专利名称：一种激酶蛋白Akt1基因条件性敲除小鼠的建立及用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及转基因技术领域，更具体地涉及一种激酶蛋白Aktl基因条件性敲除动物模型的建立和用途。
背景技术：
Akt/蛋白激酶B (PKB)属于AGC激酶家族(包括PKA，PKG以及H(C)中的一个亚家族-Akt/PKB家族。在哺乳类生物如小鼠，大鼠和人，Akt/PKB家族包含三个成员分别称为Aktl/PKB α，Akt2/PKB β和Akt3/PKB γ (以下通用Akt)。Akt在基因的表达调控、细胞生存和凋亡中发挥着重要作用，与肿瘤的发生发展、胚胎发育等过程均密切相关。在人和小鼠中，这三个成员由位于不同染色体上的三个基因所编码。Akt的三个蛋白在氨基酸组成上有很高的同源性，达80%以上。在氨基酸数量组成上，它们只相差一到两个氨基酸，Aktl有480个氨基酸，Akt2有481个氨基酸，而Akt3有479个氨基酸。它们都有三个功能区域，分别是氨基端PH区域，中间激酶催化区域和羧基端调控区域。它们的激酶催化区域在氨基酸组成上几乎是一样的。由于双基因敲除小鼠(Aktl/3)死于胚胎发育第12天，所以我们将无法研究晚期胚胎(12天之后)重要器官的发育及糖代谢的调控。因此，我们制作了 Aktl基因条件性基因敲除小鼠，通过不同Cre重组酶介导的方法在胚胎发育的不同时期及成年期敲除所有三个Akt基因，研究它们对小鼠胚胎发育及糖代谢的调控。
发明内容
本发明旨在提供一种激酶蛋白Aktl基因条件性敲除动物模型。本发明的另一个目的是提供上述激酶蛋白Aktl基因条件性敲除动物模型的用途。在本发明的第一方面，提供了一种产生激酶蛋白Aktl基因条件性敲除非人哺乳动物模型的方法，它包括步骤a)提供一种线性化的基因打靶载体构建物，该构建物从5’到3’依次含有Aktl打靶左臂、正选择基因、自杀负筛选基因、Akt 1打靶右臂；b)通过体外转染胚胎干细胞(ES细胞)、筛选与打靶载体发生同源重组的阳性ES 细胞克隆，经显微注射技术导入非人哺乳动物囊胚中；C)将步骤b得到的囊胚植入假孕的非人哺乳动物的子宫；d)产生激酶蛋白Aktl基因条件性敲除非人哺乳动物模型。在另一优选例中，还包括步骤e)对步骤d获得的Aktl基因条件性敲除动物进行鉴定。在另一优选例中，还包括步骤f)使获得的激酶蛋白Aktl基因条件性敲除动物进行交配建系，获得子代。在另一优选例中，所述的正选择基因是Neo、hph、或gpt。
在另一优选例中，所述的自杀负筛选基因是HSV-tk、胞嘧啶脱氨酶基因、或 VIV-tko在另一优选例中，所述的非人哺乳动物模型是小鼠、大鼠、兔或猴。在另一优选例中，所述的转基因构建物基因敲除外显子。在另一优选例中，所述的转基因构建物不含启动子。在另一优选例中，所产生的激酶蛋白Aktl编码第58位至480位氨基酸缺失的非人哺乳动物在本发明的第二方面，提供了一种用上述方法产生的激酶蛋白Aktl基因条件性敲除非人哺乳动物模型。在本发明的第三方面，提供了一种用上述方法产生的激酶蛋白Aktl基因条件性敲除非人哺乳动物模型的用途，所述的动物模型可用于筛选预防或者治疗心脏和糖代谢紊舌L。在本发明的第四方面，提供了一种激酶蛋白Aktl基因条件性敲除小鼠的用途，它可用于筛选治疗心脏肥大和糖代谢紊乱的药物。在另一优选例中，可以将激酶蛋白Aktl及其所在的上、下游信号转导通路作为治疗心脏肥大和糖代谢紊乱的药物干预靶点。据此，本发明提供了一种激酶蛋白Aktl基因条件性敲除模型，有效地揭示了其在高等哺乳动物中的生物学功能，并由此提供了激酶蛋白Aktl基因条件性敲除动物模型及其用途。
图1是激酶蛋白Aktl打靶载体构建策略示意图。图2显示了激酶蛋Aktl基因条件性敲除ES细胞基因型Southern blot (DNA印记杂交)鉴定；其中B5、B10、D6、F2、F6、F10为杂合子基因型，表示该ES细胞为基因敲除杂合子。图3通过Mespl-cre介导的心脏特异性敲除小鼠的敲除效率的flfestern blot (蛋白免疫印记)鉴定。
图4 Aktl和Akt2基因联合敲除小鼠的心脏切片苏木素-伊红染色照片。 具体实施方案发明人经过广泛而深入的研究，建立了激酶蛋白Aktl基因条件性敲除小鼠模型， 并通过Southern blot (DNA印记杂交)和^festern blot (蛋白免疫印记)进行了鉴定。激酶蛋白Aktl基因条件性敲除动物模型的建立本发明通过本领域成熟的基因打靶技术建立了激酶蛋白Aktl基因条件性敲除动物模型，可用于本发明的负筛选自杀基因没有特别的限制，可以选用本领域常规使用的各种自杀基因。代表性的例子包括(但并不限于)hsv-tk、胞嘧啶脱氨酶(⑶)、VIV_tk等。可用于本发明的正选择基因没有特别限制，可以选用本领域常规使用的各种正选择基因。代表性的例子包括(但并不限于)Ne0、hph、gpt等。本发明利用FLP重组酶将正选择基因Neo最终从基因组中去除，避免其对小鼠表型的可能影响。
激酶蛋白Aktl基因条件性敲除动物模型本发明所建立的激酶蛋白Aktl基因条件性敲除动物模型中所敲除的可以使其基因组结构中的任一段外显子，优选敲除编码激酶蛋白Aktl第58位至480位氨基酸的外显子。本发明的激酶蛋白Aktl基因条件性敲除基因长度可以是1-201Λ，优选3-61Λ，更优选3-41Λ。激酶蛋白Aktl基因条件性敲除动物模型的用途本发明提供的激酶蛋白Aktl基因条件性敲除动物显示了部分心脏发育缺陷。通过和Akt其他异构体敲除小鼠进行联合敲除的研究，表明Akt在心脏发育中是必不可少的。本发明的一个优选例中，利用该模型筛选预防或者治疗心脏肥大的化合物，方法如下1)在测试组中，给激酶蛋白Aktl和Akt2联合敲除的动物模型服用待筛选的候选物，并检测心脏肥大情况；2)若步骤(1)测试组中心脏肥大程度的改善在统计学上高于(更优选明显高于) 对照组(未服用候选物组)中心脏肥大程度的改善情况，就表明该候选物是可抑制心脏肥大的化合物。本发明揭示了激酶蛋白Aktl的生物学功能，在本发明的一个优选例中提供了一种制备预防或者治疗心脏肥大和糖代谢紊乱的药物的方法，就是加入治疗有效量的激酶蛋白Aktl及药学上可接受的载体。可以制成各种剂型，包括(但不限于)片剂、胶囊、注射剂等。本发明的主要优点在于1.首次建立了激酶蛋白Aktl基因敲除动物；2.首次运用该模型揭示了激酶蛋白Aktl基因在非人哺乳动物中的生物学功能， 可以将激酶蛋白及其上下游生物传导通路作为药物治疗心脏肥大和糖代谢的作用靶点；3.运用该模型有效地进行针对性的药物筛选。下面将结合具体是实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则所有的百分比和分数按重量计。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。实施例1建立激酶Aktl蛋白基因条件性敲除模型1.通过构建基因打靶载体，见图1 ；2.将上述载体转染胚胎肝细胞(EQ，通过Southern印记杂交筛选同源重组的ES 细胞克隆，见图2;3.将步骤( 获得的同源重组的ES细胞进行囊胚注射后、植入假孕小鼠子宫，待子鼠出生后得到嵌合小鼠；
4.嵌合鼠进一步交配后得到激酶蛋白Aktl的基因敲除小鼠。实施例2激酶蛋白Aktl基因敲除小鼠心脏肥大模型的建立实施例1获得的Aktl基因缺陷小鼠出生时无明显异常，Aktl和Akt2基因联合敲除小鼠在出生后1个月时全部死亡；与野生型对照小鼠相比，Aktl和Akt2基因联合敲除小鼠的心脏心肌壁明显变薄，心肌结构疏松，右心室扩张(图4)，提示Aktl和Akt2基因联合敲除小鼠可以作为舒张性心脏肥大的模型。以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并非用于限定本发明的实质技术内容范围，本发明的实质技术内容是广义地定义于申请的权利要求范围中，任何让人完成的技术实体或方法，若是与申请的权利要求范围所定义的完全相同，也或是一种等效的变更，均将被视为涵盖于该权利要求范围之中。
权利要求
1.一种产生激酶蛋白Aktl基因敲除非人哺乳动物模型的方法，其特征在于，它包括步骤a.提供一线性化的基因打靶载体构建物，该构建物从5’至3’依次含有Aktl打靶左臂、正选择基因、自杀负筛选基因、Aktl打靶右臂；b.通过体外转染胚胎干细胞(ES细胞)、筛选与打靶载体发生同源重组的阳性ES细胞克隆，经显微注射技术导入非人哺乳动物囊胚中；c.将囊胚植入假孕的非人哺乳动物子宫内；d.产生激酶蛋白Aktl基因敲除非人哺乳动物模型。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的正选择基因是Neo、hph、或者gpt。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的自杀负筛选基因是HSV-tk、细胞嘧啶脱氨酶基因、或者Viv-tk。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的非人动物是小鼠、大鼠、兔或猴。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的转基因构建物基因剔除外显子。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，产生的激酶蛋白Aktl编码第58位至480位氨基酸缺失的非人哺乳动物。
7.一种用权利要求1-5中任一项所述的方法产生的生的激酶蛋白Aktl基因敲除非人哺乳动物模型。
8.一种用权利要求1-5中任一项所述的方法产生的激酶蛋白Aktl基因敲除非人哺乳动物模型的用途，其特征在于，所述的动物模型用于筛选预防或者治疗心脏肥大和糖代谢紊乱的药物。
9.一种激酶蛋白Aktl的用途，其特征在于，用于制备预防或者治疗心脏肥大和糖代谢紊乱的药物。
全文摘要
本发明公开了一种激酶蛋白Akt1基因敲除非人哺乳动物模型的制备方法及其应用。本发明还公开了利用所述的激酶蛋白Akt1基因敲除非人哺乳动物模型筛选预防或者治疗心脏肥大和糖代谢紊乱的化合物的方法，以及将Akt1及其所在上、下游生物信号转导通路作为药物干预靶点治疗心脏肥大和糖代谢紊乱的用途。
文档编号C12N15/09GK102477421SQ20101055681
公开日2012年5月30日 申请日期2010年11月24日 优先权日2010年11月24日
发明者卢双双, 常在, 杨中州 申请人:南京大学