大豆内生菌及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及微生物技术领域。
【背景技术】
[0002] 大豆是一年生草本豆科植物，其种子也称为大豆，是世界上最重要的豆类。大豆不 单指黄豆，它还包含黑豆和青豆。黄豆是重要的油料、食用和饲料作物，黄豆中的蛋白质能 提供赖氨酸、亮氨酸、苏氨酸等许多人体必需氨基酸。此外，黄豆中还含有大量不饱和脂肪 酸、磷脂、纤维素、维生素以及丰富的钙、磷、镁、钾等无机盐和铜、铁、锌、碘、钼等微量元素。 黄豆具有抗氧化、抗衰老、抗癌、防止血管硬化、促进骨骼发育和降糖等多种功能。黑豆为大 豆的黑色种子，可药食两用，与黄豆最大的不同是黑色外皮含有大量类黄酮化合物花色素 类色素。此外，黑豆含有丰富的蛋白质、脂肪、维生素、尼克酸、胡萝卜素、微量元素和粗纤 维，其中蛋白质含量达48%以上，居豆类之首，高于肉类、鸡蛋和牛奶，素有"植物蛋白之王" 的美誉。黑豆具有软化血管、滋润皮肤、延缓衰老等功效。
[0003] 大豆中除了含有以上提到的各种"非生物"类营养物质外，像其他植物一样还含有 各种内生菌。植物内生菌是指那些在其生活史的一定阶段或全部阶段生活于健康植物的组 织或器官内部，而不使宿主植物表现出明显感染症状的微生物，以真菌和细菌为主。目前从 黄豆、豌豆、菜豆、矮四季豆和苜蓿等豆科植物不同组织器官中分离内生菌已有报道，但尚 未见从黑豆中分离内生菌的报道。以往人们从豆科植物中分离内生菌的主要目的是将所分 离的有益菌株应用于农业领域。如植物内生菌可增加植物株高和干重、增强植株生长势、提 高种子发芽率和幼苗存活率、增加植物分蘖生长和花序形成等。植物内生菌可以通过生物 固氮和产生促进植物生长的生长素、赤霉素以及细胞分裂素等，直接促进植物生长；内生菌 还可以通过诱导寄主植物产生植物激素，通过增强植物对N、P等营养元素以及其他矿物 质的吸收来促进植物生长(周怡等，大豆科学，2009, 28 (3) : 502-506)。此外，以往报道的植 物内生菌还具有增强宿主抗逆性和抗病虫害能力。植物抗逆性的增强作用主要表现在生物 胁迫（如抵抗病虫害侵袭，阻抑昆虫和食草动物的采食等）和非生物胁迫（如抗高温、抗干 旱、抗冷害、抗盐碱等）两方面，主要机制是内生菌通过影响宿主植物物质代谢并产生生理 活性物质来改变植株的生理特性，提高植物的抗逆性，刺激植物生长；植物内生菌可以与病 原菌竞争营养和空间或直接产生拮抗物质而抑制病原菌生长；或通过诱导植物产生酚类、 醌类物质在细胞间隙积累，从而构成病原菌进入植物体内或在植物体内运转的化学屏障。
[0004] 依照国际通行的判定标准，判断一个城市或国家是否进入"老龄化社会"的标志是 60岁以上的人口所占比重是否已经达到或超过总人口数的10%。最新数据显示，中国现有 的老龄人口已超过1. 6亿而且每年在以近800万的速度增加。当前我国已经进入老龄化社 会，老年人口逐年在迅速增加，随之而来的是冠心病、糖尿病、骨质疏松、神经退行性疾病等 老年性疾病明显增多，给国家的经济、文化和医疗等带来了巨大压力和挑战。这些老年性疾 病虽由多因素引起和多基因参与，而机体衰老则是共同因素。衰老是一个机体不可避免的 生理过程，是人类有史以来一直研究而未能够解决的重大问题，因此，有目的寻找延缓衰老 方法，以有效降低因机体衰老而引发的老年性疾病，是当前亟待解决的重大问题。
[0005] 秀丽隐杆线虫（CaeflorAsAi/i e^e^a/76·)属线形动物门，自然状态下，秀丽隐 杆线虫是一种生活在土壤中的以细菌和腐殖质为食，能够感知气味、光线、温度的通身透 明生物，也是唯一一个身体中所有细胞能被依次盘点并各归其类的生物。秀丽隐杆线虫 生活史短，在20° C下的平均生活史为3. 5天左右，整个生命周期约为3周左右。秀丽隐 杆线虫是一种具有多细胞的真核生物，它也要经历复杂的细胞分裂和增殖过程才能最终 形成与高等生物相似较复杂的组织和器官系统，如皮肤、肌肉、消化、神经、生殖等，这使得 秀丽隐杆线虫具有与高等生物体相似的一些细胞、分子结构及寿命控制通路。因此，通过 秀丽隐杆线虫这种模式生物所获得的生物学知识可以直接应用于高等生物甚至包括人类 (Barbieri et al. American Journal of Physiology and Endocrinology Metabolism， 2003, 285:E1064_1071)。Shtonda和Avery在研究秀丽隐杆线虫饮食行为时发现，线虫 具有自行判断周围环境中的细菌是否有毒并对所食用的细菌进行选择的能力（Journal of Experimental Biology，2006, 209:89-102)。此外，有研究证实，当以人体致病菌屎肠 球菌（Sifri et al·，Infectious Immunology，2002,70:5647-5650)和金黄色葡萄球菌 (Sifri et al·，Infectious Immunology，2006, 74:1091-1096)喂食秀刚隐杆线虫时，线 虫或被感染或被杀死；相反，当以益生菌乳酸菌为食物喂食秀丽隐杆线虫时，秀丽隐杆线虫 平均寿命明显得到延长，同时还能使线虫抵御病原菌沙门氏菌能力得到增强（Applied and Environmental Microbiology，2007, 73:6404-6409)。此外，Gusarov 等以枯草芽抱杆菌喂 食秀丽隐杆线虫时，发现秀丽隐杆线虫平均寿命通过胰岛素信号转导途径得到显著延长， 并发现秀丽隐杆线虫寿命延长是由于枯草芽孢杆菌能通过一氧化氮合酶产生一氧化氮气 体（Cell，2013,152:818-830)。一氧化氮是人类已知的"最迷人的分子"。在20世纪90年 代，对一氧化氮的研究成为一种风潮，世界各地的科学家对一氧化氮的兴趣愈加浓厚，研究 也达到了一个新的高度。1992年，一氧化氮作为学术界的新发现，被著名的《科学》杂志评 选为"年度明星分子"。1998年，美国的研究学者罗伯特?弗奇戈特、路易斯·伊格纳罗及弗 里德?默拉德被授予诺贝尔生理医学奖。他们发现一氧化氮是心血管系统的信号分子，证实 了一氧化氮作为信号分子在心血管系统中的作用，发现并论证了硝酸甘油及相关药物如何 通过释放一氧化氮使身体健康，并对身体产生积极的作用。一氧化氮是重要的信号分子，它 控制血压，调节血流量，使血液到达组织，为机体供应氧气和营养，事实上几乎所有的组织 都离不开一氧化氮。越来越多的研究表明，一氧化氮在治疗心血管疾病和许多其他重大的 慢性疾病中具有重要的作用。一氧化氮的主要生理功能包括对心血管系统、免疫系统、循环 系统、中枢神经系统和泌尿生殖系统的作用（《一氧化氮让你远尚心脑血管病》，原著Louis J. Ignarro，主译：吴寿岭，杨刚虹；北京大学医学出版社出版，2007年)。
[0006] 目前从黄豆不同部位分离的内生细菌主要分属芽孢杆菌属、假单胞 菌属（/isei/i/c敵was)、肠杆菌属（办ieroAac ier)、伯克氏菌属（iferMoJoferia)、克雷伯氏 杆菌属黄单胞菌属（yTawthomonas)等（Jitendra Dalall and Nikhilesh Kulkarnil，British Microbiology Research Journal，2013,3(l) :96_105)，人们从大豆 中分离筛选内生菌的目的也只是为了农业生产需要。除了大豆中所含"非生物"类营养物 质外，目前尚未见从大豆内生菌中筛选对人或其他动物起有益作用的内生菌的报道。
【发明内容】
[0007] 本发明要解决的技术问题是提供大豆内生菌及其应用，六种大豆内生菌分别来自 于黑豆芽、黄豆种子和黄豆芽，且全部属于芽孢杆菌属；这六种大豆内生菌都能显著延长秀 丽隐杆线虫的平均寿命，并提高秀丽隐杆线虫的抗热能力，并且均可在秀丽隐杆线虫体内 定植；对人体抗衰老及延长寿命也有一定作用，可以在保健食品或药品中得到应用。
[0008] 为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是： 一种大豆内生菌，其特征在于为黑豆芽内生细菌，该黑豆芽内生细菌为地衣芽孢杆菌 EnB_bsys4 CfeciUiAS 属于芽抱杆菌属，保藏号为 CGMCC No. 10524。
[0009] -种大豆芽内生菌，其特征在于为黑豆芽内生细菌，该黑豆芽内生细菌为解淀粉 芽抱杆菌EnB_bsys5 a野ioJit/i/e/aciefts1)，属于芽抱杆菌属，保藏号为CGMCC No.10525。
[0010] -种大豆内生菌，其特征在于为黄豆种子内生细菌，该黄豆种子内生细菌为蜡样 芽抱杆菌EnB_sy3 CfeciWiA? cereiAs1 )，属于芽抱杆菌属，保藏号为CGMCC No. 10687。 [0011] 一种大豆内生菌，其特征在于为黄豆种子内生细菌，该黄豆种子内生细菌为地 衣芽孢杆菌EnB -sy8 (ifeciWiAs ，属于芽孢杆菌属，保藏号为CGMCC No.10688。
[0012] -种大豆内生菌，其特征在于为黄豆芽内生细菌，该黄豆芽内生细菌为短小芽孢 杆