一种利用迭代同源重组体内进化目标蛋白质的新方法
【专利摘要】本发明涉及一种利用迭代同源重组体内进化目标蛋白质的新方法。其特征在于：首先在体外通过两步PCR制备得到带突变的单链核苷酸并用DNase I酶切，回收80?100nt片段构成目标蛋白质的单链核苷酸突变库；以此单链突变库转化大肠杆菌，通过λ?Red同源重组技术建立含有目标蛋白质突变体的大肠杆菌菌群；再次将上述单链突变库转化含有目标蛋白质突变体的大肠杆菌菌群，形成更大库容量的大肠杆菌菌群；再次转化大肠杆菌的操作循环2?6次，构建含有目标基因突变的大肠杆菌突变库；最后通过高效筛选或高通量筛选获得目标蛋白质突变体。这一技术可应用于微生物基因原位进化，提高酶催化活性，并应用于提高微生物代谢产物的产率。
【专利说明】一种利用迭代同源重组体内进化目标蛋白质的新方法 发明领域
[0001] 本发明涉及一种利用迭代同源重组体内进化目标蛋白质的新方法，属于生物技术 领域。
【背景技术】
[0002] 定向进化技术是一种在实验室中模拟达尔文进化，进化出在自然界并不存在的或 是具有更优性质的蛋白质，并可以通过改变酶的催化效率改变代谢流，扩展或构建新的代 谢途径，弱化或消除不必要或有害的代谢途径，从而达到提高某种代谢产物产率或降解有 害物质的目的。定向进化技术主要有两个步骤:首先利用现代分子生物学方法构建基因的 突变文库，然后耦合筛选方法对文库进行筛选。突变文库的构建可以提供足够的多样性以 供筛选，是定向进化的关键步骤。按照DNA突变发生的场所，构建突变文库的技术可以分为 体外突变和体内突变。
[0003] 体外突变手段通过易错PCR、饱和点突变或DNA重排等标准实验技术在感兴趣的基 因上引入多样性。体外突变手段可以有效得控制突变率和突变谱，而体内突变手段可以耦 合突变和筛选，并且可以绕开转化效率瓶颈，避免费时费力的建库，克隆，操作步骤。
[0004] 最常用的体内突变手段包括化学诱变剂，碱基类似物，紫外线和超突变菌株。化学 诱变剂产生的突变谱很窄，而且可能对人有致癌作用。紫外线辐射产生的突变谱很广，而且 几乎没有序列偏好性。然而紫外线对细胞的杀伤作用限制了它的作用。最广泛应用的体内 突变方法是使用超突变菌株比如XLl-Red。此菌株通过删除和修饰DNA复制和修复相关基因 来提高突变概率，然而其突变频率无法控制，基因不稳定，生长缓慢使得分离突变子较为困 难。
[0005] George Church实验室发明了MAGE(多重自动基因组改造技术）。它同时针对基因 组的不同区域设计一系列的单链寡核苷酸，利用A-Red同源重组系统将这些寡核苷酸整合 到基因组上，实现单个细胞基因组多个位点的改造或细胞群体间基因组改造的多样性。利 用该技术定向改造大肠杆菌中番茄红素合成过程中的20个基因的RBS区域，设计不同的简 并引物，使它们定向进化到认为可以提高表达量的经典的SD序列(TAAGGAGGT)，最终筛选得 到高产菌株。MAGE技术利用体外合成的90nt单链寡核苷酸达到高效同源重组的目的，且针 对的改造目标都是调苄基因，并没有实现对蛋白质的结构基因进行定向进化。
【发明内容】
[0006] 本发明所要解决的技术问题是提供一种利用迭代同源重组体内进化目标蛋白质 的新方法。为此，本发明采用以下技术方案：
[0007] 构建一个80-100nt的单链核苷酸目标基因突变库，通过A-Red同源重组技术，利用 所述突变库对大肠杆菌基因组上的蛋白质基因进行原位迭代重组，构建较大库容量的含有 目标基因突变的大肠杆菌突变库，以较高的突变率达到进化酶分子结构提高酶催化效率的 目的。
[0008] 进一步地，所述方法为在体外构建目标蛋白质基因的TA克隆载体，以此载体为模 板，用error-prone PCR制备得到带碱基突变的双链核苷酸；以此双链为模板，单引物PCR制 备得到带突变的单链核苷酸；用DNase I把以上单链酶切并回收80-100nt片段构成目标蛋 白质的单链核苷酸目标基因突变库。
[0009] 进一步地，所述迭代的步骤为：
[0010]以得到的单链核苷酸目标基因突变库转化大肠杆菌，通过A-Red同源重组技术建 立含有目标蛋白质突变体的大肠杆菌菌群，得到初始的含有目标基因突变的大肠杆菌突变 库；
[0011] 将上述单链核苷酸目标基因突变库转化初始的含有目标基因突变的大肠杆菌突 变库，得到新的含有目标基因突变的大肠杆菌突变库，形成更大库容量的大肠杆菌菌群，构 建成含有目标基因突变的大肠杆菌突变库;或者：
[0012] 再用上述单链核苷酸目标基因突变库转化新形成的含有目标基因突变的大肠杆 菌突变库，得到更新后的含有目标基因突变的大肠杆菌突变库，以此不断增加含有目标基 因突变的大肠杆菌突变库的库容量，构建含有目标基因突变的大肠杆菌突变库。
[0013] 单链核苷酸的获取方式包括但不限于T7逆转录法，核酸外切酶法，变性高效液相 色谱法，磁珠捕获法，不对称PCR，两步PCR法等。
[0014] 80-100nt的单链核苷酸是通过降解长单链核苷酸的方式得到，它的获取方式包括 但不限于DNase頂每切，超声波破碎法等。
[0015] 单链核苷酸可以通过转化或转染的方式进入细胞内。转化或转染的方式包括但不 限于磷酸钙法，氯化钙法，脂质体转染，电穿孔法，光穿孔法等。转化介质包括但不限于水， 氯化妈，脂质体等。
[0016]在转化或转染之前，大肠杆菌细胞在30°C培养至一定浓度，并于42 °C进行诱导。在 细胞基因组上的A-Red同源重组系统在pL启动子控制下，并受到cI857阻遏蛋白的调控。在 30°C时pL启动子受阻遏不表达，42°C时诱导表达A-Red同源重组所需的三个蛋白。经过 15min诱导之后的细胞放于4°C保存，防止诱导的蛋白降解。
[0017] 培养基需要置换成转化介质，去除其中的离子。此过程可以采用的方式包括但不 限于离心法，膜过滤法等。
[0018] 本发明为了在大肠杆菌基因组上实现较高的突变率并对一个或多个蛋白质基因 进行突变，通过迭代A-Red同源重组的策略，达到对蛋白质进化的目的。此方法可以对基因 组上单一基因进行进化，也可以同时对多个基因进行修饰，并耦合筛选，寻找出多个突变蛋 白协同作用所达到的最佳效果。
[0019] 本发明所提供的利用迭代同源重组进化目标蛋白质的新方法是有效获得所需蛋 白质突变的方法，比以往的方法更加简便、高效。
[0020] 本发明所提供的一种利用迭代同源重组体内进化目标蛋白质的新方法，通过突变 大肠杆菌基因组上1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶(DXS)基因，提高大肠杆菌产番茄红素 的水平。通过筛选得到5个1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶的突变体，其基因序列选自序列 表第SEQ ID勵.5、^).7、勵.9、^).11、^).13序列中的一种，分别提高了相应大肠杆菌合成 番茄红素水平50 % -300 %。
[0021] 本发明所提供的一种利用迭代同源重组体内进化目标蛋白质的新方法，通过突变 大肠杆菌基因组上0s因子(Rpos)基因，提高大肠杆菌产番茄红素的水平。通过筛选得到2个 0s因子突变体，其序列选自序列表第SEQ ID NO. 19、N0.21序列中的一种，分别提高了相应 大肠杆菌合成番茄红素水平80 %和205 %。
【附图说明】
[0022] 图1:本发明流程示意图。其中，Gene:基因；Error-Prone PCR:易错PCR;Single Primer PCR:单链PCR;DNase I Digestion:DNase I酶切；cycles of Recombination:多次 重组;Genome:基因组;E ? co 1 i :大肠杆菌。
[0023]图2:野生型及含DXS突变体的大肠杆菌菌株产番茄红素能力对比图；其中， Lycopene Production:番前红素产量。
[0024]图3:野生型及含Rpos突变体的大肠杆菌菌株产番茄红素能力对比图；其中， Lycopene Production:番前红素产量。
【具体实施方式】
[0025] 本发明通过迭代同源重组的策略对大肠杆菌基因组上的结构基因进行突变，达到 对功能蛋白原位进化的目的，以下把这种策略应用到两个直接在大肠杆菌基因组上进化蛋 白质的例子中，证实了本发明为有效地获得所需蛋白质突变体的方法。本发明的操作流程 如图1所示，两个例子分别为突变大肠杆菌基因组上1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶(DXS) 基因和突变大肠杆菌基因组上^因子(Rpos)基因提高大肠杆菌中产番茄红素的水平。
[0026] 实施例1，大肠杆菌基因组上突变1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶(DXS)基因
[0027] 1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶(DXS)是大肠杆菌异戊二烯合成途径中一个关键 酶，以3-磷酸-甘油醛和丙酮酸为底物合成1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸，提高其催化效率可以 增强异戊二烯代谢流，并最终提高番茄红素的产量。
[0028] 在大肠杆菌EcNR2(Harris H.Wang等?（2009)Nature.460:894_890)中引入外源基 因(3^￡，(：竹8，(^?，使得该大肠杆菌可以产番茄红素。由于番茄红素具有可见的红色，可以 根据菌落红色的深浅，高通量的筛选番茄红素产量提高的菌株。
[0029] 体外制备80-100nt dxs基因单链突变库：
[0030] 1、从大肠杆菌基因组上PCR得到dxs基因并与T载体连接，构建dxs基因的TA克隆载 体。
[0031] 2、用上引物dxs-for(SEQ ID NO. 1)和5'端磷酸化的下引物dxs_rev(SEQ ID 勵.2)两个引物以〇^8基因的了六克隆载体为模板，在添加此2+的条件下，941€458,54 1€5〇8,72 °C 2min循环30次做易错PCR，割胶纯化回收得到的双链核苷酸；
[0032] 3、以上述含有突变的双链核苷酸为模板，在PCR体系中只添加上引物dxs-for(SEQ ID NO? 1)，94°C30s，53°C30s，72°C4min循环 15次，制备得到dxs单链核苷酸；
[0033] 4、用Lambda EX0外切酶处理上述得到的PCR产物，把其中的dxs双链酶切成单链核 苷酸；
[0034] 5、乙醇沉淀上述得到的酶切产物，得到dxs单链核苷酸；
[0035] 6、用DNase頂每切上述得到的单链核苷酸，并切胶回收80-100nt的单链核苷酸片 段，构成单链突变库。
[0036]迭代同源重组进化目标蛋白质：
[0037] 1、在50mL LB培养基的摇瓶中接入从平板上挑取的大肠杆菌单菌落，并加入25yL 卡那霉素，30 °C下摇床过夜培养；
[0038] 2、转接1%的菌液至2mL LB培养基的试管中，置于30°C下摇床培养2.5-3h至0D达 到0.7左右；
[0039] 3、将试管置于42°C水浴中振荡培养15min，诱导A-Red重组蛋白充分表达；
[0040] 将试管置于冰上5min;
[0041 ] 4、取lmL菌液移入1.5mL预冷离心管中，4°C下以13000r/min离心30s，弃去上清液， 加入预冷的无菌水lml重悬洗涤，弃去上清液，并用预冷的无菌水lml重悬洗涤2次；
[0042] 5、去除上清液，并用100此预冷无菌水重悬菌体，加入80-100nt dxs单链突变库；
[0043] 6、将上述混合物转移到2mm电转杯中，在电容25yF，电压2.5kV，电阻200 Q条件下 进行电击；
[0044] 7、迅速将准备好的lml S0C培养基加入到电击杯中，轻轻吹打使细胞悬浮。将电击 杯中的混合液转移到装有lml培养基的试管中，放入30°C摇床培养，使细胞复苏；
[0045] 8、当细胞复苏到0D达到0.7左右时，重复上述步骤，进行第二轮转化。该转化过程 一共进行4轮；
[0046] 9、最后一轮电转后，复苏12h并涂板。在平板上筛选出红色较深的菌落。野生大肠 杆菌菌株(野生型〇乂5基因序列56〇10勵.3;氨基酸序列5￡〇10勵.4)及含0乂5突变体的大 肠杆菌菌株(DXS-M1，DXS-M2，DXS-M3，DXS-M4，DXS-M5，DXS突变位点总结如表1所示)产番茄 红素能力对比如图2所示。
[0047] 表1 DXS突变位点总结
[0049] 从图中可以看出，各株含有DXS突变体的大肠杆菌菌株的番茄红素积累量相对于 野生型菌株都得到了提高，幅度在50 % -300 %。
[0050] 实施例2,大肠杆菌基因组上突变〇3因子(Rpos)基因
[0051] 〇s因子(Rpos)在大肠杆菌细胞中发挥着至关重要的作用，可以应答不同环境压 力。因为番茄红素的大量积累对大肠杆菌有毒性，突变〇 s因子可以使大肠杆菌更好地适应 压力。
[0052] 体外制备80-100nt rpos基因单链突变库：
[0053] 1、从大肠杆菌基因组上PCR得到Rpos基因并与T载体连接，构建Rpos基因的TA克隆 载体。
[0054] 2、用上引物rpos-for(SEQ ID NO. 15)和5'端磷酸化的下引物rpos_rev(SEQ ID 如.16)两个引物以印〇8基因的了六克隆载体为模板，在添加血2+的条件下，941€458,54 1€ 50s，72°C 2min循环30次做易错PCR，割胶纯化回收得到的双链核苷酸；
[0055] 3、以上述含有突变的双链核苷酸为模板，在PCR体系中只添加上引物rpos-for (SEQ ID 从).15)，941€3〇8,531€3〇8,721€4111111循环15次，制备得到邝〇8单链核苷酸 ；
[0056] 4、用Lambda EX0外切酶处理上述得到的PCR产物，把其中的rpos双链酶切成单链 核苷酸；
[0057] 5、乙醇沉淀上述得到的酶切产物，得到rpos单链核苷酸；
[0058] 6、用DNase頂每切上述得到的单链核苷酸，并切胶回收80-100nt的单链核苷酸片 段，构成单链突变库。
[0059] 迭代同源重组进化目标蛋白质：
[0060] 1、在50mL LB培养基的摇瓶中接入从平板上挑取的大肠杆菌单菌落，并加入25yL 卡那霉素，30 °C下摇床过夜培养；
[0061 ] 2、转接1%的菌液至2mL LB培养基的试管中，置于30°C下摇床培养2.5-3h至0D达 到0.7左右；
[0062] 3、将试管置于42°C水浴中振荡培养15min，诱导A-Red重组蛋白充分表达;将试管 置于冰上5min;
[0063] 4、取lmL菌液移入1.5mL预冷离心管中，4°C下以13000r/min离心30s，弃去上清液， 加入预冷的无菌水lml重悬洗涤，弃去上清液，并用预冷的无菌水lml重悬洗涤2次；
[0064] 5、去除上清液，并用100此预冷无菌水重悬菌体，加入80-100nt dxs单链突变库；
[0065] 6、将上述混合物转移到2mm电转杯中，在电容25yF，电压2.5kV，电阻200 Q条件下 进行电击；
[0066] 7、迅速将准备好的lml S0C培养基加入到电击杯中，轻轻吹打使细胞悬浮。将电击 杯中的混合液转移到装有lml培养基的试管中，放入30°C摇床培养，使细胞复苏；
[0067] 8、当细胞复苏到0D达到0.7左右时，重复上述步骤，进行第二轮转化。该转化过程 一共进行6轮；
[0068] 9、最后一轮电转后，复苏12h并涂板。在平板上筛选出红色较深的菌落。野生大肠 杆菌菌株(野生型Rpos的基因序列SEQ ID N0.17;氨基酸序列SEQ ID N0.18)及含Rpos突变 体的大肠杆菌菌株(Rp〇s-Ml，Rpos-M2，Rpos突变位点总结如表2所示)产番前红素能力对比 如图2所示。
[0069] 表2 Rpos突变位点总结
[0072] 从图中可以看出，各株含有Rpos突变体的大肠杆菌菌株的番茄红素积累量相对于 野生型菌株都得到了提高，幅度分别为80 % -205 %。
[0073] 序列：
[0074] SEQ ID N0.1 上引物dxs-for
[0075] 5 '-GAGTTTTGATATTGCCAAATACCCGACCCTGGC-3 '
[0076] SEQ ID N0.2 5'端磷酸化的下引物dxs-rev
[0077] 5 ' -TTATGCCAGCCAGGCCTTGATITTG-3 '（5 ' 端磷酸化）
[0078] SEQ ID N0.3 DXS基因序列
[0080] SEQ ID N0.4 DXS氨基酸序列
【主权项】
1. 一种利用迭代同源重组体内进化目标蛋白质的新方法，其特征在于它包括以下步 骤： 构建一个80-100nt的单链核苷酸目标基因突变库，通过λ-Red同源重组技术，利用所述 突变库对大肠杆菌基因组上的蛋白质基因进行原位迭代重组，构建含有目标基因突变的大 肠杆菌突变库，达到进化酶分子结构提高酶催化效率的目的。2. 如权利要求1所述的一种利用迭代同源重组体内进化目标蛋白质的新方法，其特征 在于所述方法为在体外构建目标蛋白质基因的TA克隆载体，以此载体为模板，用error-prone PCR 制备得到带碱基突变的双链核苷酸； 以此双链为模板，单引物 PCR 制备得到带突 变的单链核苷酸；用DNase I把以上单链酶切并回收80-100nt片段构成单链核苷酸目标基 因突变库。3. 如权利要求1所述的一种利用迭代同源重组体内进化目标蛋白质的新方法，其特征 在于所述迭代的步骤为： 以得到的单链核苷酸目标基因突变库转化大肠杆菌，通过λ-Red同源重组技术建立含 有目标蛋白质突变体的大肠杆菌菌群，得到初始的含有目标基因突变的大肠杆菌突变库； 将上述单链核苷酸目标基因突变库转化初始的含有目标基因突变的大肠杆菌突变库， 得到新的含有目标基因突变的大肠杆菌突变库，形成更大库容量的大肠杆菌菌群，构建成 含有目标基因突变的大肠杆菌突变库;或者： 再用上述单链核苷酸目标基因突变库转化新形成的含有目标基因突变的大肠杆菌突 变库，得到更新后的含有目标基因突变的大肠杆菌突变库，以此不断增加含有目标基因突 变的大肠杆菌突变库的库容量，构建含有目标基因突变的大肠杆菌突变库。4. 如权利要求1所述的一种利用迭代同源重组体内进化目标蛋白质的新方法，其特征 在于所述方法通过突变大肠杆菌基因组上1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶(DXS)基因，提 高大肠杆菌产番茄红素的水平。5. 如权利要求1所述的一种利用迭代同源重组体内进化目标蛋白质的新方法，其特征 在于所述方法通过突变大肠杆菌基因组上〇s因子(Rpos)基因，提高大肠杆菌产番茄红素的 水平。6. -种DXS基因，其序列选自序列表第SEQ ID N0.5、N0.7、N0.9、N0.11、N0.13序列中的 一种。7. -种Rpos基因，其序列选自序列表第SEQ ID N0.19、N0.21序列中的一种。
【文档编号】C12N15/31GK105820990SQ201610079480
【公开日】2016年8月3日
【申请日】2016年2月4日
【发明人】徐志南, 濮悦, 黄磊, 杭宝建, 董昌, 蔡瑾
【申请人】浙江大学