、氯霉素、红霉素、庆大霉素的耐受性差、低浓度(50yg.mL—O的这几种抗生素就能抑制其生长。
[0012]优选地，所述菌株的16S rRNA序列如SEQ ID NO:1所示。
[0013]一种具有固氮产碱效果的接种剂，含有所述菌株。
[0014]优选地，所述菌株的发酵液浓度为3X19?5X 19CFU.mL—S按IL发酵液与2kg蛭石的比例混合，制备成菌数达1.5X 19?2.5 X 19CFUj1的接种剂。
[0015]—种促进农作物生长的方法，将所述菌株制成液体或固体菌剂或菌肥，将所述菌剂或菌肥用于种植农作物。
[0016]优选地，所述农作物为水稻、菜豆或大豆。
[0017]与现有技术相比，本发明有益效果在于:
[0018]本发明提供了一株来源于高杆野生稻植物组织的根瘤菌Alt301，所述菌株能够与豆科植物结瘤固氮，明显促进水稻等作物生长，发酵产碱改善作物根际微生态酸碱平衡，可广泛地应用于各种农作物及豆科作物种植。在经本发明的水稻根瘤菌处理后，显著促进水稻、大豆等作物的生长。
【附图说明】
[0019]图1为水稻根瘤菌Alt301的鞭毛染色结果图；标尺Ιμπι。
【具体实施方式】
[0020]下面结合说明书附图和具体实施例对本发明做进一步详细说明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
[0021]实施例1菌株的分离
[0022]本发明菌种的分离纯化方法如下:将采集的新鲜高杆野生稻样本用蒸馏水洗净，然后剪下根、茎、叶并分别置于已灭菌的三个培养皿中，用3%的双氧水(H2O2)浸泡4min(以除去根、茎、叶表面的腐烂物质)，无菌水洗涤一次，再用0.1%的升汞(HgCl2)浸泡5min，无菌水中振动洗涤5?7次，每次5?lOmin，并将最后一次洗涤液涂布于LB固体培养基上，以检测消毒是否彻底。将表面消毒完全的根、茎、叶用已灭菌手术刀切碎，分别接种到三支装有5ml YMA半固体培养基的试管中，胶塞密封后，置于28°C的人工培养箱内进行培养。整个操作均在无菌条件下完成。待长出菌体后，用接种环从半固体管中接至YMA固体培养基上，平板划线分离，28°C，湿度为85%条件下，进行厌氧及好氧培养。再挑取单菌落分别再涂平板，直至菌落的形状、颜色、质地、透明度一致。最后通过简单染色和镜检，进一步观察其形态，以长度均一、宽度一致、染色情况统一为菌株纯化标准。如图1所示，所述菌株单侧生鞭毛。
[0023]保存:将分离纯化后的菌株在分离培养基平板及斜面上培养2?5d后，收集平板上的菌体。部分保存于15 %灭菌甘油中(-20°C)和(-800C)。
[0024]实施例2鉴定及保藏
[0025]实施例1分离得到的一株水稻根瘤菌Alt301具有如下形态和生理、生化特性:
[0026]a、菌体形态特性:水稻根瘤菌的细胞为革兰氏阴性菌，细胞短杆状，不形成芽孢，大小0.8?1.1xl.4?1.8μηι，具单侧生鞭毛。
[0027]b、菌落形态特性:菌落在YMA培养基平板上生长速度较快，菌落圆形，乳白色，半透明。28°C，生长72小时，菌落直径3?5mm。
[0028]c、生理生化特性:兼性厌氧，革兰氏阴性，不利用α-3-酮基乳糖，为非土壤农杆菌，能够与大豆、菜豆结瘤，但是比正对照的大豆根瘤菌结瘤时间晚约10天。菌株在改良LB液体培养基上生长产碱，使培养液的PH值由6.8升高到pH7.8以上。能以糊精、淀粉、吐温40、吐温80、N-乙酰基-D-葡萄糖胺、侧金盏花醇、L-阿拉伯糖、D-阿拉伯糖、D-纤维二糖、赤藻糖醇、D-果糖、L-果糖、龙胆二糖、α-D-葡萄糖、m-肌醇、α-D-乳糖、麦芽糖、D-甘露醇、D-蜜二糖、β-甲基-D-葡萄糖苷、阿洛酮糖、L-棉子糖、D-棉子糖、D-山梨醇、蔗糖、D-海藻糖、松三糖、甲基丙酮酸、单甲基琥珀酸、顺-乌头酸(丙烯三羧酸)、柠檬酸、甲酸、D-半乳糖醛酸、D-葡萄糖酸、D-葡萄醛酸、β-羟基丁酸、a-酮戊二酸、D，L-乳酸、丙二酸、奎尼酸、D-丙氨酸、溴丁二酸、琥珀酸、癸二酸、D-葡萄二酸、L-丙氨酸、L-丙氨酰甘氨酸、L-天冬酰胺酸、L-天门冬氨酸、L-谷氨酸、甘氨酰-L-天门冬氨酸、L-组氨酸、L-丝氨酸、L-焦谷氨酸、L-脯氨酸、羟基-L-脯氨酸、丙三醇、γ -氨基丁酸、尿刊酸、尿苷、6-磷酸葡萄糖、1-磷酸葡萄糖、L-苏氨酸为碳源的培养基上生长；URE(urease，脈酶)，VP(voges proskauer)，ONPG(o_nitrophenyl-0D-galactopyranosidase，β_半乳糖苷酶)，0X(cytochrome oxidase，细胞色素氧化酶)反应阳性。pH生长范围为pH5-pH8 ；对NaCl较敏感，在低于1.5 %NaCl浓度下可生长;菌株可在100μg.mL 1的氨节青霉素、5yg.mL 1新霉素培养基上生长。而对卡拉霉素、氯霉素、红霉素、庆大霉素的耐受性差、低浓度(50yg.mL—O的这几种抗生素就能抑制其生长。
[0029]该菌株的16S rRNA序列如SEQ ID NO:1所示。[°03°] 本发明所述水稻根瘤菌(Rhizobium oryzae)分子分类地位的确定:采用细菌16SrRNA基因通用引物25f和1492r进行扩增，将PCR产物直接进行序列测定。将获得的DNA序列输入GenBank进行Blast比对，初步确定本发明的水稻根瘤菌(Rhizobium oryzae)菌株在分类学中的属、种的位置。结果发现本发明的水稻根瘤菌属于根瘤菌属(Rhizobium)，与大豆根瘤菌模式菌株和菜豆根瘤菌模式菌株的相似性低于97%，与水稻根瘤菌(Rhizobiumoryzae)模式菌株LMG24253lg似性为98.8%，但二者的序列不完全一致，有1.2%的差异，表明二者是不同的菌株。
[0031]结合上述的生理生化特性、16SrDNA序列分析及查阅文献，本发明的水稻根瘤菌(Rhizobium oryzae)归属于根瘤菌属(Rhizobium)。
[0032]本发明所述的水稻根瘤菌(Rhizobium oryzae)Alt301已于2016年3月11日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，菌种保藏号为GDMCC No: 60018，分类命名为:水稻根瘤菌(Rhizobium oryzae);保藏地址为广东省广州市先烈中路100号。
[0033]发明的菌种可作为接种剂以促进豆科植物、水稻等作物生长。如可将分离纯化得到的单菌落采用LB液体培养基于28°C培养48?72小时，菌数达3 X 19?5 X 19CFlhmL+1，用蛭石作载体。按IL发酵液与2kg蛭石的比例混合，制备成菌数达1.5 X 19?2.5 X 19CFU.g—1的菌剂。
[0034]实施例3大豆结瘤固氮
[0035]采用蛭石双层钵法进行水稻根瘤菌的大豆结瘤试验，用带有纱布条的塑料杯装满用少氮培养液浸润的蛭石，套在盛有无菌水的罐头瓶上，植株可通过纱布条均匀吸收水分保持蛭石的湿润度。蛭石钵经121°C灭菌一小时后，按每钵I粒播入已消毒催好芽的大豆苗，播种后第二天接种菌悬液(浓度为2.5 X lOtFU.mL—1)，每钵Iml。同时设接种无菌水的作为空白对照，试验和对照各5个重复。于28 °C，光照70001X (每天12小时)，日夜温差5?1 °C，培养30天左右，期间适当补充少氮培养液，可见大豆根瘤，。
[0036]少氮培养液成分:硝酸钙0.003%，硫酸钙0.046%，磷酸氢二钾0.0136%，氯化钾
0.0075% ,硫酸镁0.0046 %，柠檬酸铁0.0075% ,微量元素液Iml。微量元素液组成:H3BO32.86g,MnS04 1.81g,ZnS04 0.22g,CuSO4 0.8g,H2MoO4 0.02g,H20 1000ml。
[0037]实施例4菜豆结瘤固氮
[0038]采用20x200mm试管，加入10ml少氮培养液，沿试管壁放置长度为8cm的圆形滤纸筒，用棉塞塞紧试管口。经121°C灭菌30min后，按每试管I粒播入已消毒催芽好的菜豆苗，将豆苗置于滤纸和试管壁夹层间，利用滤纸吸营养液供菜豆苗生长，播种后第二天接种菌悬液(浓度为2.5 X 109CFU.mL—1)，每钵Iml。同时设接种无菌水的作为空白对照，试验和对照个5个重复。于28°C，光照70001x(每天12小时)，日夜温差5?10°C，培养30天左右，期间适当补充少氮培养液，可见菜豆根瘤。
[0039]实施例5发酵产碱试验
[0040]在IL如下发酵液中，含有酵母粉Ig，甘露醇5g，蛋白胨15g，KH2P040.02g，氯化钠
0.5g，豆饼2g，K2HPO4 0.02g，溶液初始pH值为6.6，室温下发酵3_7天，溶液pH值升为7.8-8.1之间。
[0041]实施例6促进水稻生长试验
[0042]将活化得到的单菌落采用YMA液体培养基于28°C培养72小时，与蛭石以1:2重量比混合(如I升培养液混合2公斤蛭石)制成水稻根瘤菌一蛭石接种剂。将水稻根瘤菌一蛭石接种剂与水稻种子1:1拌种后播种盆栽，3个重复，不接种的为对照。30天后与未接种的对照相比，盆栽中水稻干重平均增加12%，植株叶绿素平均增加9%，根长平均增长14%。
【主权项】
1.一株水稻根瘤菌(TiAizoW?oryzae) Alt301，其特征在于，所述菌株于2016年3月11日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，菌种保藏号为GDMCC No:60018。2.根据权利要求1所述的菌株，其特征在于，所述菌株的16SrDNA序列如SEQ ID NO: I所示。3.—种具有固氮产碱效果的接种剂，其特征在于，含有权利要求1所述菌株。4.根据权利要求3所述的接种剂，其特征在于，所述菌株的发酵液浓度为3X 19?5 X19CFU.mL—1，按I L发酵液与2kg蛭石的比例混合，制备成菌数达1.5 X 19?2.5 X 19CFU.g—1的接种剂。5.一种促进农作物生长的方法，其特征在于，将权利要求1所述菌株制成液体或固体菌剂或菌肥，将所述菌剂或菌肥用于种植农作物。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述农作物为水稻、菜豆或大豆。
【文档编号】C12N1/20GK105907665SQ201610249912
【公开日】2016年8月31日
【申请日】2016年4月20日
【发明人】彭桂香, 谭志远, 李永涛
【申请人】华南农业大学