专利名称：一种微囊化酵母菌及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种可在肠道内生长代谢并分泌基因工程药物的微囊化酵母菌。
本发明还涉及上述微囊化酵母菌在治疗疾病中的应用。
背景技术：
随着分子生物学技术的发展，蛋白、多肽类基因工程药物的大规模生产成为现实，并大量应用于临床[文献1Pennisi E.Breakthrough of theyear.Genomics comes of age.Science，2000，290(5500)2220-21]、[文献2Peltonen L，McKusick VA.McKusick.Genomics and medicine.Dissectinghuman disease in the postgenomic era.Science，2001，291(5507)1224-1229]。但目前基因工程药物的使用尚存在一些问题，如基因工程药物多从基因工程菌(大肠杆菌或酵母菌)的代谢产物中提取，药物制备的分离纯化工艺复杂，成本高；稳定性差、体内半衰期短等特点决定了基因工程药物目前的用药途径仍多为注射给药。因此，降低药物生产成本及开发安全、有效的给药途径是目前国际有关基因工程药物的主要研究方向。
针对上述问题，加拿大Chang TMS[文献3Chang Thomas M.S.，PrakashSatya.Microencapsulated genetically engineered microorganisms for clinicalapplication.United States Patent 6,217,859，April 17，2001]、[文献4S.Prakash，T.M.S.Chang.Areificial cells microencapsulated geneticallyengineered E.coli DH5 cells for the lowering of plasma creatinine in vitro andin vivo.Art.Cells.Blood Subs.and Immob.Biotech.，2000，28(5)397-408]等将代谢尿素的脲激酶基因转入大肠杆菌，并将其包埋在海藻酸钠-聚赖氨酸-海藻酸钠(alginate-polylysine-alginate，APA)微胶囊中，直接口服微胶囊达到治疗尿毒症目的。本专利申请人[文献5付颖丽，雄鹰，刘袖洞，于炜婷，马小军。壳聚糖/海藻酸钠微胶囊固定化大肠杆菌的研究。生物工程学报，2002，18(2)239-241]研究表明海藻酸钠-壳聚糖-海藻酸钠(alginate-chitosan-alginate，ACA)微胶囊包埋的大肠杆菌口服后可通过肠道回收。
发明内容
本发明在文献5的基础上提出一种在人体肠道内生产基因工程药物的方法，以提高基因工程药物的生物利用度，同时可省略传统药物制备过程中的分离纯化工艺，从而降低药物生产成本。
本发明提出将包埋有酵母菌的ACA微胶囊直接口服作为肠道细胞微反应器，使酵母菌在微胶囊的保护下，在肠道内存活、代谢生产基因工程药物。与Chang TMS等研究的APA微囊化大肠杆菌相比，本发明有其明显的优势。第一，在菌种的选择上，本发明提出用基因工程酵母菌，其相对大肠杆菌的优点在于①酵母菌是真核细胞，表达的目标产物可以分泌到细胞外；②酵母菌表达的目标产物能进行转录后的修饰加工，形成有生物活性的蛋白；③酵母菌作为基因工程菌的宿主细胞可以表达长基因片段；④酵母菌安全无毒，不致病，不存在毒理问题，已被广泛用于食品业和酿酒业，且具有酒香味，故作为口服剂型易于被患者接受。第二，在材料选择上，本发明提出的微胶囊成膜材料是壳聚糖，壳聚糖与聚赖氨酸相比，其优势在于①壳聚糖材料来自天然，具有很好的生物相容性；②壳聚糖具有良好的小肠黏附性能，所制备的ACA微胶囊可以更长时间的在体内发挥作用；③本发明用的壳聚糖的制备方法是本实验室发明，而聚赖氨酸为美国SIGMA公司独家产品，④本发明用的壳聚糖成本仅为￥1元/克，而聚赖氨酸为$345元/克。因此，本发明将包埋有基因工程酵母菌的ACA微胶囊直接口服，作为肠道内细胞微反应器，使微胶囊内的酵母细胞在肠道内生长代谢，分泌目标产物，达到治疗目的。
本发明采用海藻酸钠-壳聚糖-海藻酸钠(alginate-chitosan-alginate，ACA)复合材料制备微胶囊并包埋有基因工程酵母菌。该微囊化的酵母菌经直接口服，作为肠道内细胞微反应器，使微胶囊内的酵母细胞在肠道内生长代谢，分泌目标产物达到治疗目的。本发明采用的酵母菌为基因工程酵母菌，包括各种组成型或诱导型分泌表达药用生物活性蛋白的基因工程酵母菌。
其制备方法是在原有海藻酸盐固定化细胞的基础上，通过大功率微胶囊制备仪，使均匀混合有酵母细胞的海藻酸钠溶液在高压静电场作用下，形成粒径在100-1000μm可控、分布均匀的液滴，与钙溶液固化形成微胶珠，并在微胶珠表面通过离子络合反应瞬间形成一层壳聚糖微胶囊膜，再用柠檬酸钠溶液置换出海藻酸钙凝胶中的钙，使微胶囊内液化成液体环境，得到包埋有酵母菌的海藻酸钠-壳聚糖-海藻酸钠微胶囊(ACA微胶囊)，该微胶囊中酵母菌含量为106-1010个/ml。ACA微胶囊膜本身对分子量在1-15万Da的蛋白药物有明显控释作用，增强了药物的生物利用度。由于本发明的微囊化酵母菌是在生理条件下制备，pH6.0-7.0，20-37℃，1个大气压，无震荡及剪切，制备过程中对酵母菌活性没有损害。
关于制备过程不是本发明所要讨论的重点，而且微囊化的制备技术已有公开，本领域的技术人员很容易理解和掌握，所以本发明对此不作详细描述。有关制备过程请参见图1。
本发明提供的包埋酵母菌的ACA微胶囊在胃肠道内无破损，特异性粘附小肠黏膜12小时以上。
本发明提供的微囊化酵母菌在肠道内生长代谢并分泌基因工程药物，可用于治疗尿毒症、肝功衰竭、苯丙酮酸尿症、内分泌性疾病、神经变性疾病、遗传性疾病及恶性肿瘤等疾病。
本发明提供的包埋有酵母菌的ACA微胶囊在肠道内生产基因工程药物的原理请参见图2。
图1为本发明微胶囊制备示意图。
图2为本发明包埋有酵母菌的ACA微胶囊在肠道内生产基因工程药物的原理。
图3a为本发明ACA微胶囊口服后2小时在小鼠胃肠黏膜的粘附。
图3b为本发明ACA微胶囊口服后12小时在小鼠胃肠黏膜的粘附。
具体实施例方式
例1在生理条件下制备出含有酵母菌的ACA微胶囊，制备过程中酵母菌存活率100％，酵母菌含量108个/ml微胶囊，微胶囊粒径在100-1000μm精确可控。
例2含有指示染料的ACA微胶囊经小鼠口服灌注后，2小时后处死小鼠解剖胃壁，可见完整的微胶囊，12小时后处死小鼠解剖肠壁，在小肠黏膜上找到完整微胶囊(见图3)。
例3含有牛血红蛋白的ACA微胶囊在模拟胃液血红蛋白显示零级释放，在模拟肠液中呈现一级释放曲线。
例4将含有酪氨酸羟化酶基因的基因工程酵母菌包埋在ACA微胶囊中给帕金森模型鼠口服后，酵母菌在小鼠肠道内以内源性酪氨酸为底物，在酪氨酸羟化酶的作用下，生成多巴胺，经肠道吸收入血，可以纠正帕金森模型鼠的震颤行为。
权利要求
1.一种微囊化酵母菌，为包埋有酵母菌的海藻酸钠-壳聚糖-海藻酸钠微胶囊，其粒径为100-1000μm，表面为一层壳聚糖微胶囊膜，该微胶囊内为液体环境，其中酵母菌含量为106-1010个/ml。
2.如权利要求1所述的微囊化酵母菌，其特征在于，所述酵母菌为基因工程酵母菌，包括各种组成型或诱导型分泌表达药用生物活性蛋白的基因工程酵母菌。
3.如权利要求1所述的微囊化酵母菌，其特征在于，所述酵母菌由微胶囊的保护，在肠道内继续存活，生长代谢分泌蛋白多肽类药物。
4.如权利要求1所述的微囊化酵母菌，其特征在于，包埋有酵母菌的微胶囊在胃肠道内无破损，特异粘附在小肠黏膜12小时以上，
5.如权利要求1所述的微囊化酵母菌，其特征在于，所述微胶囊膜对分子量在1-15万Da的蛋白药物有控释作用。
6.如上述任一项权利要求所述的微囊化酵母菌在治疗尿毒症、肝功衰竭、苯丙酮酸尿症、内分泌性疾病、神经变性疾病、遗传性疾病及恶性肿瘤的应用。
全文摘要
一种微囊化酵母菌，为包埋有基因工程酵母菌的海藻酸钠－壳聚糖－海藻酸钠微胶囊，其粒径为100－1000μm，表面为一层壳聚糖微胶囊膜，该微胶囊内为液体环境，其中酵母菌含量为10
文档编号A61K9/50GK1589776SQ0315572
公开日2005年3月9日 申请日期2003年9月1日 优先权日2003年9月1日
发明者马小军, 于炜婷, 薛伟明 申请人:中国科学院大连化学物理研究所