一种博罗中慢生根瘤菌及其应用
【技术领域】：
[0001] 本发明属于微生物领域，具体涉及一种增城中慢生根瘤菌及其应用。
【背景技术】：
[0002] 空气中约有78%的氮气，而仅有部分微生物能够固定游离态的氮，然后转化成化 合态氮才能够被动植物吸收利用，也就是所说的生物固氮。为了提高经济效益，化学氮肥在 农林牧业生产中得到了广泛应用。但是化肥的应用造成了大量的能源消耗、水土污染，甚至 破坏了生态平衡。近年来，环境问题已是全球关注的重点，国家也提出了可持续发展战略方 针，为了改善生存条件、维持生态平衡，生物固氮这种无污染且高效的固氮方式日益受到重 视。林业在保持水土、防风固沙以及改善土壤等方面都有重要作用，林业树种的栽培也引起 了广泛关注。但是树种的生长周期较长，立地条件复杂，施肥较困难，所以研宄者希望通过 生物固氮来为其提供所需氮源，提高林木生长速率，增加经济效益。
[0003] 随着环保意识的深入人心，生物制剂与化工产品相比具有无污和经济效益较高等 特点，因此广受青睐。一些树种的种植栽培很大程度上依赖根瘤菌提供的氮源，所以研宄和 开发微生物肥料是林业发展的必要举措。
[0004] 相思树种（Acacia)是我国除台湾相思是原产的之外，其他树种均是国外引进。它 具有生长快、适应性强、耐干旱、耐贫瘠、可以与根瘤菌形成固氮共生体等特点，可用于改良 土壤和木材制造等。目前在广西、福建、广东和海南等地进行了规模化种植，创造了良好的 经济效益，同时在生态环境建设中发挥了重要作用。选择合适的根瘤菌制作菌肥是提高林 业生产、创造经济价值和改善生态环境的重要环节。
[0005] 微生物肥料制作的关键在于菌种。目前限制我国微生物肥料行业发展的瓶颈是优 良菌株的选育问题。林业生产迫切需求固氮能力强、抗逆性强的微生物肥料生产用菌株。
【发明内容】
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[0006] 本发明的目的是提供一种能够与黑木相思、网脉相思、南洋楹和银合欢形成有效 固氮根瘤的新菌种一博罗中慢生根瘤菌（Mesorhizobium boluoense) RITF741，该菌于2014 年10月17日保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC)，地址：中国武汉武汉大学，保藏编 号为 CCTCC NO :M 2014491。
[0007] 本发明是从黑木相思根瘤中分离筛选出的博罗中慢生根瘤菌（Mesorhizobium boluoense)RITF741，该菌株能与黑木相思（Acacia melanoxylon)、网脉相思（Acacia aneura)、南洋楹（Albizia falcataria)和银合欢（Leucaena leucocephala)等共生结瘤， 具有较强的抗逆性，在固氮微生物菌剂和生物有机肥生产中具有广阔的应用前景。
[0008]本发明的 Mesorhizobium boluoense RITF741 于 2014 年 10 月 17 日保藏于中国典 型培养物保藏中心（CCTCC)，地址：中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC N0:M 2014491。
【附图说明】：
[0009] 图1是博罗中慢生根瘤菌的16S rRNA与参比菌株的系统发育树。
[0010]图2是采用最大似然法构建的博罗中慢生根瘤菌的持家基因recA，glnll和atpD 的序列系统发育树。
[0011] 图3是博罗中慢生根瘤菌RITF741的氧化酶还原反应。
[0012] 图 4 是 API 50CH 测定博罗中慢生根瘤菌（Mesorhizobium boluoense) RITF741 的 生理生化反应。
[0013] 图5是黑木相思幼苗接种博罗中慢生根瘤菌RITF741的结瘤情况。
【具体实施方式】：
[0014] 以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
[0015] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0016] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0017] YMA 培养基：甘露醇 10. 0g，谷氨酸钠 0? 5g，K2HP040. 5g，MgS04 ? 7H20 0? 2g， NaCl0.0 1g，酵母粉0. 5g，琼脂粉17g，蒸馏水1000mL，pH 7. 0。灭菌备用。
[0018] Jensen' s 无氮营养液：K2HP040 . 05g，NaCl 0? 05g，MgS04 ? 7H20 0? 05g， CaHP040. 25g，FeCl30 . 05g，lmL 微量元素溶液（H3B032. 86g/L，MnS04 ? H20 2. 08g/L， ZnS04 ? 7H20 0? 022g/L，CuS04 ? 7H20 0? 08g/L，NaMo040. llg/L)，蒸馏水 1000mL。灭菌备用。
[0019] 实施例1:博罗中慢生根瘤菌RITF741、RITF1220、RITF 909的分离与鉴定
[0020] 一、根瘤菌的分离
[0021] 菌株分离自广东省惠州市和增城市黑木相思的根瘤。根瘤用自来水冲洗干净表面 泥沙，于95%酒精浸泡30秒后，放入0. 1 %升汞溶液中表面消毒5分钟，无菌水冲洗8次。 将经表面消毒后的根瘤放在两片无菌载玻片之间，用力挤压使根瘤破碎，用无菌接种针沾 取根瘤液在YMA平板上划线，28~30°C恒温培养箱培养至菌落出现，挑取典型菌落纯化及 鉴定。由此纯化得到根瘤菌RITF741、RITF1220、RITF 909。
[0022] 二、根瘤菌的鉴定
[0023] 从以下几个方面鉴定根瘤菌RITF741、RITF1220、RITF 909:
[0024] 1、形态学鉴定
[0025] 将处于对数生长期，且菌落大小稳定，上述步骤一分离并纯化的根瘤菌RITF741、 RITF1220、RITF 909进行单菌落状态描述，主要包括菌落的大小、颜色、透明度、湿润度、菌 落表面状态、菌落边缘状态。
[0026] 对于处于对数生长期的根瘤菌，经涂片染色后采用光学显微镜观察菌体的形态。
[0027] 结果表明，上述步骤一分离纯化的3株根瘤菌RITF741、RITF1220、RITF 909为革 兰氏阴性杆菌，菌落圆形凸起，乳白色，半透明，表面光滑，边缘整齐。
[0028] 2、生理生化特征分析
[0029] API 50CH和API 20NE用来分析代表根瘤菌RITF741的生理生化特征。如图3和 4〇
[0030] 所述根瘤菌的生理生化特征测定结果如下：
[0031] 根瘤菌RITF741、RITF1220、RITF 909的菌落黏稠，边缘整齐。菌株能利用甘氨酸、 D-阿拉伯糖、L-阿拉伯糖、D-核糖、D-木糖、L-木糖、D-侧金盏花醇1、D-半乳糖、D-葡萄 糖、D-果糖、D-甘露糖、L-鼠李糖、肌醇、山梨醇、熊果苷、七叶灵、D-纤维二糖、D-麦芽糖、 D-乳糖、D-密二糖、D-蔗糖、D-海藻糖、D-棉籽糖、木糖醇、D-松二糖、D-来苏糖、D-岩藻 糖、L-岩藻糖和D-阿拉伯醇。菌株在赤藻糖醇、L-山梨糖、甲基-a D-吡喃葡萄糖苷、水杨 苷、D-龙胆二糖、D-塔格糖、L-阿拉伯糖、5酮葡萄糖酸钾和苹果酸中生长缓慢。但是菌株 不能利用甲基_ 0 D吡喃木糖苷、卫矛醇、甲基-a D-吡喃甘露糖苷、N-乙酰葡萄糖胺、苦杏 仁苷、菊粉、D-松三糖、淀粉、糖原、葡萄糖酸盐、2酮葡萄糖酸钾、葵酸、己二酸、柠檬酸和苯 乙酸。氧化酶还原反应、硝酸盐还原反应和半乳糖苷酶反应为阳性，吲哚反应、葡糖糖酸化 反应、精氨酸水解反应、脲酶反应和明胶蛋白酶水解反应均为阴性。
[0032] 3、16S rRNA序列测定及系统发育分析
[0033] 常规方法培养根瘤菌RITF741、RITF1220、RITF 909,提取菌株的总DNA作为基因 扩增模板，以细菌 16S rRNA 通用引物，27F :5' 一 AGAGTTTGATCCTGGCTCAG - 3'，1492R :5' 一 TACGGTTACCTTGTTACGACTT - 3'进行 PCR 反应。反应程序为：95°C变性 lmin、56. 7°C lmin、 72°C延伸1.5min，共30个循环。DNA测序由英潍捷基（上海）生物技术公司完成，序列拼 接及相似性分析使用DNAMAN软件完成，序列比对通过美国国家生物技术信息中心（NCBI) 数据库在线完成。
[0034] 根瘤菌RITF741的16S rRNA基因序列如SEQ ID NO. 1所示，用邻接法建树系统发 育树（图1)，显示了 RITF741和其他中慢生根瘤菌种群之间的亲属关系。根瘤菌RITF741、 RITF1220、RITF 909菌株的3个编码蛋白质的持家基因recA、glnII、atpD系统发育树见图 2。根瘤菌RITF741、RITF1220、RITF 909菌株与其它中慢生根瘤菌之间的16S rRNA和3个 蛋白质编码基因的相似性范围见表1。
[0035] 表1博罗中慢生根瘤菌种内及与其它代表菌株间的基因的相似性
【主权项】
1.博罗中慢生根瘤菌（Mesorhizobiumboluoense)RITF741，其保藏编号为CCTCCNO:M2014491。 2?权利要求1所述的博罗中慢生根瘤菌（Mesorhizobiumboluoense)RITF741在制备 固氮微生物菌剂或生物有机肥中的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种博罗中慢生根瘤菌及其应用。博罗中慢生根瘤菌(Mesorhizobium boluoense)RITF741，该菌于2014年10月17日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M 2014491。本发明是从黑木相思根瘤中分离筛选出的博罗中慢生根瘤菌(Mesorhizobium boluoense)RITF741，该菌株能与黑木相思(Acacia melanoxylon)、网脉相思(Acacia aneura)、南洋楹(Albizia falcataria)和银合欢(Leucaena leucocephala)等共生结瘤，具有较强的抗逆性，在固氮微生物菌剂和生物有机肥生产中具有广阔的应用前景。CCTCC NO：M201449120141017
【IPC分类】C12N1-20, C05G3-00, C12R1-01
【公开号】CN104762226
【申请号】CN201410768012
【发明人】陆俊锟, 朱亚杰, 康丽华
【申请人】中国林业科学研究院热带林业研究所
【公开日】2015年7月8日
【申请日】2014年12月12日