GABAergic神经元条件性敲除基因PGC-1α小鼠模型及其构建方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种GABAergic神经元条件性敲除基因PGC-Ια小鼠模型及其构建方法，属于动物模型及其应用领域。
【背景技术】
[0002]过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活因子_la(peroxisom proliferator-activated receptor- γ coactivator-1, PGC-la)作为转录辅激活因子在调控线粒体的合成及线粒体内与氧代谢有关的基因表达方面起着关键的作用。转录辅激活因子PGC-Ια招募其他特异的转录因子，诱导组蛋白脱乙酰化，影响染色体结构改变并启动转录的发生(Lin J, WH., Tarr PT, Zhang CY, et al.Transcript1nal co-activator PGC-1alpha drives the format1n of slow-twitch muscle fibres.Nature, 2002, 418:797-801.)o
[0003]在周围组织，PGC-Ια以其能够诱导线粒体生物合成及抗氧化酶基因的转录而被定义为代谢调节靶点。在中枢神经系统，PGC-1a主要存在于啮齿动物出生后神经发育早期的GABAergic中间神经元(Lucas EK, Dougherty SE, McMeekin LJ, et al.PGC-1 αprovides a transcript1nal framework for synchronous neurotransmitter releasefrom parvalbumin-positive interneurons.J Neurosci, 2014.34(43): 14375-14387.)，PGC_la对于神经精神疾病的病理学机制的研究非常重要，研究发现舞蹈症病人的肌肉和脑组织中PGC-Ια蛋白表达下调，大量帕金森氏综合症及舞蹈症患者死后的尸检结果亦证明PGC-Ια蛋白表达异常，2014年，Fint课题组通过DNA测序比对了5303例中国抑郁症女性患者及5337例对照者，发现了编码线粒体能量代谢的重要基因PGC-1a的上游靶位SIRTl显著不同，该结果2015年6月在Nature上发表(Ledford H.First robust genetic linksto depress1n emerge.Nature, 2015.523: 268-269.)。焚光共聚焦结果也已经证明在整个脑组织PGC-Ια的蛋白表达与钙离子连接蛋白GABA特异性标志物小清蛋白共存(LucasEK, Dougherty SE, McMeekin LJ, et al.Developmental alterat1ns in motorcoordinat1n and medium spiny neuron markers in mice lacking PGC-Ια.Plosone, 2012.)，小清蛋白对于诱导神经元发育存活及增加抗氧化酶的活性非常重要，PGC-la作为转录辅激活因子，招募其他的转录因子形成转录复合物，调控抗氧化酶的形成，小清蛋白的基因转录，神经递质的释放及下游物质代谢相关靶位基因的转录、促进神经元的生长、发育及增加神经突触的可塑性。
[0004]PGC-la-/-基因敲除鼠的子代基因型符合孟德尔遗传定律，故PGC-1a基因并非胚胎发育必不可少的基因，然而，仅有一半子代在出生后存活并进入成年。与PGC-la+/+及PGC-1a+/—基因型相比，PGC-la-/-基因鼠出生后2个月体重降低10%-15%(Lin JD, Wu P, Tarr PT,et al.Defects in adaptive energy metabolism with CNS-1inked hyperactivity inPGC-Ια null mice.Cell, 2004.119: 121-135.)成活率下降，体重减少这些不利因素将妨碍利用PGC-la基因敲除鼠研究该基因与神经精神疾病机制的关系。条件性基因敲除(Condit1nal konckout)技术可以有效克服常规基因敲除导致的胚胎期死亡，所以PGC-la条件性敲除小鼠为研究PGC-la在特定细胞、组织和器官中的功能提供了前提条件。本实验室引进PGC-1afw+条件性基因敲除小鼠，雌雄各2只，当前的研究就PGC-lafW+x小鼠鉴定、繁殖、保种以及在GABAergic中间神经元敲除PGC-1a基因小鼠的制备进行探讨。
【发明内容】
[0005]本发明克服了现有技术中在GABAergic中间神经元敲除PGC-1a基因小鼠制备的空缺，为神经发育及神经退行性疾病的机制研究提供一个可信的动物模型及该小鼠模型的构建方法。
[0006]本发明提供Dlx5/6 Cre-1RES-EGFP; PGC-1afWfl°x基因敲除小鼠的制备、鉴定、繁殖和保种方法。
[0007]本发明提供一种GABAergic神经元条件性敲除基因PGC-1a小鼠模型。
[0008]本发明还提供一种GABAergic神经元条件性敲除基因PGC-1a小鼠模型的构建方法。
[0009]本发明还提供GABAergic神经元条件性敲除基因PGC-la小鼠模型在研究神经发育及神经退行性疾病中的应用。
[0010]为达到上述目的，本发明采取如下技术手段:
本发明选择了Dlx5a/Dlx6a作为GABAergic中间神经元发育中的启动子，利用Cre/Loxp系统成功构建了PGC-la条件性基因敲除小鼠，通过Dlx5/6启动子驱动Cre重组酶在GABAergic中间神经元特异性表达，选择性敲除GABAergic中间神经元中的PGC-1a基因，进而研究PGC-1a与神经精神疾病的关系。
[0011]本发明所述的一种GABAergic神经元条件性敲除基因PGC-1a小鼠模型的构建方法，具体包括如下步骤:
(1)选用PGC_lafl°x/+条件性基因敲除小鼠与PGC_lafl°x/+条件性基因敲除小鼠交配，保种获得纯合子PGC-1aflM/f^小鼠和杂合子PGC-1aflM/+小鼠；
(2)将繁育获得的纯合子PGC-1afWfl°x小鼠和杂合子PGC-1af w+小鼠分别与SPF级 C57BL/6J小鼠交配，迅速扩大种群，得到杂合子PGC-1af?Μ/+小鼠；
(3)选用Dlx5/6Cre—皿s—EGFP小鼠与SPF级C57BL/6J小鼠交配，获得Dlx5/6 皿s-EGFP转基因小鼠；
(4)将获得的PGC_lafl°x/+小鼠、PGC_lafl°x/fl°x小鼠分别与获得的Dlx5/6&e-1RES-egfpR基因小鼠交配，获得GABAergic神经元条件性敲除基因PGC-la小鼠模型，即全敲Dlx5/6 Cre-1RES-EGFP.PGC-1aflox/f 1ox/Jn鼠和半敲Dlx5/6 Cre-皿s-EGFP.PGC-1aflcix/+小鼠。
[0012]其中，所述步骤(1)、(2)、(3)包括进一步对所得到的小鼠利用特异性引物通过PCR方法进行基因型的鉴定。
[0013]所述步骤(I)和步骤(2)中进行基因型鉴定的引物均为:
引物8041:5 ’ -TCCAGT AGGCAGAGAITTATGAC-3 ’ 和，
引物8491:5 ’ -TGTCTGGTTTGACAATCTGCTAGGTC-3 ’。
[0014]所述步骤(3)中进行基因型鉴定为通过双重PCR筛选鉴定，所述进行基因型鉴定的引物为:
引物8041:: 5 ’ -TCCAGT AGGCAGAGAITTATGAC-3 ’ 和引物8491:5 ’ -TGTCTGGTTTGACAATCTGCTAGGTC-3 ’ ；
引物ο頂R1084:5’_ GCG GTC TGG CAG TAA AAA CTA TC-3’和引物ο頂R1085:5’_ GTG AAA CAG CAT TGC TGT CAC TT-3’。
[0015]其中，所述的Dlx5/6 Cl:e—IRES—EGFP小鼠在GABAegic中间神经元中表达Cre重组酶；Dlx5/6 &e—皿s—EGFP小鼠转入了0.5kb包含id6/id5增强子、Beta-珠蛋白增强子和增强绿色荧光融合蛋白EGFP片段。
[0016]本发明的有益效果:
(I)小鼠只有在表达Cre重组酶的GABAergic的中间神经元才能敲除基因PGC-la，基因型为Dlx5/6 IRES—EeFP;PGC_lafl°x/fl°x，在没有Cre表达的其他组织细胞中该基因型仍然为PGC-1aflox7flox，因此本发明实现了GABAergic的中间神经元特异性敲除PGC-1 a，避免了PGC-1a全敲除造成的存活率下降、体重减低等缺点。
[0017](2)PGC_la的基因敲除鼠将为神经发育及神经退行性疾病的机制研究提供一个可信的动物模型，与PGC_la+/+及PGC_la+/-基因型相比，PGC-la-鼠出生后2个月体重降低10%-15%，这些不利因素将限制研究该基因与神经精神疾病的关系;然而，本发明的条件性基因敲除技术可以有效克服上述缺点。本发明选择了Dlx5a/Dlx6a作为GABAergic中间神经元发育中的启动子，利用Cre/Loxp系统成功构建了PGC-Ια条件性基因敲除小鼠，通过Dlx5/6启动子驱动Cre重组酶在GABAergic中间神经元特异性表达，选择性敲除GABAergic中间神经元中的PGC-1a基因，进而研究PGC-1a与神经精神疾病的关系。因此，PGC-1a条件性基因敲除小鼠将具有广阔的应用前景。
[0018](3)条件性基因敲除小鼠的交配比较繁琐，不同交配方式获得组织细胞特异性基因敲除小鼠所需的时间，耗费的精力不同，由于从美国引进的条件性敲除小鼠为杂合子，本发明为了快速获得足够数量的在GABAergic中间神经元中敲除PGC-1a基因的小鼠，一方面利用PGC_lafl°x/+与PGC_lafl°x/+交配保种获得纯合子PGC-1aflQx/fl°x，另一方面利用PGC-1afW+与C57BL/6J交配来迅速扩大种群，得到更多的杂合子PGC-lafW+，当获得较多数量的PGC_lafl°x/+及PGC-1aflQx/fl°x后，通过与Dlx5/6 Gre—IRES—EGFP小鼠交配获得大量的全敲Dlx5/6Cie—IRES—EGFP;PGC-1aflQx/fl°x和半敲Dlx5/6 Gie—IRES—EGFP;PGC_lafl°x/+小鼠，这种交配方式的优点是即可以迅速扩大种群，节省时间精力，又可以获取杂合子敲除小鼠，从而可以检测杂合子敲除小鼠是否有表型。如果杂合子没有表型，可以通过杂合子半敲小鼠Dlx5/6 Cre-1RES-EGFP.PGC-lafl°x/+之间的杂交得到更多的纯合子全敲小鼠Dlx5/6
杂合子有表型，则最好用杂合子半敲小鼠作为对照，可以研究杂合子小鼠的表型究竟是Cre引起还是该基因本身的生理功能，从而更加准确的证明该基因的功能以及基因剂量与基因功能的关系。
【附图说明】
[0019]图1:引进PGC-1afw+小鼠PCR基因鉴定结果，图中泳道1、2、5、6为鉴定的四只效果的结果，泳道3、4、7、8为对照组小鼠结果，M为DNA分子标记Marker ；
图2:PGC-1afW+小鼠的扩增、保种示意图； 图3:繁育扩增获得PGC-1af Wfl°x及PGC-1af w+小鼠PCR基因鉴定结果，图中泳道1、2、
3、4、6为PGC-lafl°x/+、PGC_lafl°x/fl°x小鼠分别与C57BL/6J小鼠交配所得子代小鼠基因型鉴定结果，泳道5和7为对照、不加模板的扩增结果，M为DNA分子标记Marker ；
图4:繁育扩增获得Dlx5/6 &e-1RES-egfpR基因小鼠荧光显微镜鉴定；
图5:繁育扩增获得Dlx5/6 &e—IRES—EGFP转基因小鼠PCR基因鉴定结果，图中泳道1-5为所鉴定小鼠的结果，M为DNA分子标记Marker ；；
图6: Dlx5/6 Cre—IRES—EGFP;PGC-lafl°x/fklx，Dlx5/6 Cre—IRES—EGFP;PGC-1aflcix/+小鼠的繁殖示意图；
图7:Dlx5/6 Cre—IRES—EGFP;PGC-laflox/flox，Dlx5/6 Cre—IRES—EGFP;PGC_laflcix/+小鼠的基因鉴定结果，图中泳道1-6为所鉴定小鼠的结果，最右边泳道为DNA分子标记Marker。
【具体实施方式】
[0020]为更好的理解本发明，下面通过具体实施例和附图进一步进行说明。
[0021]实施例1:条件性基因敲除小鼠的引进及饲养 1.1实验动物
PGC-1af—/+条件性基因敲除小鼠，品系名称B6.129-PpargcI