用于生产基于酵母的疫苗的方法

用于生产基于酵母的疫苗的方法
【专利摘要】本发明提供了在中性pH水平培养酵母的方法。在中性pH条件下培养的酵母呈现出可用于生物学目的如研发疫苗、预防剂和治疗剂的期望特征。本发明还提供了含有使用本文公开方法所培养的酵母的组合物和试剂盒。
【专利说明】用于生产基于酵母的疫苗的方法
[0001] 本申请是申请日为2008年2月1日，申请号为200880010797. 6 (国际申请号为 PCT/US2008/052843)，名称为"用于生产基于酵母的疫苗的方法"的发明专利申请的分案申 请。
[0002] 相关申请
[0003] 本申请要求在2008年2月2日递交的美国申请系列号No. 60/899, 281的优先权， 特此将其整体并入作为参考。 发明领域
[0004] 本发明涉及在中性pH培养酵母培养物以改善酵母培养物的产率和某些特征的方 法。本发明还涉及通过这些方法产生的组合物。
[0005] 发明背景
[0006] 疫苗是卫生护理产业可利用的费效比最高的措施之一。然而对于多种疾病而 言依然急需研发安全有效的疫苗和佐剂，包括由于致病因子感染、癌症、遗传缺陷所致的 那些疾病及其他免疫系统紊乱。有关疫苗的出版物，例如Rabinovich等，Scien ce265， 1401-1404 (1994)指出，仍然需要能够口服给药以及仅需少次、优选在生命早期给药的安全 热稳定的疫苗。还优选能够保护个体对抗不止一种疾病的组合疫苗，以及不需要佐剂的疫 苗和能够激发粘膜免疫的疫苗。迄今为止，如果有的话，也只有极少的疫苗满足所有这些标 准。
[0007] 亚单位疫苗的研发因为重组DNA技术而成为可能，但迄今为止一直令人失望，因 为它们仅呈现出有限的免疫原性。一个例子是最近几种HIV(人类免疫缺陷病毒）亚单 位疫苗的临床测试已被终止，这不仅是因为这些疫苗功效有限，而且还因为在一些情况下 经免疫的个体在随后接触HIV时表现出加剧的病程进展；例如参见Cohen，Scien ce264 : 1839(1994)和Cohen，Science264 :660(1994)。亚单位疫苗以及杀死的病毒和重组活病毒 疫苗的一个劣势在于虽然它们似乎刺激强体液免疫反应，但是不能激发保护性细胞免疫。 1994年国际艾滋病大会（International AIDS Conference)的主要结论是，依然需要细胞 毒性T细胞介导的反应来预防或减轻HIV感染性，而这在迄今为止的临床疫苗中是一直缺 乏的。另外，迄今为止所测试的HIV疫苗不能在粘膜表面（最初HIV感染发生的位置）激 发免疫。
[0008] 此外，在美国批准使用的唯一佐剂是铝盐，即氢氧化铝和磷酸铝，两者均不能刺激 细胞介导的免疫。另外，铝盐制剂不能进行冷冻或冻干，且这样的佐剂并非对所有抗原都有 效。
[0009] 酵母细胞已经用于亚单位蛋白疫苗的生产，包括前述HIV疫苗试验中测试的一 些。还曾在动物免疫之前对其饲喂酵母，试图以非特异性方式引发免疫反应（即刺激吞噬 作用以及补体和干扰素的产生）。这些结果模棱两可，且这样的方案未产生保护性细胞免 疫；例如参见 Fattal-German 等，Dev. Biol. Stand. 77 :115-120 (1992)和 Bizzini 等，FEMS Microbiol. Immunol. 2 :155-167(1990)。
[0010] 除疫苗之外，许多基因和药物治疗也都需要有效的特异性递送运载体以确保最大 的可能益处。缺乏足够的递送运载体是基因治疗应用的主要拦路虎，并且大幅限制了许 多药物的治疗潜力。例如，最近的报道显示目前正在临床上进行基因治疗应用检测的腺 病毒载体会刺激不期望的免疫和炎性反应，且似乎并不以期望的方式发生整合；例如参见 Engelhardt 等，Human Gene Therapy5 :1217-1229(1994)及其中引述的参考文献。
[0011] 酵母疫苗技术的另一主要障碍为生产过程。多年来已在实验室进行了酵母细胞培 养，且已经确立了标准培养条件。例如参见Methods of Enzymology，194卷，Guthrie等编 辑，冷泉港实验室出版社（Cold Spring Harbor Laboratory Press) (1990)。标准操作方案 一般包括在以pH水平衡量为酸性的培养基中培养酵母。然而,在酸性培养基中培养酵母可 能导致酵母呈现出对于使用酵母作为抗原携带载体用于免疫调节或疫苗制备目的而言并 非最佳的不同生物学特性。因此，需要培养酵母的方法，以便酵母呈现出使之更佳地适用于 作为抗原携带载体的特性。本文公开的发明部分地基于这样的发现，即，虽然酵母能够在酸 性培养基中生长，但酵母在酸性培养基中生长时所呈现出的生物学特性不如酵母在中性pH 水平的培养基中生长时那样值得期望。
[0012] 特此将本文引述的所有专利、专利申请和出版物的公开内容整体并入作为参考用 于一切目的。
[0013] 发明概述
[0014] 本发明提供了通过在培养基中培养酵母来生长酵母的方法，其中培养基在5. 5-8 的pH水平维持至少50%的酵母培养时间。本发明还提供通过在培养基中培养酵母来生长 酵母的方法，其中培养基维持在5. 5-8的pH水平，且其中酵母的密度为至少0. 5酵母单位 /ml。
[0015] 在其他方面，本发明提供通过在pH水平至少5. 5的培养基中培养酵母来生长酵 母的方法。本发明还提供通过在培养基中培养酵母来生长酵母的方法，其中培养基维持 在5. 5_8的pH水平。在本发明的一方面，酵母是酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)。 在本发明的一方面，培养基用琥珀酸盐或琥珀酸进行缓冲，或者培养基额外地含有大豆胨 (soytone)。在本发明的其他方面，酵母激发免疫反应。在本发明的其他方面，酵母表达抗 原，在一些情况下抗原是异源抗原。在一些情况下，异源抗原在酵母表面表达。
[0016] 本发明提供组合物，其含有通过上述任何方法和相关方面培养的酵母。
[0017] 本发明提供生产抗原表达酵母的方法，方式为：在培养基中培养含有用于表达所 述抗原的表达系统的酵母，其中所述培养基的pH为至少5. 5。本发明还提供生产抗原表 达酵母的方法，方式是：培养含有用于表达所述抗原的表达系统的酵母，其中培养基维持在 5. 5-8的pH水平。在一个方面，酵母是酿酒酵母。在其他方面，培养基用琥珀酸盐或琥珀酸 进行缓冲，或者培养基可以额外地含有大豆胨。在本发明的其他方面，酵母激发免疫反应。 在本发明的其他方面，酵母表达抗原，在一些情况下抗原是异源抗原。在一些情况下，异源 抗原在酵母表面表达。在一些方面，与在pH低于5. 5培养酵母相比，该异源抗原更易获得 用于与其他细胞或物质相互作用。
[0018] 本发明还提供组合物，含有通过上文所公开的方法培养的酵母。
[0019] 本发明还提供诱导个体Thl型反应的方法，包括向个体施用含有抗原表达酵母的 组合物，其中酵母已在pH水平至少5. 5的培养基中培养。
[0020] 本发明还提供诱导个体Thl型反应的方法，包括向个体施用含有抗原表达酵母的 组合物，其中酵母已在培养基中培养，其中培养基维持在5. 5-8的pH水平。在一个方面，组 合物含有荷载了已在中性pH培养、维持或收获的酵母的树突细胞。在另一方面，酵母是酿 酒酵母。在其他方面，培养基用琥珀酸盐或琥珀酸进行缓冲，或者培养基可以额外含有大豆 胨。在本发明的其他方面，酵母激发免疫反应。在本发明的其他方面，酵母表达抗原，在一 些情况下抗原是异源抗原。在一些情况下，异源抗原在酵母表面表达。在一个方面，Thl型 反应是产生干扰素-Y。在另一方面，Thl型反应是产生IL-12。
[0021] 本发明还提供了培养酵母的试剂盒，含有培养基和使用培养基培养酵母的说明 书，其中培养基的pH至少5. 5。本发明还提供了培养酵母的试剂盒，含有培养基和使用培养 基培养酵母的说明书，其中培养基的pH维持在5. 5-8的pH水平。在其他方面，培养基用琥 珀酸盐或琥珀酸进行缓冲，或者培养基可以额外含有大豆胨。在一个方面，试剂盒额外包括 酵母。在一些情况下，酵母是冷冻的或冻干的。在一些情况下，酵母已在至少PH5. 5的培养 基中进行过培养，或已在培养基的pH维持在5. 5-8的pH水平的培养基中进行过培养。在 其他情况下，酵母能够复制。
[0022] 附图的简短说明
[0023] 图1描绘了培养基pH水平对细胞生长以及对培养物pH水平的影响。
[0024] 图2描绘了培养基pH水平对细胞壁厚度的影响。
[0025] 图3描绘了测试pH大约6. 5的不同缓冲液的结果。显示了对75-15细胞的生长 和培养物pH的影响。
[0026] 图4描绘了通过葡聚糖酶裂解测量的、多种缓冲剂对细胞壁厚度的影响。培养基 使用琥珀酸盐或柠檬酸盐进行缓冲，以缓冲培养基至大约6. 5的pH水平。
[0027] 图5描绘了培养基配方研究的结果，其中测试了多种添加剂对生长和pH水平的影 响。
[0028] 图6描绘了作为培养基配方研究一部分的酵母细胞存活力结果。酵母细胞表面上 HA的表面表达利用流式细胞计数测量。
[0029] 图7描绘了培养基配方研究中的细胞生长和pH曲线结果，其中测试了多种添加 剂。
[0030] 图8描绘了可以自完整酵母释放的血细胞凝集素（HA)的免疫印迹测定结果，当在 中性条件培养酵母时相对于在较低pH条件培养酵母时，完整细胞显示出HA可及性的差异。 免疫印迹为来自YEX和G1-8103的DTT洗脱物的western印迹（蛋白质分析）。
[0031] 图9描绘了在中性和低pH水平培养酵母细胞对于荷载酵母细胞的树突细胞的细 胞因子分泌的影响。
[0032] 发明详述
[0033] 本文公开的发明基于这样的发现，即在中性pH、至少pH5. 5、或pH5. 5-8、或pH6_8 培养酵母将导致酵母具有更为期望的生物学特征。这些期望特征中的一些在下文详述，包 括但不限于：能够在增大的细胞密度下生长良好，保持酵母细胞壁的柔韧性（pliability) 和对细胞壁消化酶消化的敏感性，以及以使抗原更易于被其他细胞和/或物质所获得的方 式展示抗原。
[0034] 通用技术
[0035] 除非另有说明，本发明的实施将采用分子生物学（包括重组技术）、微生物学、细 胞生物学、生物化学、核酸化学和免疫学的常规技术，这些技术是本领域技术人员众所周知 的。这样的技术在文献中有充分的解释，例如Methods of Enzymology，194卷，Guthrie等 编辑，冷泉港实验室出版社（1990) ;Biology and activities of yeasts, Skinner 等编 辑,Academic Press (1980) ；Methods in yeast genetics ：a laboratory course manual, Rose 等，冷泉港实验室出版社（1990) ;The Yeast Saccharomyces:Cell Cycle and Cell Biology，Pringle 等编辑，冷泉港实验室出版社（1997) ;The Yeast Saccharomyces:Gene Expression，Jones 等编辑，冷泉港实验室出版社（1993) ;The Yeast Saccharomyces: Genome Dynamics，Protein Synthesis，and Energetics，Broach 等编辑，冷泉港实验室出 版社（1992);《分子克隆实验室指南》(Molecular Cloning :A Laboratory Manual)第二版 (Sambrook等，1989)和《分子克隆实验室指南》第三版（Sambrook和Russell，2001)，（在 本文联合称为"Sambrook"）；Current Protocols in Molecular Biology (F.M.Ausubel 等 编辑，1987,包括直至 2001 年的增补本）；PCR:The Polymerase Chain Reaction，（Mullis 等编辑，1994) ;Harlow 和 Lane(1988)Antibodies，A Laboratory Manual，冷泉港出版公 司（Cold Spring Harbor Publications)，纽约；Harlow 和 Lane (1999) Using Antibodies : A Laboratory Manual冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约（在本文联合称为"Harlow 和 Lane"），Beaucage 等编辑，Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry John Wiley&Sons，Inc. , New York, 2000)和 Vaccines, S. Plotkin 和 W. Orenstein 编辑，第三版 (1999)。
[0036] 定义
[0037] 如本文所用，一般使用的术语"中性pH"是指至少5. 5的pH水平。中性pH范围可 以是大约pH5. 5至大约pH8,优选大约pH6至大约8。本领域技术人员将会理解，用pH计测 量时会发生微小的波动（例如十分之几或百分之几），照此，在任何给定时间确定pH水平时 应当将此考虑在内。
[0038] 如本文所用，一般使用的术语"抗原"指任何能够为获得性免疫系统所识别的分 子。在一个方面，抗原是与抗体特异性结合的分子。所述分子可以是天然存在或合成产生 的蛋白质的任何部分（肽、部分蛋白质、全长蛋白质）；或是细胞组合物的部分（全细胞、细 胞裂解物或破坏的细胞）；或是生物体的部分（整个生物体、裂解物或破坏的细胞）；或是 糖或其部分。抗原本身或借助于其他化合物如佐剂（像破碎的酵母细胞）能够激发抗原特 异性体液免疫反应。在另一方面，抗原在主要组织相容性复合体（MHC)的环境中被T淋巴 细胞（或T细胞）识别。在另一方面，抗原能够作为耐受原（toleragen)，对抗在接受该抗 原施用的动物细胞和组织内所遭遇的相同或相似抗原。
[0039] 在本发明的一个方面，当述及刺激免疫反应时，"抗原"可以是"免疫原"。免疫原 是能够激发获得性免疫反应、例如诱导抗体产生的分子。免疫原在一些情况下能够产生记 忆细胞，这些细胞在将来接触所述抗原时将产生识别所述抗原的抗体。正如本领域技术人 员众所周知的那样，免疫原也能够为T淋巴细胞所识别，尽管T淋巴细胞所识别的免疫原的 形式将有别于抗体所识别的免疫原的形式。
[0040] 培养酵母的方法
[0041] 本发明提供了培养酵母的方法，所述酵母产生期望的特征，例如期望抗原的高表 达，细胞壁的柔韧性，抗原的展示。
[0042] 这些方法广泛适用于所有酵母。酵母为归属于下述三纲之一的单细胞微生物：子 囊菌纲（Ascomycetes)、担子菌纲（Basidiomycetes)和半知菌纲（Fungi Imperfecti)。 虽然根据本发明能够使用致病性酵母菌株或其非致病性突变株，但在一个方面，使用 非致病性酵母菌株。非致病性酵母菌株的实例包括酵母菌属（Saccharomyces)、假丝 酵母属（Candida)、隐球菌属（Cryptococcus)、汉逊酵母属（Hansenula)、克鲁维酵母 属（Kluyveromyces)、毕赤酵母属（Pichia)、红酵母属（Rhodotorula)、裂殖酵母属 (Schizosaccharomyces)和耶氏酵母属（Yarrowia)。在一个方面，使用酵母菌属、假丝 酵母属、汉逊酵母属、毕赤酵母属和裂殖酵母属。而在其他方面，使用酿酒酵母、卡尔酵 母（Saccharomyces carlsbergensis)、白假丝酵母（Candida albicans)、乳酒假丝酵母 (Candida kefyr)、热带假丝酵母（Candida tropicalis)、罗伦隐球酵母（Cryptococcus laurentii)、新型隐球酵母（Cryptococcus neoformans)、异常汉逊酵母（Hansenula anomala)、多形汉逊酵母（Hansenula polymorpha)、脆壁克鲁维酵母（Kluyveromyces fragilis)、乳酸克鲁维酵母（Kluyveromyces lactis)、马克斯克鲁维酵母乳酸变种 (Kluyveromyces marxianus var.lactis)、巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris)、深红酵 母（Rhodotorula rubra)、栗酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe)和解脂耶氏酵 母（Yarrowia lipolytica)。应当理解本发明不局限于上述物种清单，本领域技术人员能 够将本文的教导应用于任何类型的酵母。在另一方面，使用酿酒酵母实施本发明的方法。 优选酿酒酵母是因为其易于进行分子操作，且用作食品添加剂"公认安全"（"Generally 1^。(^11126(1六8 5&作"，"6狀5"）（6狀5，卩0六提出的细则62卩1?18938，1997 年4月17日）。
[0043] pH水平在酵母培养中十分重要。本领域技术人员将会理解，培养过程不仅包括酵 母培养物的起始，而且还包括培养物的维持。酵母培养物可以始于任何pH水平，可是由于 酵母培养物的培养基倾向于随着时间的推移而变得更酸（即，pH降低），因此在培养过程中 必须小心监测pH水平。
[0044] 在本发明的一些方面，酵母在pH水平至少5. 5的培养基中生长。在其他方面，酵 母在大约5. 5的pH水平生长。在其他方面，酵母在5. 5-8的pH水平生长。在一些情况下， 酵母培养物在5. 5-8的pH水平维持。在其他方面，酵母在6-8的pH水平生长。在一些情 况下，酵母培养物在6-8的pH水平维持。在其他方面，酵母在6. 1-8. 1的pH水平生长和 /或维持。在其他方面，酵母在6. 2-8. 2的pH水平生长和/或维持。在其他方面，酵母在 6. 3-8. 3的pH水平生长和/或维持。在其他方面，酵母在6. 4-8. 4的pH水平生长和/或维 持。在其他方面，酵母在5. 5-8. 5的pH水平生长和/或维持。在其他方面，酵母在6. 5-8. 5 的pH水平生长和/或维持。在其他方面，酵母在大约5. 6、5. 7、5. 8或5. 9的pH水平生长。 在另一方面，酵母在大约6的pH水平生长。在另一方面，酵母在大约6. 5的pH水平生长。 在其他方面，酵母在大约6、6. 1、6. 2、6. 3、6. 4、6. 5、6. 6、6. 7、6. 8、6. 9或7. 0的pH水平生 长。在其他方面，酵母在大约7、7. 1、7. 2、7. 3、7. 4、7. 5、7. 6、7. 7、7. 8、7. 9或8. 0的pH水平 生长。在其他方面，酵母在高于8的pH水平生长。
[0045] 在一个方面，培养酵母以便培养基的pH水平不降至pH5. 5以下。在一些情况下， 降至pH5. 5以下的时间不长于5分钟。在其他情况下，降至pH5. 5以下的时间不长于10分 钟、优选20、30、40、50或60分钟。在其他情况下，降至？册.5以下的时间不长于1小时。在 另一方面，培养酵母以便培养基的pH水平不降至pH5. 0以下。在一些情况下，降至ρΗ5. Ο 以下的时间不长于5分钟。在其他情况下，降至ρΗ5. 0以下的时间不长于10分钟、优选20、 30、40、50或60分钟。在其他情况下，降至ρΗ5. 0以下的时间不长于1小时。照此，酵母在 至少ρΗ5. 5或以上的培养基中培养的时间越长，就获得具有下文所述期望特征的酵母而言 结果就越好。
[0046] 在一个方面，利用中性pH方法生长酵母细胞意味着在至少50%的酵母培养时间 中酵母细胞生长在中性pH。更优选，在酵母培养的至少60%时间中，更优选至少70%的培 养时间中，更优选至少80%的培养时间中，最优选至少90%的培养时间中，酵母在中性pH 生长。
[0047] 在另一方面，在中性pH生长酵母包括在中性pH培养酵母细胞至少5分钟，优选在 中性pH至少15分钟，更优选在中性pH至少1小时，更优选至少2小时，甚至更优选至少3 小时或更长时间。
[0048] 如早先所指出的那样，随着酵母生长和复制，细胞密度变得更大，且培养基的酸度 水平升高。照此，建议当酵母密度增大时将酵母培养在至少5. 5的pH水平和/或维持在至 少pH5. 5。在一个方面，当酵母密度为0. 5酵母单位（YU)/ml或以上时，将酵母培养和/或 维持在5. 5-8的pH。在其他方面，当酵母密度为至少0. 6YU/ml或以上、优选0. 7YU/ml或 以上、0. 8YU/ml或以上、0. 9YU/ml或以上、或者lYU/ml或以上时，将酵母培养和/或维持在 5. 5-8的pH。在另一方面，当酵母密度为0. 5YU/ml或以上时，将酵母培养和/或维持在6-8 的pH。在其他方面，当酵母密度为至少0. 6YU/ml或以上、优选0. 7YU/ml或以上、0. 8YU/ml 或以上、0. 9YU/ml或以上、或者lYU/ml或以上时，将酵母培养和/或维持在6-8的pH。
[0049] 在一些方面，优选收获时酵母培养物处于中性pH水平。在一些情况下，酵母培养 物在收获时将处于6-8的pH水平。在其他情况下，酵母培养物在收获时将处于5. 5-8的pH 水平。
[0050] 培养基可以通过任何手段达到至少5. 5的pH水平。在一个方面，利用琥珀酸（及 任何相关形式，如阴离子琥珀酸根）缓冲培养基。如实施例中进一步详述的那样，利用琥珀 酸盐缓冲培养基至至少PH5. 5,允许酵母具有大约两个到两个半小时的倍增时间。琥珀酸盐 可由商业可获得来源（例如西格玛化学（Sigma Chemicals))获得。在其他方面，可利用柠 檬酸盐使培养基达到pH至少5. 5。本领域技术人员将能够容易地确定可用来使培养基达 到pH至少5. 5而同时保持酵母存活的其他缓冲剂。缓冲剂保持溶液处于稳定pH水平的概 念是本领域熟知的，照此本文将不作详细讨论。如果根据本发明培养的酵母用于药物制品 (例如疫苗），则建议使用GMP级的材料。
[0051] 另外，可以向培养基中添加其他增补物以改善培养基。特别有助于添加到培养基 中的其他增补物包括大豆胨。大豆胨可容易地由商业来源（例如BD Difco)获得。如实施 例和附图中所显示的那样，向培养基中添加大豆胨支持在中性pH更高密度的生长。此外， 添加大豆胨支持目的抗原流感病毒血细胞凝集素（HA)的表达。
[0052] 可以向酵母培养物中添加其他添加剂用于其他目的，例如包括表达异源基因。在 一些方面，利用铜诱导血细胞凝集素表达。不过，中性pH使用铜并不理想，因而，为控制诱 导型基因在于中性pH培养的酵母中表达，建议非铜的添加剂。
[0053] 中性pH对酵母培养物的影响
[0054] 利用中性pH培养酵母可以促进若干生物学效应，就利用酵母作为载体进行免疫 调节和/或激发免疫反应而言这些效应是期望的特征。在一个方面，在中性pH培养酵母允 许酵母生长良好而对倍增时间没有任何负面影响（例如减慢倍增时间）。酵母能够持续生 长至高密度而不丧失其细胞壁柔韧性。
[0055] 在另一方面，中性pH的使用，例如至少5. 5的pH或pH5. 5-8,允许在所有收获密 度产生具有柔韧细胞壁的酵母，和/或对细胞壁消化酶（例如葡聚糖酶）具有敏感性的酵 母。照此，本发明提供了有关具有如通过传统测定法（例如对葡聚糖酶的敏感性）所测量 的细胞壁柔韧性的酵母的方法和组合物。以前的实验已经确立酵母在大约〇. 5YU(酵母单 位）/ml的收获密度时丧失其对细胞壁消化酶消化的敏感性。照此，一个优势在于可以利用 与在标准生长培养基中以0. 5YU/ml培养的酵母进行的比较，来比较于任何密度的中性pH 生长。这种性状是期望的，因为具有柔性细胞壁的酵母能够呈现出独特的免疫反应，例如促 进酵母寄宿的细胞中的细胞因子（例如INF-γ)分泌。本领域技术人员会使用中性pH方 法的另一原因在于其允许位于细胞壁中的抗原具有更高的可及性。这有助于所表达蛋白质 的更大的免疫原性和抗体检测，如通过标准技术如流式细胞仪所测量的那样。
[0056] 在中性pH培养的酵母中所观察到的另一期望特征是：抗原以有益于免疫调 节目的的方式表达。在一个方面，酵母用作为载体用于抗原表达（例如参见美国专利 No. 5, 830, 463和7, 083, 787)。抗原可以是酵母的天然抗原，或者是酵母表达的异源抗原。 在一些方面，利用酵母表达抗原有助于研发疫苗、预防剂和治疗剂，以对抗多种疾病和紊乱 (例如传染性疾病或癌症）。利用中性pH方法，本领域技术人员能够产生抗原携带酵母，其 中抗原更易于被其他细胞（例如用于免疫共刺激功能或免疫调控）或其他物质（例如抗体 用于检测）所获得。另外，对一些抗原，例如流感HA抗原，使用中性pH，允许通过二硫苏糖 醇（DTT)处理释放二硫键键合的HA，这在HA表达酵母于pH降至pH5以下的培养基中培养 的情况下是不可能的。在一些情况下，这发生在pH降至pH5以下任意长的时间的情况下。 在其他情况下，这发生在pH降至pH5以下1分钟或几分钟或者1或多个小时的情况下。 [0057] 按照中性pH方法培养的酵母所呈现的另一期望特征在于与所述酵母接触的细胞 将分泌Thl型细胞因子。Thl型细胞因子的实例包括但不限于：干扰素-γ、IL-12和IL-2。 如实施例中进一步详述的那样，与在低（酸性）pH培养基中培养的酵母相比，荷载了依照中 性pH方案培养的酵母的树突细胞呈现出增加水平的干扰素-γ分泌和表达。利用中性pH 培养方法时IL-12的分泌水平并无下降。由此，本领域技术人员能够将本文公开的中性pH 方法用于免疫调节目的，例如在罹患将得益于增强的Thl型反应的疾病或紊乱的个体中诱 导Thl型反应。
[0058] 利用中性pH方法培养的酵母的组合物
[0059] 本发明还考虑含有利用本文公开的中性pH方法所培养的酵母的组合物。在一个 方面，组合物含有在其表面、内部或表面及内部表达天然抗原的酵母。这类组合物可用于多 种目的，例如作为佐剂给药。在另一方面，组合物含有在其表面、内部或表面及内部表达异 源抗原的酵母。这类组合物可用于多种目的，例如对需要的个体进行免疫调节以及研发疫 苗。
[0060] 这些组合物还可以包括可药用的赋形剂和/或载体。可药用的载体可以包括无菌 水性或非水性溶液、混悬液和乳液。非水性溶剂的实例有丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄榄 油、以及可注射的有机酯如油酸乙酯。水性载体包括水、醇/水溶液、乳液或混悬液，包括盐 水和缓冲介质。胃肠外载体包括氯化钠溶液、林格氏葡萄糖液、葡萄糖和氯化钠、乳酸林格 氏液或不挥发油。静脉内载体包括液体和营养补充剂、电解质补充剂（例如基于林格氏葡 萄糖液的那些）等等。也可以存在防腐剂和其他添加剂，例如抗微生物剂、抗氧化剂、螯合 剂和惰性气体等等。用可药用赋形剂配制含有中性pH条件下培养的酵母的组合物，对于本 领域技术人员而言是一般常规的。
[0061] 本发明的试剂盒
[0062] 本发明考虑含有用于在中性pH条件下培养酵母的培养基组分的试剂盒。在一个 方面，试剂盒包括培养基组分和有关其使用的一套说明书，其中所述培养基组分含有琥珀 酸盐或琥珀酸，可用于使培养基达到至少5. 5的pH。在另一方面，试剂盒还包括大豆胨作为 附加组分。在另一方面，试剂盒还包括酵母细胞。酵母细胞可以是冷冻的，用于通过本文公 开的方案起始培养物。在另一方面，酵母细胞可以在冷冻以包装为试剂盒的一部分之前就 已经通过本文公开的方法进行过培养。在另一方面，酵母细胞可以是冻干的，并任选地纳入 在试剂盒之中。在另一方面，试剂盒含有根据本文公开的方法制备的、能够复制的酵母。 [0063] 提供如下实施例以举例说明本发明的某些方面。它们并非旨在以任何方式限制本 发明。 实施例
[0064] 实施例1酵母培养某配方
[0065] 多种类型的培养基可用来培养酵母并可以进行调整以使pH水平为中性。下文给 出了可以使用的几种培养基的实例，不过，应当理解本发明并不局限于这些培养基组分或 培养基方案的使用。
[0066] -种标准培养基配方是如下的ULDM培养基：
[0067]
【权利要求】
1. 培养酵母的方法，包括在培养基中培养酵母，其中培养基在5. 5-8的pH水平维持至 少50 %的酵母培养时间。
2. 培养酵母的方法，包括在培养基中培养酵母，其中培养基维持在5. 5-8的pH水平，且 其中酵母的密度为至少〇. 5酵母单位/ml。
3. 培养酵母的方法，其中在至少50 %的酵母培养时间中酵母培养在pH水平至少5. 5 的培养基中。
4. 权利要求3的方法，其中培养基维持在5. 5-8的pH水平。
5. 权利要求3的方法，其中酵母是酿酒酵母。
6. 权利要求3的方法，其中培养基用琥珀酸盐或琥珀酸进行缓冲。
7. 权利要求6的方法，其中培养基还含有大豆胨。
8. 权利要求3的方法，其中在向个体施用时酵母激发免疫反应。
9. 权利要求8的方法，其中酵母表达异源抗原。
10. 权利要求9的方法，其中异源抗原在酵母表面表达。
11. 组合物，含有通过权利要求1、2或3中任一方法培养的酵母。
12. 生产抗原表达酵母的方法，其中在培养基中培养含有用于表达所述抗原的表达系 统的酵母，其中所述培养基的pH为至少5. 5。
13. 生产抗原表达酵母的方法，其中培养含有用于表达所述抗原的表达系统的酵母，其 中培养基维持在5. 5-8的pH水平。
14. 权利要求12或13的方法，其中酵母是酿酒酵母。
15. 权利要求14的方法，其中培养基用琥珀酸盐或琥珀酸进行缓冲。
16. 权利要求15的方法，其中培养基还含有大豆胨。
17. 权利要求12或13的方法，其中在向个体施用时酵母激发兔疫反应。
18. 权利要求17的方法，其中酵母表达异源抗原。
19. 权利要求18的方法，其中异源抗原在酵母表面表达。
20. 权利要求18的方法，其中与在低于5. 5的pH培养酵母时相比，所述异源抗原更易 于获得用于与其他细胞或物质相互作用。
21. 组合物，含有通过权利要求12或13所述的任一方法培养的酵母。
22. 诱导个体Thl型反应的方法，其中向个体施用含有抗原表达酵母的组合物，其中酵 母已在pH水平至少5. 5的培养基中进行过培养。
23. 诱导个体Thl型反应的方法，其中向个体施用含有抗原表达酵母的组合物，其中酵 母已在培养基中进行过培养，其中所述培养基维持在5. 5-8的pH水平。
24. 权利要求23的方法，其中组合物含有荷载了已在中性pH培养、维持或收获的酵母 的树突细胞。
25. 权利要求23的方法，其中酵母是酿酒酵母。
26. 权利要求23的方法，其中培养基用琥珀酸盐或琥珀酸进行缓冲。
27. 权利要求26的方法，其中培养基还含有大豆胨。
28. 权利要求23的方法，其中在向个体施用时酵母激发免疫反应。
29. 权利要求28的方法，其中酵母表达异源抗原。
30. 权利要求29的方法，其中异源抗原在酵母表面表达。
31. 权利要求23的方法，其中Thl型反应是产生干扰素-γ。
32. 权利要求23的方法，其中Thl型反应是产生IL-12。
33. 培养酵母的试剂盒，含有培养基和使用培养基培养酵母的说明书，其中培养基的 pH为至少5. 5。
34. 培养酵母的试剂盒，含有培养基和使用培养基培养酵母的说明书，其中培养基的 pH维持在5. 5-8的pH水平。
35. 权利要求34的试剂盒，其中培养基用琥珀酸盐或琥珀酸进行缓冲。
36. 权利要求34的试剂盒，其中培养基还含有大豆胨。
37. 权利要求34的试剂盒，其中试剂盒还包括酵母。
38. 权利要求37的试剂盒，其中酵母是冷冻的或冻干的。
39. 权利要求37的试剂盒，其中酵母已在至少pH5. 5的培养基中培养过，或已在培养基 的pH维持在5. 5-8的pH水平的培养基中培养过。
40. 权利要求37的试剂盒，其中酵母能够复制。
【文档编号】C12R1/865GK104120086SQ201410244501
【公开日】2014年10月29日 申请日期:2008年2月1日 优先权日:2007年2月2日
【发明者】A.弗兰祖索夫, D.奎克 申请人:环球免疫公司