专利名称：锁掷酵母菌株及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及微生物及微生物发酵领域的一种酵母菌及其应用，尤其涉及一种锁掷 酵母菌株及其在类胡萝卜素生产工艺中的应用。
背景技术：
类胡萝卜素是一类在植物、动物和微生物中广泛存在的脂溶性黄色-红色色素， 结构为C4tl的聚异戊二烯结构，其中共轭双键的不同可引起颜色的变化。类胡萝卜素主要分 为胡萝卜素类和胡萝卜醇类(叶黄素类)，而胡萝卜素类又包括α-胡萝卜素、胡萝卜 素、Y -胡萝卜素、番茄红素和红酵母烯(Torulene)；胡萝卜醇类(叶黄素类)则包括玉 米黄素、隐黄素、叶黄素、辣椒红素、桅子黄。β-胡萝卜素是所有类胡萝卜素中具有最高维生素A活性的一种。它可以有效地 保护细胞中的各种生物大分子不受自由基的损伤，从而维持细胞正常的生命代谢，防止衰 老和癌变。美国等已把β-胡萝卜素作为药品重点用于VA和癌症与细血管病的防治。作 为食品添加剂，类胡萝卜素也已被FAO和WTO认定为A类营养色素，并被西方发达国家广泛 用作食品着色剂兼营养增补剂及保健食品功能因子。天然β -胡萝卜素的主要来源有两种一种是从植物和盐藻中提取；另一种则是 利用产胡萝卜素或其前体物质的微生物进行发酵生产。直接从植物中提取天然胡 萝卜素的方法易受原料含量、气候、产地和运输等条件的限制，难以大量生产，比如美国、澳 大利亚和以色列等国家利用高盐、少雨的近海培养盐藻提取天然胡萝卜素，也受地域 和技术限制，不符合我国国情。对于利用微生物技术生产天然胡萝卜素的工艺，国内外 主要看好“三孢布拉霉”(Blakeslea)和“红酵母”(Iihodotorula)。采用三孢布拉霉两性菌 株发酵生产β-胡萝卜素的工艺具有生物量高、产胡萝卜素能力强等优点，适宜实现工 业化，尤其是近年来，通过对发酵过程的不断改进，其发酵产率不断提高，已处于产业化开 发研究阶段，产品已投放市场。但是，由于三孢布拉霉是接合生殖，导致其性状较易衰退，并 且还存在发酵技术工艺复杂、发酵周期长、成本高等缺点。采用红酵母发酵生产胡萝卜 素具有营养要求简单粗放、发酵周期短、生殖方式简单、营养条件要求低和可高密度培养等 优点，但目前的发酵水平尚不如三孢布拉霉，仍未能进行产业化应用。
发明内容
本发明的目的之一在于提出一种锁掷酵母菌株，其可应用于生产类胡萝卜素，且 产率高，从而克服现有技术中的不足。为实现上述发明目的，本发明采用了如下技术方案一种锁掷酵母菌株 Sporidiobolus pararoseus JD-2CCTCC M 2010326，该菌株已 于2010年12月3日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏号是CCTCC M 2010326。本发明的另一目的在于应用上述锁掷酵母菌株生产类胡萝卜素，其工艺包括如下 步骤
(1)对锁掷酵母菌株Sporidiobolus pararoseus JD-2CCTCC M 20103 进行菌种
活化培养；(2)采用步骤(1)所得活化菌种在pH 5-9的条件中发酵培养；(3)对步骤(1)和/或步骤( 所得菌液进行提取操作，获得类胡萝卜素提取物。优选的，步骤(1)或步骤O)中，采用葡萄糖作为最佳碳源，其最适浓度为40g/L。优选的，步骤(1)或步骤O)中，采用玉米浆作为富集胡萝卜素的最佳氮源， 其最适浓度20g/L ；而采用酵母膏作为富集红酵母烯的最佳氮源，其最适浓度20g/L。优选的，步骤(1)具体为将菌株从保藏斜面接到活化斜面培养基上，在pH 5-9、 25-28°C的条件下培养30-4 以上，其后接入液体种子培养基中，在pH5_9、温度为25_28°C 的条件下通风培养16h以上。优选的，所述活化斜面培养基包含如下组分葡萄糖20g/L、蛋白胨lg/L和酵母膏 lg/L，其 pH5-9 ；所述液体种子培养基包括如组分葡萄糖40g/L、玉米浆或酵母膏20g/L、 (MM)2SO4 5g/L、KH2PO4 lg/L 禾口 MgSO4 · 7H20 0. 5g/L，其 pH5_9。优选的，在发酵培养过程中，前期菌体生长阶段溶氧控制在20-30%饱和度，后期 溶氧控制在0-5%以富集β-胡萝卜素或溶氧控制在30-40%以富集红酵母烯。优选的，步骤( 的过程具体为将步骤(1)和/或( 所得菌液进行离心处理获 得菌体，而后采用高压低酸法破碎菌体细胞，然后加入体积比为4 1的酒精与正己烷的混 合液，室温振荡浸提0. 5h以上，得到类胡萝卜素粗提液。进一步的，在前述发酵培养过程中，最佳培养条件是温度^°C，pH6. 0。与现有技术相比，本发明的有益效果在于该锁掷酵母菌株 Sporidioboluspararoseus JD-2生产类胡萝卜素的产率较高,一般可达到500-700 μ g/g， 工艺条件如温度、PH等范围广，并可以通过控制不同的发酵条件选择性富集所需的类胡萝
卜素，且生产的类胡萝卜素属纯天然产品，不含人工色素或其他化学添加剂，可广泛的应用 于食品工业、化妆品工业、制药工业等各领域中。
图1是本发明锁掷酵母JD-2的电镜照片；图2A是本发明的较佳实施例中应用锁掷酵母JD-2所生产类胡萝卜素(富集 β-胡萝卜素)的高效液相色谱图；图2Β是本发明的较佳实施例中应用锁掷酵母JD-2所生产类胡萝卜素(富集红酵 母烯)的高效液相色谱图；图2Α和图2Β中，峰Α19、Β18代表红酵母红素(564)；峰A2tl、Bm为红酵母烯(534)； A24, B24 ^ β-胡萝卜素(536)。
具体实施例方式针对现有类胡萝卜素生产工艺，尤其是以酵母生产类胡萝卜素工艺的不足，本案 发明人提出一种此前从未见诸报道的锁掷酵母Sporidiobolus pararoseusJD-2,并将之应 用于类胡萝卜素的生产工艺。
该锁掷酵母菌株Sporidiobolus pararoseus JD-2是从无锡市惠山林地土壤中经 筛选、分离得到。该菌株优先生长在YPD培养基表面，在4 40°C培养温度及pH4. O 9. O范 围下生长，在YPD培养基上，菌落呈圆形、橙红色，表面光滑、质地均勻、边缘整齐、易挑 起。在电镜下观察，菌体呈长椭圆形，细胞大小0 5)Χθ 3)μπι，单边出芽。同化 葡萄糖、麦芽糖、甘露糖、蔗糖、甘油、半乳糖、木糖、酒精，不同化乳糖、乳酸。为鉴定该菌 对其进行以ITS序列分析为依据的分子分类学研究，根据序列的相似性比较，结果表明与 锁掷酵母(Sporidioboluspararoseus)CBS484达100%的相似性，将其命名为锁掷酵母 (Sporidioboluspararoseus) JD-2。该锁掷酵母菌株JD-2的菌学特性如下表1所示。表1锁掷酵母菌株JD-2的生理生化特性
权利要求
1.一种锁掷酵母菌株 Sporidiobolus pararoseus JD-2CCTCC M 2010326。
2.如权利要求1 所述锁掷酵母菌株 Sporidiobolus pararoseus JD-2CCTCC M2010326 在类胡萝卜素生产工艺中的应用。
3.一种类胡萝卜素的生产工艺，其特征在于，所述工艺包括如下步骤(1)对锁掷酵母菌株Sporidioboluspararoseus JD-2CCTCC M 20103 进行菌种活化 培养；(2)采用步骤(1)所得活化菌种在pH5-9的条件下发酵培养；(3)对步骤(1)和/或步骤( 所得菌液进行提取操作，获得类胡萝卜素提取物。
4.根据权利要求3所述的类胡萝卜素的生产工艺，其特征在于，步骤(1)或步骤(2) 中，采用葡萄糖作为最佳碳源，其最适浓度为40g/L。
5.根据权利要求3所述的类胡萝卜素的生产工艺，其特征在于，步骤(1)或步骤(2) 中，采用玉米浆作为富集胡萝卜素的最佳氮源，其最适浓度20g/L ；而采用酵母膏作为 富集红酵母烯的最佳氮源，其最适浓度20g/L。
6.根据权利要求3所述的类胡萝卜素的生产工艺，其特征在于，步骤(1)具体为将菌 株从保藏斜面接到活化斜面培养基上，在PH 5-9、2548°C的条件下培养30-4 ，其后接入 液体种子培养基中，在PH 5-9、温度为2548°C的条件下通风培养16h以上。
7.根据权利要求6所述的类胡萝卜素的生产工艺，其特征在于所述活化斜面培养基包含如下组分葡萄糖20g/L、蛋白胨lg/L和酵母膏lg/L，其 pH5-9 ；所述液体种子培养基包括如下组分葡萄糖40g/L、玉米浆或酵母膏20g/L、(MM)2SO4 5g/L、KH2PO4 lg/L 和 MgSO4 · 7H20 0. 5g/L,其 pH5_9。
8.根据权利要求3所述的类胡萝卜素的生产工艺，其特征在于在发酵培养过程中，前 期菌体生长阶段溶氧控制在20-30 %相对饱和度，后期溶氧控制在0-5 %相对饱和度以富 集β -胡萝卜素或溶氧控制在30-40%相对饱和度以富集红酵母烯。
9.根据权利要求3所述的类胡萝卜素的生产工艺，其特征在于步骤(3)的过程具体 为将步骤(1)和/或( 所得菌液进行离心处理获得菌体，而后采用高压低酸法破碎菌体 细胞，然后加入体积比为4 1的酒精与正己烷的混合液，室温振荡浸提0. 以上，得到类 胡萝卜素粗提液。
10.根据权利要求3所述的类胡萝卜素的生产工艺，其特征在于在发酵培养过程中， 最佳培养条件是温度，PH6. O。
全文摘要
本发明涉及一种锁掷酵母(又称锁掷孢酵母)菌株及其应用。该菌株为锁掷酵母菌株Sporidiobolus pararoseus JD-2CCTCC M 2010326。利用该锁掷酵母菌株JD-2生产类胡萝卜素的工艺包括如下步骤(1)对前述锁掷酵母菌株进行菌种活化培养；(2)采用步骤(1)所得活化菌种在pH 5-9的条件中发酵培养；(3)对步骤(1)和/或(2)所得菌液进行提取操作，获得类胡萝卜素提取物。本发明的酵母菌株生产类胡萝卜素的产率较高，一般可达到500-700μg/g，工艺条件如温度、pH值等范围广，并可以通过控制不同的发酵条件选择性富集所需的类胡萝卜素，且生产的类胡萝卜素属纯天然产品，不含人工色素或其他化学添加剂，可广泛应用于食品工业、化妆品工业和制药工业等领域中。
文档编号C12P23/00GK102115716SQ201010576329
公开日2011年7月6日 申请日期2010年12月7日 优先权日2010年12月7日
发明者张伟国, 钱和, 韩梅 申请人:江南大学