生防酵母菌及其干粉制剂与应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生防菌剂制备技术领域，尤其涉及一种生防酵母菌(保藏号CCTCC NO:M2015287，保藏单位:中国典型培养物保藏中心，地址:中国武汉武汉大学，保藏日期:2015年5月11日)及其干粉制剂与应用。
【背景技术】
[0002]目前，青霉菌在采后严重危害苹果，造成很大的产量和品质损失，是苹果生产上的重要病害之一，其病原菌主要为青霉病菌expansum)0长期以来，该病害的采后抗病主要依赖化学杀菌剂，随着苯并咪唑类化学药剂的长期大量使用，青霉菌已经对该类杀菌剂产生了抗药性，使得防效下降。病原菌的潜伏侵染会造成苹果在采后的贮藏中的大量损失，采后青霉病的防治也需要化学药剂，随着人们对环境保护和食品安全越来越重视，研发更加安全、环保的苹果青霉病采后防治新技术，如生物防治，显得尤为迫切和重要。
【发明内容】
[0003]针对目前苹果在采后因青霉病造成大量损失的情况，本发明提供一种生防酵母菌及其干粉制剂与应用，解决了现有的苹果青霉病防治中大量使用化学杀菌剂提高了病菌的抗药性、不利于环境保护和食品安全性的问题，同时，本发明制备操作简单，成本较低，能有效的增强水果的抗病能力，适宜推广应用。
[0004]本发明所提供的生防酵母菌，是从油桃中提取分离得到，保藏名称:Hanseniaspora uvarum Youtao-1，保藏号 CCTCC NO:M2015287o
[0005]本发明所提供的生防酵母菌的干粉制剂，采用下述方法步骤制备:
(1)划线培养:用接种环沾取分离自油桃的生防酵母菌，在YPD固体培养基上划线，置于 25-30 °C 培养 20-24 h ；
(2)种子培养:取步骤(I)培养的酵母菌株接种于种子培养基中，于25-30°C培养10-20 h ;所述种子培养基采用YPD液体培养基；
(3)摇瓶种子培养:取1000μ I步骤(2)所得种子液接入500 ml种子摇瓶培养基中，25-30 °C下，180-220 r/min摇床培养20-24 h ;所述种子摇瓶培养基配方为:(NH4)2S04 6g/L、葡萄糖 35 g/L、K2HPO4.3H20 3 g/L、KH2PO4 0.5 g/L、酵母粉 11 g/L、MnSO4 0.1 g/L、KCl 0.1 g/L、FeSO4.7H20 0.18 g/L、MgSO4.7H20 0.1 g/L, 121 °(:高温灭菌 20 min 制得；
(4)发酵培养:将2500ml步骤(3)所得摇瓶种子加入到50 L发酵培养基中，搅拌速度为180-220 r/min，在25-30 °C下培养30-40 h ;所述发酵培养基配方为:(NH4) 2S04 6 g/L、葡萄糖 20 g/L、K2HPO4.3H20 3 g/L、KH2PO4 0.5 g/L、酵母粉 11 g/L、MnSO4 0.1 g/L、KCl0.1 g/L、FeSO4.7H20 0.18 g/L、MgSO4.7H20 0.1 g/L, 121 °C 灭菌 20 min ；
(5)干粉制剂:将发酵液取出，在3-60C, 3800-4200 r/min下离心8-12 min，去掉上清保留酵母菌体，将酵母菌体与保护剂搅拌混合均匀，制粒，真空干燥。
[0006]上述所述生防酵母菌的干粉制剂的制备步骤中，所述YPD固体培养基配方:酵母粉10 g/L、鱼粉蛋白胨20 g/L、葡萄糖20 g/L，琼脂粉20 g/L，在121 °C的温度下灭菌20 min ;所述YH)液体培养基配方:酵母粉10 g/L、鱼粉蛋白胨20 g/L、葡萄糖20 g/L,121 °0高温灭菌20 min。
[0007]上述所述生防酵母菌的干粉制剂的制备步骤中，步骤(2)和步骤(3)还包括在无菌台取样镜检的步骤，以防止发生污染。
[0008]上述所述生防酵母菌的干粉制剂的制备步骤中，步骤(4 )发酵过程中每小时测定糖含量，通过控制补料的进样量来保持发酵液的葡萄糖含量在2-4 g/100 ml之间，所述补料配方为:葡萄糖 500 g/L、酵母粉 10 g/L、MgSO4.7H20 0.1 g/L。
[0009]上述所述生防酵母菌的干粉制剂的制备步骤中，步骤(5)所述保护剂为蔗糖和糊精，其中糊精为酵母菌体质量的2-4倍，蔗糖为酵母菌体质量的0.2-0.5倍。
[0010]本发明所提供的上述所述生防酵母菌的干粉制剂的应用，其是取干粉制剂，溶于水制成生防酵母菌悬浮液，将采后的水果置于酵母溶液中浸泡，让生防酵母菌在水果表面和伤口处迅速消耗掉营养并占领生存空间。
[0011]上述所述应用中，优选方案为:取干粉制剂，溶于水制成浓度为80-120 g/L的生防酵母菌悬浮液，将采后的水果置于酵母溶液中浸泡20-40 min。
[0012]上述所述应用中，所述水果可以为苹果、梨、猕猴桃、芒果或油桃等。
[0013]本发明所述从油桃分离提取生防酵母菌的方法可以为:1)取新鲜油桃，置于灭菌处理的烧杯中，加入无菌水至油桃完全浸泡，将烧杯封口，置于28 V，100 r/min摇床培养2 h ;2)取出烧杯，在超净台中操作，取出油桃，使用浸泡油桃的无菌水做梯度(10X，100X)稀释，取原液和稀释液各100 μ L分别均匀涂抹在YPD+培养基上置于25 °(:恒温培养箱中培养36 h ;3)肉眼观察培养基上菌落的形态，选取类似酵母的在显微镜下观察其细胞形态，筛选出类似酵母的菌落进行纯化培养；4)将筛选出来的菌株接种到YPD+培养基上，置于25°C恒温培养箱中培养24 h，筛选单菌落。所述YPD+培养基配方:YH)培养基灭菌后温度降到65 0C以下，按照终浓度50 μ g/ml加入卡那霉素，制得YPD+培养基。
[0014]本发明的有益效果是:其一，相比较于现有的化学农药，本发明提供了一种更加安全环保的生物防治菌剂。其二，本发明所制备的酵母干粉菌剂具有显著的生防效果，能有效的增强水果的抗病能力，可用于苹果、梨、猕猴桃、芒果或油桃等水果的抗病。其三，本发明所制备的酵母干粉菌剂具有携带方便，使用简单的特点。其四，本发明所提供的制备方法具有制备、操作简单，制备成本较低，适宜规模化推广应用。
【附图说明】
[0015]图1是本发明的生防酵母菌对于苹果青霉病的抗病效果图；
图2是本发明的生防酵母菌对于苹果青霉病的抗病效果数据图；
图3是本发明的生防酵母菌对于梨青霉病的抗病效果数据图。
【具体实施方式】
[0016]下述实施例是对于本
【发明内容】
的进一步说明以作为对本发明技术内容的阐释，但本发明的实质内容并不仅限于下述实施例所述，本领域的普通技术人员可以且应当知晓任何基于本发明实质精神的简单变化或替换均应属于本发明所要求的保护范围。
[0017]实施例1
本发明所提供的生防酵母菌，是从油桃中提取得到，保藏名称\Hanseniaspora uvarumYoutao-1，保藏号CCTCC NO:M2015287o将该生防酵母菌制备成干粉制剂的方法步骤如下:第一步，酵母的菌种活化(划线培养)
选取分离自水果表面的生防酵母菌，用接种环沾取少量菌体，在YPD固体培养基上划线，置于28 °C中培养24 h，以达到活化菌株的目的。
[0018]第二步，发酵罐大规模生产酵母
种子培养:将酵母菌株活化后，用接种环沾取单菌落上的酵母菌于50 ml种子培养基中，28 °C培养14 h，无菌台中取样显微镜镜检，防止发生污染。种子培养基采用YPD液体培养基(YPD液体培养基为YPD固体培养基不添加琼脂)；
摇瓶种子培养:取1000 μ I种子液接入500 ml种子摇瓶培养基中，28 °C下，200 r/min摇床培养24 h，无菌台中随机取样镜检，防止发生污染；
发酵培养:2500 ml摇瓶种子加入到50 L发酵培养基中，搅拌速度为200 r/min，发酵过程中每小时测定葡萄糖含量，通过控制补料的进样量来保持发酵液的葡萄糖含量保持在2-4 g/100 ml之间，28 °C培养36 h，每3 h取样一次，测定菌液中的菌量，观测酵母菌的生长情况。
[0019]YH)培养基配方:酵母粉10 g/L、鱼粉蛋白胨20 g/L、葡萄糖20 g/L，琼脂粉20g/L (液体培养基不添加琼脂粉即可)，121 °C，灭菌20 min ；
种子摇瓶培养基配方:(NH4)2SO4 6 g/L、葡萄糖 35 g/L、K2HPO4.3