专利名称：一种基于体内同源重组构建酵母整合型基因突变文库的方法
技术领域：
一种基于体内同源重组构建酵母整合型基因突变文库的方法，涉及一种通 过同源重组构建基因突变文库的方法。属于蛋白质工程，分子生物学技术，基 因工程领域。
背景技术：
酶的体外定向进化，属于蛋白质的非合理设计，它不需事先了解酶的空间 结构和催化机制，通过人为地创造特殊的条件，模拟自然进化机制(随机突变、 重组和自然选择)，在体外改造酶基因，并定向选择出所需性质的突变酶。酶 的体外定向进化技术极大地拓展了蛋白质工程学的研究和应用范围，特别是能 够解决合理设计所不能解决的问题，为酶的结构与功能研究开辟了崭新的途径， 并且正在工业、农业和医药等领域逐渐显示其生命力。
酵母是表达外源基因的最重要的表达系统之一。酵母作为单细胞生物，在 生产和操作上具有细菌表达系统易于大规模扩增的特点，又具有真核细胞对蛋 白质的翻译后加工及修饰的作用。酵母表达系统的表达载体主要分为两种，即 整合型载体和附加型载体。整合型载体不含自主复制序列，转化入酵母后整合 到酵母宿主菌的染色体上，具有稳定性好的优点，尤其适合于工业化生产。而 附加型载体能够在酵母体内自主复制，达到较高的拷贝数，但是在非选择条件 下多不稳定。
易错PCR是在体外随机引入基因突变的一种基本方法，其原理是在PCR 过程中加入高浓度的Mgh和Mr产，利用不平衡的dNTP (脱氧核苷三磷酸)，以 提高&《酶在PCR扩增过程中随机引入突变的概率(Kammann et al.， Nucleic Acids Res. 1989， 17(13): 5404)。传统易错PCR构建酵母外源基因整合型突变文 库的步骤一般包括以目的基因作为模板进行易错PCR，得到含有随机突变的 扩增片段；用限制性内切酶对扩增片段和表达载体进行处理；用DNA连接酶将 二者连接；将重组表达载体导入大肠杆菌；培养大肠杆菌，大量扩增表达质粒； 提取质粒进行酶切线性化；转化酵母，最终获得带有各种不同突变基因的重组 细胞，即基因突变文库。这个过程步骤繁琐、效率低、耗时耗力，极大的损失 了突变基因的容量，而基因突变文库需要从成千上万个转化子中才能筛选到目 的转化子，因此传统方法不能满足构建酵母整合型基因突变文库的需要。
发明内容
本发明的目的是提供一种快速高效的基于体内同源重组构建酵母整合型基因突变文库的方法。
本发明的技术方案 一种构建酵母整合型基因突变文库的方法，基于体内 同源重组，其步骤为
(1) 将需要突变的目标基因克隆到表达载体的多克隆位点中构建成重组表 达质粒，并将重组表达质粒导入酵母进行整合性表达；
(2) 以重组表达质粒为模板，使用长引物进行易错PCR扩增得到上下游 与表达载体有20 70bp同源序列的突变基因；
(3) 对表达载体的两个区域①与突变基因两端同源区域，②与酵母基因 组同源区域，进行酶切线性化；
(4) 将线性化表达载体按照一定的比例与易错PCR扩增产物混合，将混 合物电转化酵母，由于易错PCR扩增产物两端与线性化后的表达载体两端具有 同源区域，两端同源重组形成线型产物；由于线型产物两端具有与酵母基因组 同源区域，根据同源区域的末端不同，外源目标基因片段插入或者双交换整合 入酵母基因组中，涂布酵母筛选平板，获得基因突变文库。
步骤(1)中所述的表达载体为整合型载体pPIC9K、 pPIC3.5K、 pPIC9、 pPIC3.5、或pA0815。
构建基因突变文库的优选酵母宿主菌为巴斯德毕赤酵母GS115或巴斯德毕 赤酵母KM71。
本发明的原理如图l所示，以宿主菌巴斯德毕赤酵母GS115、整合型表达 载体pPIC9K为例，外源基因用ge"e表示。
(1) 以重组表达质粒pPIC9K-gene为模板，易错PCR扩增得到上下游与 表达载体有20 70bp同源区段a和b的突变基因；
(2) 对表达载体pPIC9K酶切线性化分为两步， 一是酶切表达载体的需 插入外源片段处的酶切位点，二是酶切整合入酵母基因组的同源区段；
(3) 将两者混合共转化毕赤酵母GS115，在毕赤酵母体内发生两种同源重 组事件如图la所示为双交换同源重组，当酶切整合入酵母基因组的同源区段 时，产生两个不同区域的交换末端，则外源基因片段替换部分酵母基因组片段; 如图lb所示为插入型同源重组，当酶切整合入酵母基因组的同源区段时，产生 同一区域的两个交换末端，则外源基因片段在此处插入酵母基因组。
(4) 根据同源重组入酵母基因组的筛选标记来筛选重组酵母。 本发明的有效益果-
(1)该方法效率高，操作方便在构建得到重组表达质粒的基础上，整个 建库步骤只需要一次易错PCR、载体酶切和电转化过程，省略了传统构建过程 中连接、突变质粒构建、转化大肠杆菌、提取质粒等繁琐而且耗时的工作，将 建库周期由1 2周縮短为3天。(2) 利用该方法构建酵母基因突变文库不需要任何亚克隆步骤，降低了亚 克隆步骤带来的突变基因容量与丰度的损失。
(3) 材料与方法具有通用性该方法可用于各种可以在酵母中获得表达的 目标基因。
图la.双交换型同源重组示意图。
图lb.插入型同源重组示意图。
图中标记说明 5'Paoxi醇氧化酶AOXl的启动子 ColEl 复制起点 Amp 大肠杆菌筛选标记 3'AOXl醇氧化酶AOXl的3'端序列 Notl、 AvrII、 Sacl、 BglII:限制性酶切位点 TT 终止子 a、 b: 同源区段 gene: 外源基因
图2.具体实施方式
中的华根霉脂肪酶基因易错PCR扩增电泳图。
泳道1,2,3,4:易错PCR产物；M: DNA Ladder Marker
图3.基因突变库中重组酵母表达脂肪酶的活力，阳性对照为未经突变的阳 性重组子的发酵上清活力，1 8为突变库中挑取的突变重组子的发酵上清活力。
图4.酵母发酵上清液SDS-PAGE检测图谱。
Lanel:蛋白分子量标准；lane2:建立的突变库中随机挑取的一株突变重 组子的发酵上清液。
具体实施例方式
实施例1
下面通过构建华根霉(i^/zop^c/h'"em^)脂肪酶基因突变文库的例子来具 体描述本发明方法，构建步骤参考原理示意图1。
菌株与试剂华根霉(i /^ojmsc/2/"e"^CCTCCM 201021)由江南大学保 存。毕赤酵母尸/c/H'apastors GS115和表达载体pPIC9K购自Invitrogen公司。
华根霉发酵培养基(g/L):葡萄糖10，豆饼粉40，蛋白胨60， CaCl26， ZnS041.5，橄榄油20， pH5.5。
酵母培养基YPD、 MD、 MM、 BMGY、 BMMY、 YPD-G418按《Invitrogen 公司操作手册》 (Carlsbad C A, Multi-copy /Vc/^ Expression Kit, Version E，./"v"ragew， 1999 )方法配制。
YPD-rho平板YPD培养基中添加100g/L橄榄油和0.5 g/L罗丹明B。未特别说明，则试剂均购自TaKaRa公司。
1. 以华根霉(W/iizopMsc/n'we"^) CCTCC M 201021为模版，PCR扩增华 根霉脂肪酶基因proRCL (Genbank登录号EF405962)，插入毕赤酵母整合型 表达载体pPIC9K构建酵母整合型表达质粒pPIC9K-/7ra^CZ,并电转化酵母获得 分泌表达，具体方法参见Yu等(Jowwa/ o/Mo/ecw/w Cato/;wi B:五"2^waric 2009, 57:304-311 )。
2. 以质粒pPIC9K-proRCL为模版，设计长引物，上游引物与pPIC9K有66bp 重叠，下游引物与pPIC9K有60bp重叠，如下
ProF: 5 ，-GCTGCTAAAG AAGAAGGGGT ATCTCTCGAG AAAAGAGAGG CTGAAGCTTA CGTAGAATTC (XTJGG-3，(斜体表示爿vrll酶切位点)
ProR: 5，誦GTAAGTGCCC AACTTGAACT GAGGAACAGT CATGTCTAAG GCGAATTAAT TCC7CGGCCGC-3'(斜体表示iVofl酶切位点)
配制以F易错PCR反应体系(50pL体系)进行扩增
dCTP(25 mmol/L)2|iL
dTTP(25 mmol/L)2pL
dGTP(10 mmol/L)lpL
dATP(10mmol/L)l(iL
ProF(20 pmol/iiL)lpL
ProR(20 pmol/(xL)lpL
Mg2+(25mM)16|iL
Mn2+(5mM)2,5^L
pPIC9K-proRCL0.5 i^L
r叫DNA聚合酶(2.5U)l|iL
10xPCR缓冲液(不含MgCb)5|liL
ddH2017|iL
PCR扩增条件94°C， 3min; (94。Clmin， 60。Clmin， 72。C2min) xi5个 循环；72X:延伸10min。结果表明，扩增得到的片段为L2kbp (图2)。用DNA 纯化试剂盒纯化易错PCR扩增产物。
3. 表达载体pPIC9K的线性化处理载体pPIC9K经限制性内切酶^rlI和 A^I处理，产生的大片段具有与易错PCR产物同源的两个末端，再将此大片段 用限制性内切酶Bg/II处理，再产生与毕赤酵母基因组同源的两个末端， 一个是 醇氧化酶启动子PAWa片段末端和3'AOXl末端。
4. 将线性化的载体与步骤2所述的纯化易错PCR产物按摩尔比l:5混合 后，共同转化毕赤酵母感受态。
5. 巴斯德毕赤酵母感受态细胞的制备
6(1) 接种GS115单克隆于5 mL YPD液体培养基，30 。C、 250 r/min培养过夜；
(2) 接种50 pL过夜培养物至100 mL YPD液体培养基中，30 。C、 250 r/min 培养至0￡>.600为Ll 1.3;
(3) 收集菌液，4°C、 5000 r/min离心5 min，去上清，用200 mL冰预冷
的无菌水重悬沉淀；
(4) 按步骤(3)离心，用lOOmL冰预冷的无菌水重悬沉淀；
(5) 按步骤(3)离心，用10mL冰预冷的lmol/L的山梨醇溶液重悬沉淀；
(6) 按步骤(3)离心，用lmL冰预冷的lmol/L的山梨醇溶液重悬沉淀， 80)iL分装，即用于转化。
6. 巴斯德毕赤酵母的电转化
(1) 质粒线性化提取pPIC9k、 pPIC9K-prai 0:质粒，各取5 10吗酶 切线性化，酶切体系为10xbuffer5 (iL，质粒(约20iig) 44 pL， Bg/II10ul|aL， 37。C4h， 1%琼脂糖凝胶电泳酶切产物，检测酶切是否完全。用2倍体积(100 pL)无水乙醇沉淀回收酶切产物；
(2) 取10 pL (约5 ng 10 jag)的线性化质粒与80 pL的感受态GS115菌 体混匀，转至0.2cm冰预冷的电击杯中；
(3) 冰上放置5min，电压1500V，电容25 电阻200Q，电击时间为 5ms，进行电击；
(4) 电击完毕后，立即加入lmL冰预冷的lmol/L的山梨醇溶液，混匀；
(5) 30。C静置lh，涂布于MD平板上，30。C培养2天。
7. G418抗性筛选重组巴斯德毕赤酵母
配制G418浓度梯度为0.25 mg/mL、 0.50 mg/mL、 0.75 mg/mL、 1.0mg/mL 的YPD-G418抗性平板，将His+转化子用灭菌的牙签分别点到不同浓度梯度的 YPD-G418抗性平板上，30。C培养2天左右。
8. 将YPD-G418抗性平板上的菌落影印到YPD-rho平板，甲醇蒸汽诱导表 达重组脂肪酶，菌落周围透明圈大小代表基因突变导致脂肪酶活力的变化，挑 取克隆摇瓶发酵培养，并测定活性。
9. 摇瓶水平下诱导表达重组脂肪酶如下
(1) 挑选巴斯德毕赤酵母单克隆于装有25 mLBMGY培养基的250mL摇瓶 中，28°C 250 r/min培养至OD.6oo为2 6;
(2) 室温3000 g离心5 min，收集菌体，用BMMY重悬菌体，使OD.6。。为1.0 左右，28°C 250 r/min培养；
(3) 每1211向培养基中添加100%甲醇至终浓度为0.5%;
(4) 每隔24h取菌液样品lmL，离心分离样品的上清液，-80°C保存备用。
10. 重组脂肪酶活力测定(1)原理
脂肪酶水解对硝基苯酚棕榈酸酯产生对硝基苯酚和棕榈酸，对硝基苯酚在
水溶液中显黄色，在410nm有最大的光吸收，通过测定对硝基苯酚在410nm处 的光吸收，可测得脂肪酶的活力。 (2)脂肪酶活力的测定
(I) 底物溶液及其终止液的配制
将溶解有底物30 mg对硝基苯酚棕榈酸酯的10 mL异丙醇和溶解有207 mg 脱氧胆酸钠和100 mg阿拉伯树胶粉的90 mL 0.05 mol/L pH值一定的磷酸钾缓冲 液混匀备用。
终止液(g/L) : NaOH 40 g， EDTA 93.05 g。溶液颜色变黄后加入终止液 62mL终止其反应。
(II) 脂肪酶活力测定体系
在反应体系中加入2.4mL上述底物，加入O.l mL适当稀释的酶液， 一定条 件下反应(空白用同样稀释的死酶液替代)，在410 nm处用空白作为对照测定吸 光值A4H)，根据对硝基苯酚标准曲线，由吸光值查出对硝基苯酚的浓度并计算 酶活。酶活的定义为 一定反应条件下每分钟产生1 pmol对硝基苯酚的酶量为 一个脂肪酶水解酶活国际单位。
测定分泌型表达的基因重组巴斯德毕赤酵母发酵液上清，以未突变的脂肪 酶基因转化子为阳性对照。
ll.挑选的重组酵母表达脂肪酶的活力测定如图3所示，表达产物的 SDS-PAGE图如图4所示。
8
权利要求
1、一种构建酵母整合型基因突变文库的方法，其特征是基于体内同源重组，步骤为(1)将需要突变的目标基因克隆到表达载体的多克隆位点中构建成重组表达质粒，并将重组表达质粒导入酵母进行整合性表达；(2)以重组表达质粒为模板，使用长引物进行易错PCR扩增得到上下游与表达载体有20～70bp同源序列的突变基因；(3)对表达载体的两个区域①与突变基因两端同源区域，②与酵母基因组同源区域，进行酶切线性化；(4)将线性化表达载体按照一定的比例与易错PCR扩增产物混合，将混合物电转化酵母，由于易错PCR扩增产物两端与线性化后的表达载体两端具有同源区域，两端同源重组形成线型产物；由于线型产物两端具有与酵母基因组同源区域，根据同源区域的末端不同，外源目标基因片段插入或者双交换整合入酵母基因组中，涂布酵母筛选平板，获得基因突变文库。
2. 根据权利要求l所述的构建酵母整合型基因突变文库的方法，其特征在 于，步骤(l)中所述的表达载体为整合型载体pPIC9K、pPIC3.5K、pPIC9、pPIC3.5、 或pA0815。
3. 根据权利要求1所述的构建酵母整合型基因突变文库的方法，其特征在 于，构建基因突变文库的酵母宿主菌为巴斯德毕赤酵母GS115或巴斯德毕赤酵 母KM71。
全文摘要
一种基于体内同源重组构建酵母整合型基因突变文库的方法，属于蛋白质工程，分子生物学技术，基因工程领域。本发明方法为构建目标基因的重组表达质粒；以此为模板，设计长引物片段，易错PCR扩增得到两端带有表达载体20～70bp同源序列的突变基因；分别对表达载体的与突变基因两端同源区域以及与基因组同源区域进行酶切线性化；将易错PCR扩增产物与线性化后的表达载体以一定的摩尔比混合电转化酵母，通过同源重组，外源突变目标基因整合入酵母基因组，获得基因突变文库。本方法效率高，操作方便，建库周期由1～2周缩短为3天，建库不需要任何亚克隆步骤，降低了突变基因容量与丰度的损失，具有通用性，可用于各种能在酵母中表达的目标基因。
文档编号C40B50/06GK101550605SQ20091002762
公开日2009年10月7日 申请日期2009年5月15日 优先权日2009年5月15日
发明者喻晓蔚, 岩 徐, 睿 王 申请人:江南大学