使用植物无菌水培装置进行根瘤菌结瘤效果评价的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种生物技术领域，具体涉及一种植物无菌水培装置及采用该装置进行水培苜蓿的根瘤菌接菌及结瘤效果的评价方法。
【背景技术】
[0002]常见的植物无菌苗种植方法是配制琼脂或植物凝胶等固体培养基，将植物种子消毒后种于固体培养基上。在固体培养基上培养无菌植物苗的方法存在一些缺陷，如苜蓿等植物在固体培养基上存在根发育缓慢，幼苗生长速度较慢。另外长时间培养后由于培养基中营养元素消耗和有毒代谢产物的积累，无菌苗生长受到抑制甚至死亡。此时更换新的固体培养基是一种解决办法，通常需要将无菌苗从旧的固体培养基中拔出移入新的固体培养基中，此操作容易对植物根造成伤害且操作不方便。
[0003]根瘤菌通过豆科植物根毛、侧根杈口或其他部位侵入，刺激宿主皮层细胞分裂，形成根瘤，根瘤具有固氮功能，将空气中氮气还原成NH3,分泌至根瘤细胞内，并合成酰胺类或酰尿类化合物，输出根瘤，由根的传导组织运输至宿主地上部分供利用。宿主为根瘤菌提供良好的居住环境、碳源和能源以及其他必需营养，而根瘤菌则为宿主提供氮素营养，形成共生关系。
[0004]自然界土壤中存在多种根瘤菌，不同种类根瘤菌在不同豆科植物根部的结瘤固氮效果不同。为了筛选与苜蓿相匹配的最佳固氮根瘤菌株，通常在大田中进行接菌试验，但此法存在受土壤中本身存在的根瘤菌及其它自然因素影响的影响。另外，还有方法将苜蓿种于高温灭菌土壤中，然后接入根瘤菌。此方法存在土壤灭菌不彻底，观察根瘤时需要将苗从土壤中拔出清洗等操作，存在对根造成较大伤害且操作不方便等缺陷。因此，需要一种便于接菌处理，不受其它细菌、霉菌等因素影响，观察方便的根瘤菌接菌及结瘤效果评价的装置和方法。
【发明内容】
[0005]本发明要解决的技术问题是提供一种可以实现多种适合水培植物的快速简单无菌苗培养的植物无菌水培装置。本发明还提供了采用本发明所述的植物无菌水培装置进行水培苜蓿的根瘤菌接菌及结瘤效果的评价方法。
[0006]—种植物无菌水培装置，包括玻璃杯和固定在其内部的底部的至少一个滤网，在所述滤网内设置有培养基质，所述玻璃杯的顶部开口采用封口膜封口，在所述玻璃杯内设置有水培液，所述水培液的液面高度低于所述培养基质的上表面。
[0007]本发明所述的植物无菌水培装置，其中，所述玻璃杯的内部的底部中心位置设置有固定柱，所述滤网的底部设置有与所述固定柱相匹配的固定孔，所述固定孔穿过所述固定柱固定在所述玻璃杯的底部，所述滤网为不锈钢筒状滤网，所述滤网的顶部直径大于底部直径。
[0008]本发明所述的植物无菌水培装置，其中，所述滤网采用厚度为0.5mm、孔密度为10目的不锈钢滤网制作而成，所述滤网的底部外径为40mm，顶部外径为43mm，高度为50mm ;所述固定孔的直径为1mm0
[0009]本发明所述的植物无菌水培装置，其中，所述滤网为一个或多个，当所述滤网为多个时，多个所述滤网上下叠加到设计高度，最底部的所述滤网固定在所述玻璃杯的底部，在最上端的所述滤网中设置有所述培养基质，相邻两个所述滤网之间的叠加部分的高度为30mmo
[0010]本发明所述的植物无菌水培装置，其中，所述玻璃杯的侧壁的下部设置有换液口，所述换液口采用锥形橡胶塞密封；所述换液口为圆柱形管体，长度为5mm，内径为8mm、外径为10mm，其一端与所述玻璃杯的下部相连，另一端采用所述锥形橡胶塞密封，所述锥形橡胶塞的长度为10mm，一端直径为5mm，另一端直径为1mm ;所述培养基质为粒径3?5mm的石英砂。
[0011]本发明所述的植物无菌水培装置，其中，所述玻璃杯为圆桶形，侧壁和底部的厚度为3mm，内径为94mm，外径为100mm，高度为200?300mm，所述固定柱为圆柱形玻璃柱，直径为8mm，高度为30mm。
[0012]采用本发明所述的植物无菌水培装置进行水培苜蓿的根瘤菌接菌及结瘤效果的评价方法，包括如下步骤:
[0013](A)、准备工作:将装有培养基质的滤网与玻璃杯组合，用封口膜将玻璃杯上口密封，使用锥形橡胶塞将底部换液口密封，形成植物无菌水培装置，将其在121°C下湿热灭菌30min后放入超净台备用；配制水培液，121°C下湿热灭菌30min放入超净台备用；
[0014](B)、播种:筛选籽粒饱满的苜蓿种子，使用75%酒精消毒15min，然后用灭菌蒸馏水冲洗三遍，每遍lmin，将灭菌苜蓿种子分别在不同根瘤菌株液中浸泡2?5小时，打开所述植物无菌水培装置的封口膜，将I?2粒接菌后的苜蓿种子放入滤网中的培养基质的表面，沿所述玻璃杯的内侧壁加入经高温灭菌的所述水培液，液面高度低于所述培养基质的表面高度，然后用封口膜将所述玻璃杯上口密封，播种操作均在超净工作台内完成；将播种后的植物无菌水培装置置于人工气候箱中培养；
[0015](C)、更换水培液:每6?10天在超净台中更换一次所述水培液，更换所述水培液时将玻璃杯的底部锥形橡胶塞取出使所述水培液经换液口流出，待所述水培液全部流出后重新使用所述锥形橡胶塞密封换液口，打开所述封口膜后沿内侧壁加入新的所述水培液，每更换一次所述水培液，其液面高度比前一次更换时的水培液的高度降低5?10_ ;最终液面低于水培液液面30?50mm ；
[0016](D)、观察评价:将水培30天以上的苜蓿幼苗取出，并观察评价不同根瘤菌的结瘤效果；
[0017]其中，所述水培液为无氮MS水培液。
[0018]采用本发明所述的植物无菌水培装置进行水培苜蓿的根瘤菌接菌及结瘤效果的评价方法，包括如下步骤:
[0019](a)、准备工作:将装有培养基质的滤网与玻璃杯组合，配制Hogland水培液和无氮MS水培液；将所述Hogland水培液沿所述玻璃杯的内侧壁加入到所述玻璃杯内，液面高度低于培养基质表面高度，用封口膜将所述玻璃杯的上口密封，形成植物无菌水培装置，在121°C下湿热灭菌30min后放入超净台备用；
[0020](b)、打开所述植物无菌水培装置的所述封口膜，选取发芽5天生长健壮的无菌苜蓿幼苗，将无菌苜蓿幼苗放入所述滤网中的培养基质表面，然后用所述封口膜将所述玻璃杯口密封，上述操作均在超净工作台内完成；将移栽无菌苗的所述植物无菌水培装置置于人工气候箱中培养；
[0021](c)、每6?10天在超净台中更换一次水培液，更换Hogland水培液时将所述玻璃杯的底部锥形橡胶塞取出，使水培液经换液口流出，待Hogland水培液全部流出后重新使用所述锥形橡胶塞密封换液口，打开上部封口膜，沿所述玻璃杯的内侧壁加入新的Hogland水培液，每次更换新Hogland水培液的液面高度逐渐降低，最终液面高度低于所述培养基质3的表面高度30?50mm ；
[0022](d)、经无菌水培15天，苜蓿幼苗长出较多侧根，取2种苜蓿根瘤菌保存液0.1mL分别接种于1mL液体YEB培养基中，在摇床中200r/min，28°C振荡培养10?20小时，根瘤菌培养至浓度达到0D6。。= 0.5?0.8时备用，分别取0.2mL刚摇好的根瘤菌菌液加入苜蓿幼苗根部，将Hogland水培液更换为无氮MS水培液，每6?10天更换一次水培液，经根瘤菌接菌水培30天的苜蓿苗用于结瘤效果的观察评价，取出苜蓿根，记录根瘤数量、大小和颜色，评价不同根瘤菌株的结瘤效果。
[0023]本发明植物无菌水培装置及采用该装置进行水培苜蓿的根瘤菌接菌及结瘤效果的评价方法与现有技术不同之处在于:
[0024]本发明植物无菌水培装置可以通过高温灭菌处理后进行无菌水培；以不锈钢滤网盛放石英砂作为培养基质便于植物幼苗的固定和根的生长；杯体下部有换液孔，在长时间培养时便于水培液更换且不易造成污染；该水培系统可以对多种豆科植物进行快速高效的无菌水培及根瘤菌接菌及结瘤效果观察评价。
[0025]使用本发明植物无菌水培装置进行植物无菌水培的方法具有如下优点:
[0026]选择灭菌处理的植物种子或无菌植物幼苗于本装置中进行培养，与常规开放式水培方法相比，采用