专利名称：新型酵母菌及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种新型巴斯德酵母菌(Saccharomyces pastorianus) N0.54及其生物分子的应用，特别是涉及调节血糖、肥胖或其相关症状的应用。
背景技术：
胰岛分泌的胰岛素是调降血液中葡萄糖浓度最重要的激素，其与肌肉细胞膜或脂肪细胞膜上的胰岛素受体结合后，首先会使这些细胞发生一连串的下游信息反应(包括活化PI3、PKC、Akt及P38MAPK等酶)，进而刺激带有葡萄糖输送蛋白4(GLUT4)的囊泡往细胞膜移动，从而增加细胞膜上葡萄糖输送 蛋白4的数量，使得这些细胞吸收葡萄糖的速度提升，达到调降血糖的效果。当胰岛无法分泌足量的胰岛素或是胰岛素无法使肌肉细胞、脂肪细胞发生足量的下游信息反应，造成血糖长期维持在126毫克/分升以上时，身体的各个组织器官将会受到严重的损害，包括视网膜病变、肾脏病、自主神经系统功能丧失、动脉粥状硬化等，更严重时甚至会发生昏迷、死亡等情形。因此，临床上特别定义空腹血糖高于126毫克/分升以上的病理状况为糖尿病。糖尿病有两种常见的形式:1型及II型糖尿病。其中，I型糖尿病是一种免疫系统对胰岛进行攻击破坏的自体免疫疾病，使得患者的胰岛无法分泌足量的胰岛素，一般需要靠长期注射胰岛素以控制体内血糖浓度。II型糖尿病的患者一般仍具有正常分泌胰岛素的能力，但因为肌肉细胞及脂肪细胞有严重的胰岛素抗性(Insulin resistance),因此,胰岛素无法使这些细胞发生足量的下游信息反应，导致血糖无法降到正常值。其中，肥胖是导致所述胰岛素抗性及II型糖尿病的重要因素，这归因于脂肪细胞所分泌的细胞因子(cytokines)及趋化因子(chemokines)是引发胰岛素抗性及II型糖尿病的重要原因，而肥胖者体内的脂肪细胞显然比一般人多出许多，因此肥胖会大幅度地提升发生胰岛素抗性及II型糖尿病的风险。统计数据显示,50%的肥胖者将来会患有II型糖尿病,且至少有70%以上的II型糖尿病患者为过重或肥胖者，若这些过重的糖尿病患者能够减重的话，其胰岛素抗性情形将可以恢复到正常或接近正常值。目前II型糖尿病最佳的治疗方式是饮食控制，它有助于维持血糖及正常体重。若原本的体重过重，则减重是最有效的治疗方式，可使体内的胰岛素发挥更佳的降血糖功能。若减重及饮食都无法控制糖尿病时，则必须遵照医师的嘱咐定期服用口服糖尿病药物或注射胰岛素。需特别说明的是，目前具备降血糖功效的药物仍限于胰岛素，缺乏替代性的药物，其他口服糖尿病药物仅能辅助性地增加胰岛素的分泌、改善胰岛素的功能、抑制糖类分解或延缓单糖类在胃肠道的吸收等。因此，当口服糖尿病药物配合高剂量胰岛素仍无法控制血糖时(例如具有严重胰岛素抗性的II型糖尿病患者)，将没有其他替代性的药物可以调降血糖，仅能靠减重使胰岛素抗性降低而逐渐恢复胰岛素降血糖的功效，但减重对大部分的患者而言是困难的。此外，长期使用高剂量的胰岛素也有其缺点，当长期使用高剂量胰岛素却仍无法使血糖回复正常时(例如具有严重胰岛素抗性的II型糖尿病患者)，会进一步造成胰岛逐渐丧失分泌胰岛素能力的不利后果，此时即便成功地透过减重而降低病患胰岛素抗性的问题，由于病患已恶化成无法自行分泌胰岛素的患者，将永远失去自主调控血糖的能力。因此，有必要寻找一种具有调降血糖功效的替代性物质，可取代胰岛素而达到调降血糖的效果，使I型及II型糖尿病患者有多种具备降血糖功效的物质可供选择。此外，有必要寻找一种物质，其能引发细胞发生一连串类似于胰岛素的下游反应，而解决严重胰岛素抗性个体的血糖不受胰岛素调节的问题。再者，有必要寻找一种能有效达到减肥效果的物质，使II型糖尿病患者的胰岛素抗性情形降低，让II型糖尿病患者回复到可以有效地、自主地调降血糖的状态。
发明内容
鉴于糖尿病患者对于新型降血糖物质的需要，本发明的目的在于提供一种酵母菌菌株或其衍生的活性物质，其具有调降血糖的功效，可取代胰岛素作为调降I型及II型糖尿病患者血糖的治疗物质。本发明的另一个目的 在于提供一种酵母菌菌株或其衍生的活性物质，其能引发细胞发生类似于胰岛素的下游反应，而适用于具有胰岛素抗性的个体作为调降血糖的物质。本发明的另一个目的在于提供一种酵母菌菌株或其衍生的活性物质，其使得具有胰岛素抗性的个体的血糖值下降，避免个体长期处于高血糖的状况下而发生永远无法分泌胰岛素的不利后果。本发明的再一个目的在于提供一种酵母菌菌株，具有调节肥胖或其相关症状的功效，利于II型糖尿病患者改善其胰岛素抗性情形。本发明提供一种分离的酵母菌株，巴斯德酵母菌N0.54 (Saccharomycespastorianus N0.54)，其保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期2011年12月31日，保藏编号 CCTCC M 2011496。根据上述发明，其特征在于具有调节血糖的功效。根据上述发明，其特征在于藉由所述酵母菌株产生的序列为SEQ IDNO:1的蛋白质达到调节血糖的功效；或者，其特征在于藉由所述酵母菌株产生的序列为SEQ ID N0:1的蛋白质调控目标个体细胞膜上的葡萄糖输送蛋白4(GLUT4)的含量或胰岛素受体的含量，达到调节血糖的功效。本发明提供一种衍生酵母菌株，其为上述发明所述酵母菌株的衍生突变体，其特征在于所述衍生酵母菌株具有调节血糖的功效。根据上述发明，其为藉由所述衍生酵母菌株产生的序列为SEQ ID NO:1的蛋白质达到调节血糖的功效；或者，其特征在于藉由所述衍生酵母菌株产生的序列为SEQ ID NO:I的蛋白质调控目标个体细胞膜上的葡萄糖输送蛋白4(GLUT4)的含量或胰岛素受体的含量，达到调节血糖的功效。根据上述发明，其特征在于具有调节肥胖或其相关症状的功效。本发明提供一种菌体提取物组合物，其包含上述发明所述酵母菌株的菌体提取物或所述酵母菌株的衍生突变体的菌体提取物中的至少任一种，其特征在于，具有调节血糖或调节肥胖或其相关症状的功效中的至少任一种。本发明提供一种纯化菌体提取物组合物，其为由上述发明所述菌体提取物组合物，再进一步纯化而制得，其特征在于具有调节血糖或调节肥胖或其相关症状的功效中的至少任一种。本发明提供一种纯化或人工合成的蛋白质，其氨基酸序列为SEQ ID NO:1。根据上述发明，其为具有调节血糖的功效的蛋白质；或者，其调控目标个体细胞膜上的葡萄糖输送蛋白4(GLUT4)的含量或胰岛素受体的含量，以达到调节血糖的功效。本发明提供一种重组蛋白质，其氨基酸序列为SEQ ID NO:1中的一个或多个氨基酸经删除、添加或取代后所衍生的序列，其特征在于所述重组蛋白质为具有调节血糖的功效的蛋白质。根据上述发明，其调控目标个体细胞膜上的葡萄糖输送蛋白4(GLUT4)的含量或胰岛素受体的含量，以达到调节血糖的功效。本发明提供一种经分离或人工合成的核酸分子，其编码包含氨基酸序列为SEQ IDNO: I的蛋白质。根据上述发明，其中所述氣基酸序列为SEQ ID NO:1的蛋白质具有调节血糖的功效；或者，其中所述氨基酸序列 为SEQ ID NO:1的蛋白质调控目标个体细胞膜上的葡萄糖输送蛋白4(GLUT4)的含量或胰岛素受体的含量，以达到调节血糖的功效。本发明提供一种重组核酸分子，其为将上述发明所述的经分离或人工合成的核酸分子进行一个或多个核苷酸的取代、删除或添加后所衍生的衍生核酸分子，其特征在于所述重组核酸分子编码包含具有调节血糖的功效的蛋白质。根据上述发明，其中所述具有调节血糖的功效的蛋白质调控目标个体细胞膜上的葡萄糖输送蛋白4(GLUT4)的含量或胰岛素受体的含量，达到所述调节血糖的功效。
图1:菌体提取物经柱分离后，各段收集液对分化的小鼠3T3-L1脂肪细胞吸收葡萄糖的影响的柱形图。图2:菌体提取物经柱分离后，其中的DWl收集液的蛋白质凝胶电泳分析图。图3:分化的小鼠3T3-L1脂肪细胞经所述分子量为54kDa的蛋白质处理后，细胞上各种信息分子变化量的柱形图。图4:分化的小鼠3T3-L1脂肪细胞经所述54kDa的蛋白质处理后，细胞膜上葡萄糖输送蛋白4(GLUT4)变化量的蛋白质印记分析图。
具体实施例方式鉴于现有技术的局限性及缺陷，本发明提供了一种酵母菌菌株，即巴斯德酵母菌(Saccharomyces pastorianus)N0.54的酵母菌菌株或其衍生突变体(其保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCCM2011496，保藏日期为2011.12.31，保藏中心地址为中国武汉市武昌珞珈山)，其具有调节血糖的功效，且能有效地调节II型糖尿病个体的血糖。此夕卜，所述菌株也具有调节肥胖或其相关症状的功效。
以下提供了利用本发明的实施例的详细说明书、本发明的技术及特点，然而，所述实施例并非用以限定本发明，本领域技术人员在不脱离本发明的精神和范围内，当可作各种改动与修饰。实施例1:制备具调节血糖、肥胖或其相关症状功效的酵母菌菌株及其菌体提取
将Saccharomyces pastorianus N0.54接种至麦芽提取物液体培养基(maltextract broth,MEB,购自Difico Labotories)中，于25°C培养48小时。以同样方式进行第二次活化后，将活化的Saccharomyces pastorianus N0.54接种于所述麦芽提取物液体培养基，菌液浓度为105CFU/mL。20°C、150rpm振荡培养4天。离心，以二次去离子水将下层菌体清洗三次后，收集该菌体。将离心后的湿菌体置于三角锥型瓶中，以0.1N NH4OH于30°C、IOOrpm条件下提取酵母菌活性物质2小 时，再经冷冻干燥，所得的粉末即为酵母菌菌体提取物。实施例2:制备STZ诱导的II型糖尿病大鼠将雄性Sprague-Dawley(SD)品系的大鼠分只饲养于不锈钢笼中，动物房的温度维持在23 ± I °C，湿度则维持在40-60 %。每日的光照周期为12小时，饲料与蒸馏水自由摄食。大鼠饲养至平均重量为300g时，以烟碱(nicotinamide, 230mg/kg体重)和链脲佐菌素(STZ，65mg/kg体重，柠檬酸盐缓冲液中，pH 4.6)将其诱导成II型糖尿病大鼠，一周后进行口服葡萄糖耐量试验(Oral Glucose Tolerance Test, 0GTT),以评估是否产生II型糖尿病症状。经确认产生糖尿病症状后的大鼠即为STZ诱导的II型糖尿病大鼠。实施例3:制备分化的小鼠3T3-L1脂肪细胞以补充了 10%胎牛血清的高葡萄糖DMEM(购自Gibco，含10 μ g/mL胰岛素、I μ MDEX及0.5mM IBMX)培养小鼠3T3-L1前脂肪细胞株(细胞株编号为BCRC60159，购自财团法人食品工业发展研究所生物资源保存及菌种中心，新竹，台湾)8天，使其分化成小鼠3T3-L1脂肪细胞。利用Oil-Red-O染色剂(配方为0.3% Oil-Red-O，60%异丙醇)在室温下避光染色30分钟，以确认该细胞是否已成为分化的小鼠3T3-L1脂肪细胞。实施例4:菌体提取物对II型糖尿病大鼠空腹血■糖及胰岛素浓度的影响请参见下列表1，其为STZ诱导的II型糖尿病大鼠经喂食酵母菌菌体提取物6周后的空腹血糖及胰岛素浓度测试结果。其中，血糖的测试方式为:将IOyL血浆与葡萄糖酶促试剂盒(Cat.N0.GL 2623，Randox)中的试液混合，于37°C作用5分钟后，以分光光度计测量其在500nm的吸光值。比对不同浓度的标准品的标准曲线后，即可换算出血浆中的葡萄糖浓度。此外，胰岛素浓度的测试方式为:取25 μ L血浆，以大鼠胰岛素ELISA试剂盒(Mercodia AB, Sweden)进行实验，并利用 ELISA 读数仪(μ Quant, BIO-TEK, U.S.A)读取其在450nm的吸光值。比对不同浓度的标准品的标准曲线后，即可换算出血浆中的胰岛素浓度。糖尿病对照组的空腹血糖为220.65±20.88mg/dL,显着高于正常对照组空腹状态的血糖192.73±18.56mg/dL(p < 0.05)。经喂食酵母菌菌体提取物6周的糖尿病大鼠(即酵母菌体提取物组)，其空腹血糖为194.47±21.02mg/dL,显着低于糖尿病对照组的空腹血糖(P < 0.05)，且与正常对照组无显着差异，表明酵母菌菌体提取物有助于调降糖尿病个体的血糖达正常值。在大鼠空腹血浆的胰岛素浓度方面，糖尿病对照组的空腹胰岛素浓度为2.10±0.72mg/L,显着高于正常对照组的空腹胰岛素浓度1.44±0.65mg/L(p
<0.05)。经喂食酵母菌菌体提取物6周后的糖尿病大鼠，其空腹胰岛素浓为1.28±0.55mg/L,显着降低其胰岛素浓度约达39% (P < 0.05),并与正常对照组无显着差异。以上结果显示，经喂食酵母菌菌体提取物6周能显着调降糖尿病大鼠的高血糖及高胰岛素达正常值。表I
权利要求
1.一种经分离的酵母菌株，巴斯德酵母菌(Saccharomyces pastorianus)N0.54,其保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC M 2011496。
2.如权利要求1所述的酵母菌株，其特征在于具有调节血糖的功效。
3.如权利要求2所述的酵母菌株，其特征在于藉由所述酵母菌株产生的序列为SEQIDN0:1的蛋白质达到调节血糖的功效；或者，其特征在于藉由所述酵母菌株产生的序列为SEQ ID NO:1的蛋白质调控目标个体细胞膜上的葡萄糖输送蛋白4(GLUT4)的含量或胰岛素受体的含量，达到调节血糖的功效。
4.一种衍生酵母菌株，其为权利要求2所述酵母菌株的衍生突变体，其特征在于所述衍生酵母菌株具有调节血糖的功效。
5.如权利要求4所述的衍生酵母菌株，其系藉由所述衍生酵母菌株产生的序列为SEQID N0:1的蛋白质达到调节血糖的功效；或者，其特征在于藉由所述衍生酵母菌株产生的序列为SEQ ID NO:1的蛋白质调控目标个体细胞膜上的葡萄糖输送蛋白4(GLUT4)的含量或胰岛素受体的含量，达到调节血糖的功效。
6.如权利要求1所述的酵母菌株或其衍生酵母菌株，其特征在于具有调节肥胖或其相关症状的功效。
7.一种菌体提取物组合物，其包含权利要求1所述的酵母菌株的菌体提取物或所述酵母菌株的衍生突变体的菌体提取物中的至少任一种，其特征在于，具有调节血糖或调节肥胖或其相关症状的功效中的至少任一种。
8.—种纯化菌体提取物组合物，其由权利要求7所述的菌体提取物组合物，再进一步纯化而制得，其特征在于具有调节血糖或调节肥胖或其相关症状的功效中的至少任一种。
9.一种纯 化或人工合成的蛋白质，其氨基酸序列为SEQ ID N0:1。
10.如权利要求9所述的纯化或人工合成的蛋白质，其为具有调节血糖的功效的蛋白质；或者，其调控目标个体细胞膜上的葡萄糖输送蛋白4(GLUT4)的含量或胰岛素受体的含量，以达到调节血糖的功效。
11.一种重组蛋白质，其氨基酸序列为SEQ ID NO:1中的一个或多个氨基酸经删除、添加或取代后所衍生的序列，其特征在于所述重组蛋白质为具有调节血糖的功效的蛋白质。
12.如权利要求11所述的重组蛋白质，其调控目标个体细胞膜上的葡萄糖输送蛋白4(GLUT4)的含量或胰岛素受体的含量，以达到调节血糖的功效。
13.—种经分离或人工合成的核酸分子，其编码包含氨基酸序列为SEQ IDNO:1的蛋白质。
14.如权利要求13所述的经分离或人工合成的核酸分子，其中所述氨基酸序列为SEQID NO:1的蛋白质具有调节血糖的功效；或者,其中所述氣基酸序列为SEQ ID N0:1的蛋白质调控目标个体细胞膜上的葡萄糖输送蛋白4(GLUT4)的含量或胰岛素受体的含量，以达到调节血糖的功效。
15.一种重组核酸分子，其为将权利要求13所述的经分离或人工合成的核酸分子进行一个或多个核苷酸的取代、删除或添加后所衍生的衍生核酸分子，其特征在于所述重组核酸分子编码包含具有调节血糖的功效的蛋白质。
16.如权利要求15所述的重组核酸分子，其中所述具有调节血糖的功效的蛋白质调控目标个体细胞膜上的葡萄糖输送蛋白4(GLUT4)的含量或胰岛素受体的含量，达到所述调节血糖 的功效。
全文摘要
本发明提供一种分离的巴斯德酵母菌No.54，所述巴斯德酵母菌具有调节血糖、肥胖或其相关症状的功效，有助于调控I型糖尿病的高血糖或同时调控II型糖尿病的高血糖及肥胖等两项高危险因数。
文档编号A61P3/10GK103215194SQ20121002215
公开日2013年7月24日 申请日期2012年1月20日 优先权日2012年1月20日
发明者蔡国珍, 吴建辉 申请人:蔡国珍